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Summary

In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato per l’esposizione di specie del genere Drosophila agli inquinanti con l’obiettivo di studiare l’impatto dell’esposizione su una gamma di uscite fenotipiche alle varie fasi di sviluppo e per più di una generazione.

Abstract

Proprietà emergenti e fattori esterni (interazioni livello di popolazione e a livello di ecosistema, in particolare) svolgono i ruoli importanti nel mediare gli endpoint ecologicamente importanti, anche se raramente sono considerati negli studi tossicologici. D. melanogaster sta emergendo come un modello di tossicologia per gli effetti comportamentali, neurologici e genetici di sostanze tossiche, per citarne alcuni. Ancora più importante, può essere utilizzato specie del genere Drosophila come sistema modello per un approccio integrativo framework incorporare le proprietà emergenti e rispondere a domande ecologicamente rilevanti nella ricerca di tossicologia. Lo scopo di questa carta è quello di fornire un protocollo per l’esposizione di specie del genere Drosophila agli inquinanti da utilizzarsi come sistema modello per una gamma di uscite fenotipiche e domande ecologicamente rilevanti. Più specificamente, questo protocollo può essere usato per 1) collegare più livelli biologici di organizzazione e comprendere l’impatto delle sostanze tossiche su entrambi fitness a livello individuale e della popolazione; 2) verificare l’impatto delle sostanze tossiche nelle diverse fasi di esposizione inerente allo sviluppo; 3) prova implicazioni multigenerazionale ed evolutivi di inquinanti; e 4) test di contaminanti e fattori di stress multipli contemporaneamente.

Introduction

Ogni anno, circa 1.000 nuovi prodotti chimici vengono introdotti dalla industria chimica^1,2; Tuttavia, l’impatto ambientale di solo una piccola percentuale di questi prodotti chimici è testato prima della distribuzione^2,3. Anche se catastrofi su larga scala sono rare, esposizione subletale e cronica per una grande varietà di sostanze inquinanti sono diffuse in entrambi esseri umani e animali selvatici^4,5. Al centro storico di ecotossicologia e tossicologia ambientale era quello di testare la letalità, singola esposizione chimica, l’esposizione acuta e gli effetti fisiologici dell’esposizione, come un mezzo per misurare l’impatto degli inquinanti sulla sopravvivenza^{6, 7 , 8 , 9 , 10}. anche se c’è uno spostamento verso approcci etici e non invasiva alla sperimentazione animale, approcci attuali stanno limitando a causa del ruolo che lo sviluppo, proprietà emergenti e fattori esterni (ad esempio livello di popolazione e interazioni a livello di ecosistema) giocano nella mediazione ecologicamente importante endpoint⁸. Di conseguenza, c’è una necessità per i metodi che includono un approccio più olistico senza sacrificare la fauna selvatica e/o vertebrati in laboratorio.

Sistemi di modello invertebrati marini, come Drosophila melanogaster, sono un’alternativa interessante per affrontare la necessità di un approccio più olistico per test di tossicità. D. melanogaster, è stato originariamente sviluppato come un sistema di modello invertebrati marini per la ricerca genetica umani circa un secolo fa¹¹. D. melanogaster prominente è ora utilizzato come alternativa modello vertebrati per diversi motivi: 1) la conservazione di geni e percorsi tra d. melanogaster e gli esseri umani; 2) tempo di generazione breve rispetto ai modelli vertebrati; 3) economico costo di manutenzione; 4) alleviare nella generazione di campioni di grandi dimensioni; e 5) pletora di fenotipica ed ecologicamente-rilevanti endpoint disponibili per il test^{11,12,13,14,15,16,17} .

Diversi laboratori^{11,15,16,17,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25} ora stanno usando d. melanogaster come alternativa modello vertebrati per test di tossicità per comprendere gli effetti dell’inquinamento sugli esseri umani. Specie selvatiche locali di Drosophila può essere utilizzato, anche, come modelli di tossicità per la fauna selvatica (e gli esseri umani) rispondere a ecologicamente-, relativamente al comportamento-ed evolutivamente pertinenti domande a più livelli biologici di organizzazione. Utilizzando specie del genere Drosophila come modello, diversi endpoint misurabili sono possibili^{11,15,16,18,19,20 ,21,22,23,24,25}. Inoltre, utilizzando il modello di Drosophila , tossicologi possono: 1) eticamente collegare effetti a più livelli biologici dell’organizzazione; 2) incorporare il ruolo dei fattori emergenti e lo sviluppo; 3) studio endpoint ecologicamente importanti (oltre agli endpoint medicamente importanti); 4) verificare fattori di stress multipli contemporaneamente; 5) e prova a lungo termine multigenerazionale (ad es. evolutiva e transgenerazionale) implicazioni di fattori di stress. Pertanto, utilizzando la Drosophila come sistema modello consente una moltitudine di approcci, non limitato a studiare approcci meccanicistici con ceppi inbred di d. melanogaster nel laboratorio.

In questa carta, presentiamo i metodi di allevamento e raccolta della drosofila per rispondere a varie domande tossicologiche. Più specificamente, descriviamo la metodologia per 1) allevamento Drosophila in mezzo cucita con uno o più inquinanti; 2) raccogliendo Drosophila durante lo sviluppo (ad es. errante terza-instar larve, pupal casi, appena obtecta adulti e adulti maturi); e 3) l’allevamento della drosofila in medio contaminato e prova intergenerazionale e trasmissione transgenerazionale, come pure le implicazioni evolutive esposizione tossico a lungo termine. Utilizzando questo protocollo, il precedente autori^{18,19,20,21,22,23,24,25} sono segnalati diversi effetti fisiologici, genetici e comportamentali di sviluppo (Pb^{2 +}) esposizione al piombo. Questo protocollo consente tossicologi di utilizzare un approccio più olistico e tossicologico, che è essenziale per comprendere come gli agenti inquinanti sono fattori di rischio per gli esseri umani e animali selvatici in un ambiente sempre più inquinato.

Protocol

Il seguente protocollo è un protocollo sperimentale utilizzato per posteriore specie del genere Drosophila su supporto contaminato quando l’ingestione orale di una tossina è appropriata; altre forme di esposizione sono possibili utilizzando la drosofila modello11,15,16,26. I metodi descritti nel presente protocollo precedentemente sono stati descritti da Hirsch et al. 19 e Peterson et al. 23 , 24 , 25. 1. impostare Stock popolazioni di Drosophila nel laboratorio di ricerca Impostare un incubatore di controllo ambientale (o piccola camera) alle popolazioni stock house di Drosophila impostando le incubatrici per una temperatura costante, ciclo luce: buio e umidità, a seconda delle preferenze della specie in esame.Nota: Comodo condizioni ambientali variano dipendendo il nativo ecologia della specie scelto per lo studio. Ad esempio, d. melanogaster è originaria dell’Africa sub-sahariana Africa27 e in genere viene mantenuta a 25 ° C, 12:12 ciclo di luce: buio e circa 60% umidità16,18,19,20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 28 , 29 , 30. d’altra parte, p. montana gamma si estende in gran parte del Canada e negli Stati Uniti midwest, una regione molto più freddo; di conseguenza, p. montana è in genere mantenuta a 19 – 20 ° C e, talvolta, un regime di luce 24h per simulare condizioni durante la stagione degli amori31. Per una descrizione più dettagliata delle gamme geografiche di varie specie di Drosophila, vedere il sito Web modelli di speciazione di Drosophila 32. Ottenere un comodo specie di Drosophila e/o la linea inbred da entrambi un centro stock (Vedi tabella materiali), un altro laboratorio di ricerca su richiesta, o Raccogli selvatici, popolazioni geneticamente variabile dal campo.Nota: La procedura seguente spiega i metodi per raccogliere le popolazioni selvatiche, geneticamente variabile della drosofila per mantenere nel laboratorio di ricerca. Questi metodi sono stati modificati da Markow e o ‘ Grady33 e Werner e Jaenike34 per raccogliere la massima diversità di specie in una volta, piuttosto che di specie particolare di destinazione con uno fonte di esca. Congelare una mezza dozzina banane mature nel freezer durante la notte e scongelare prima di tendere trappole esca. Preparare più L 1 – 2 bottiglie di plastica dal taglio di una fessura a forma di u nella parte anteriore la bottiglia per consentire mosche essere catturati nella bottiglia di esca e non fuggire. Tappo delle bottiglie di plastica con il loro tappo di bottiglia quindi le mosche non sfuggono via i coperchi. Aggiungere la banana decongelata al fondo delle bottiglie in modo che il fondo delle bottiglie contiene circa un pollice di banana. Mettete una fetta di pomodoro maturo in bottiglia. Aggiungere un impasto di lievito (il lievito rimasto dal processo di fabbricazione di birra) alla banana nella parte inferiore della bottiglia in modo che la banana ottiene in ammollo i residui di lievito. Aggiungere bastoni di legno (in posizione verticale verticale) alla bottiglia così le mosche hanno un substrato pulito ad allontanarsi sull’impasto di lievito e banana.La figura 1 illustra il prodotto finale di questi metodi. Appendere esca bottiglie in alberi durante la notte e controllare che ogni aspirato di bocca di 24 h. vola fuori bottiglie e posizionare singolarmente le femmine in fiale con il mezzo per creare linee di iso-donna.Nota: Linee multi-femminili possono essere create, tuttavia, solo se le femmine di ogni specie possono essere chiaramente identificate. Inoltre, mosche del genere Drosophila occupano nicchie ecologiche diverse e avranno diverse esigenze dietetiche dipendendo quelle nicchie (Werner e Jaenike34); vedere Werner e Jaenike34 per dieta consigli e ricette di cucina. Esaminare i figli adulti di1 F sotto il microscopio di dissezione per identificare la specie dei raccolti della drosofila (Vedi Markow e o ‘ Grady33 e Werner e Jaenike34 per assistenza nell’identificazione delle varie specie ). Figura 1 : Rappresentazione pittorica di esche e utilizzato per raccogliere le popolazioni selvatiche di Drosophila nel campo. (A) Fly trappole insieme in un sito di campo locale in Colorado. (B) una vista ingrandita del fly trappole insieme a questo sito di campo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Mantenere la iso-femmina o le linee multi-femminile in un incubatore di controllo ambientale o una stanza con temperatura costante, ciclo luce: buio e l’umidità. Per effettuare questa operazione, casa Vola in fiale o flaconi in preferito medio e lasciano le femmine gravide depongono le uova nel mezzo. Monitorare le fiale per la presenza di larve e pupe.Nota: Mosche del genere Drosophila occupano nicchie ecologiche diverse e avranno diverse esigenze dietetiche e ambientali abiotiche preferenze dipendendo quelle nicchie33,34. Preferenze ambientali e raccomandazioni dietetiche (e ulteriori istruzioni su allevamento Vola) possono essere trovati in Elgin e Miller28, Shaffer et al. 29, stocker e Gallant30, Markow e o ‘ Grady33e Werner e Jaenike34. Se utilizzando specie catturati, le condizioni ambientali locali possono essere simulate in incubatrici fino a quando la specie può essere identificata. Trasferire le scorte frequentemente a mezzo fresco, scartando vecchie fiale, per mantenere sani linee ed evitare l’infezione da acari.Nota: La frequenza di trasferimento dipenderà il ciclo di vita della specie. Ad esempio, trasferire Drosophila melanogaster ogni 2 settimane a mezzo fresco. Per ulteriori informazioni sul mantenimento di linee in laboratorio, vedere Rand et al. 16, Elgin e Miller28, Shaffer et al. 36di Database 29, stocker e Gallant30, Greenspan35e scienze della formazione. 2. posteriore della drosofila nel terreno contaminato Nota: Se il test della drosofila in laboratorio per la prima volta o con un nuovo contaminant(s), identificare la dose letale (Vedi Castaneda et al. 37 e Massie et al. 38 per i metodi) e la DL50 (vedere Castaneda et al. 37 e Akins et al. 39 per metodi) prima. Quindi, eseguire una curva dose-risposta per identificare concentrazioni biologicamente rilevanti per l’output desiderato fenotipica; vedere Hirsch et al. 19 e Zhou et al. 40 per i metodi. Preparare soluzioni di riserva del mezzo contaminato presso la concentrazione desiderata, dipendendo la chimica del contaminante.Nota: ad esempio, per preparare soluzioni di riserva di PbAc: preparare soluzioni di riserva di acetato di piombo (PbAc) medio aggiungendo contaminante di acqua distillata (dH20) fino al medio realizzato con contaminanti dell’acqua raggiunge la concentrazione desiderata. Ad esempio, una soluzione stock di 1.000 µM PbAc, può essere preparata aggiungendo PbAc al dH20 fino a 1.000 µM PbAc. Diluire la soluzione stock (ad es. il 1.000 µM PbAc soluzione) fino alla concentrazione desiderata (ad esempio 500 µM PbAc) e mantenere queste soluzioni come magazzino pure. Preparare il supporto, le linee guida del produttore riportato per servire come mezzo di controllo. Preparare ulteriore supporto, le linee guida del produttore riportato; Tuttavia, supplemento contaminante soluzione preparata per dH20.Nota: ad esempio, se si utilizza un istante media della drosofila , aggiungere circa un cucchiaino da tè istantaneo medio ad un flacone di plastica. Aggiungere circa 5 – 5.5 mL dH20 al mezzo. Cospargere alcuni grani di lievito vivo per preparare il supporto di controllo. Per preparare il supporto sperimentale, integrare la soluzione di riserva (ad esempio 500 µM PbAc) per dH20. Trasferire riproduttivo praticabile maturi maschi e femmine da popolazioni stock nel controllo e il supporto sperimentale.Nota: Il post-eclosion tempo per la maturità riproduttiva è diversa tra le specie di Drosophila 41. Picchiettare delicatamente il flaconcino di mosche stock giù con la mano dominante. Garantire che le mosche si sposta automaticamente sul fondo del flaconcino. Con l’altra mano, togliere il tappo del flaconcino mentre toccando il flaconcino e collocare un fresco flacone di controllo o contaminato medio sopra la fiala con le mosche. Tenere le fiale insieme e capovolgerli sopra, picchiettando delicatamente, in modo che le mosche sono trasferite automaticamente al flaconcino fresco di controllo o contaminato medio. Mentre ancora toccando il flaconcino con le mosche, tappo del flaconcino. Ripetere con più fiale, assicurandosi di standardizzare il numero di mosche in ogni flaconcino.Nota: Il numero totale di adulti trasferiti tramite trasferimento singolo o anestesia dipenderà la dimensione delle fiale utilizzate per evitare il sovraffollamento. Incubare gli adulti in condizioni ambientali standard (cioè un’incubatrice) e consentono agli adulti di accoppiarsi e deporre le uova nel mezzo per 24 – 96 h. Dopo 24 – 96 h, scartare gli adulti in un obitorio (un pallone riempito con olio minerale e tappate con un imbuto attillati) lasciando dietro di sé fecondato uova (che diventano in seguito i soggetti dell’esperimento) di maturare per il test. Posizionare le fiale nell’incubatrice per consentire le uova a sviluppare. Monitorare le fiale per larve instar vagando alla ricerca di larve che stanno emergendo dal mezzo. 3. raccogliere soggetti sperimentali nelle varie fasi dello sviluppo Nota: I soggetti sperimentali possono essere raccolti in qualsiasi fase dello sviluppo, nel cieche codificate provette coniche da 15 mL e testato per accumulo. Metodi per testare l’accumulo di contaminanti dipenderà il contaminante in fase di studio. Ad esempio, accumulo di PbAc possa essere testato utilizzando la spettrometria di massa di Inductively-Coupled al Plasma (ICP-MS)42. Inoltre, i soggetti sperimentali possono essere raccolti in qualsiasi fase inerente allo sviluppo per essere testati per una varietà di effetti fenotipici di contaminanti. La figura 2 illustra il ciclo di vita di Drosophila 43. La figura 3 illustra il protocollo sperimentale per l’esposizione e le varie fasi di sviluppo per la raccolta. Figura 2 : Panoramica sui concettuale di ciclo di vita di d. melanogaster (il sistema più comunemente usato di modello drosofila ). Le fasi del ciclo di vita di Drosophila sono: 1) uovo, larva 2) primo-instar, 3) seconda-instar larva, 4) terza-instar larva, 5) vagando terza-instar larva, pupa 6) occhialino, pupa 7) l’effetto occhi rossi, 8) appena obtecta adulto e adulto 9) maturo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3 : Panoramica concettuale dei metodi per esporre oralmente Drosophila a medie contaminate parentale (F0) sia le generazioni successive (F1 e successivi). (A) metodi per esposizione orale durante lo sviluppo della generazione esposta. (B) metodi per testare il trasferimento di contaminanti alla prole (F.1 per la generazione desiderata). Questa figura è stata modificata da Peterson et al. 24 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Raccogliere larve instar terzo errante Avviare il monitoraggio fiale quando luci accendono nell’incubatrice, come le larve si emergono dal mezzo e spostare verso l’alto sul lato del flacone all’interno di un h dopo le luci si accendono nell’incubatrice. All’interno di questo h, rimuovere le larve di terza vagando instar dai lati del flaconcino con cura utilizzando un bastone di legno o delle pinzette.Nota: Il numero di larve disponibile per raccolta dipenderà il numero di uova deposte in “2.3.4”. Per rimuovere il mezzo in eccesso dalle larve, posto le larve in un piccolo becher con dH2O. Pour la dH2O fuori il becher e posto le larve su un tergicristallo delicato compito. Utilizzando un pulitore delicato compito, rimuovere delicatamente l’eccesso di dH2O dalle larve. Mantenere popolazioni sperimentali in un’incubatrice di controllo ambientale. Raccogliere gli adulti recentemente-obtecta Fiale di monitor per eclosion osservando la colorazione delle pupe lungo i lati delle fiale.Nota: Pupe scurirà durante lo sviluppo. Tempo inerente allo sviluppo, in particolare pre-eclosion, dipende dalla specie testate. Quando i primi adulti iniziano a eclose, dump e scartare questi adulti in una camera mortuaria contenente olio minerale. Quando le luci si accendono nell’incubatrice la mattina seguente, dump e scartare qualsiasi adulti di età sconosciuta (o verginità) che possono avere obtecta durante la notte o durante le luci morningbefore su. Circa 4 ore più tardi, anestetizzare qualsiasi adulti che è emerso come nuova-obtecta adulti con una pistola di CO2 nei flaconcini. Adulti posto su un piatto di2 CO sotto un microscopio di dissezione. Adulti sesso cercando sesso pettini sulle zampe anteriori dei maschi e ovipositors nelle femmine.Nota: D. melanogaster devono essere raccolte entro 6 h di sfarfallamento per evitare accoppiamento ma altre specie può avere tempi più lunghi dello sviluppo (e di conseguenza, non è necessario essere raccolte entro questo lasso di tempo). Separare gli adulti sulla CO2 piastra utilizzando un bastone di legno. Trasferire delicatamente adulti in gruppi di sesso-specifici utilizzando un bastone di legno per la storia pre-esistente corrispondente media. Raccogliere gli adulti maturi Eclosion post-della Consentire a rimanere sull’esposizione media corrispondente pre-eclosion dalla fase di uovo al post-eclosion età desiderata in un’incubatrice di controllo ambientale. Trasferire singolarmente gli adulti per il mezzo di controllo per 24 h prima del test per consentire gli adulti per lo sposo di eccesso di terreno contaminato i loro corpi. 4. posteriore soggetti sperimentali per testare gli effetti di Multigenerational o esposizione transgenerazionale. Per il posteriore la generazione parentale (aka il P0 o F0 generazioni), transfer adulti da stock popolazioni di controllo e il supporto sperimentale secondo la procedura descritta in “2.1” a “2.3” e “3.1” a “3.3”. Quando gli adulti sono riproduttivo maturi (vedere Pitnick et al. 41), singolarmente un flaconcino di trasferimento (come indicato in 2.3.1) dei maschi ad un fresco flacone di controllo o medio sperimentale. Trasferire singolarmente un flaconcino di femmine al fresco flacone che ora contiene i maschi. Consentono agli adulti di mate e deporre le uova nel mezzo per 24-96 h. Dump e scartare gli adulti in un obitorio contenenti olio minerale e ri-Incubare fiale per consentire la prole a sviluppare. Ripetere i punti 4.1 e 4.2 a seconda il numero desiderato di generazioni.

Representative Results

Di esporre oralmente Drosophila a un contaminant(s) durante lo sviluppo, possono essere testate varie domande tossicologiche esponendo Drosophila a diversi livelli di organizzazione biologica. Questa sezione presenta risultati rappresentativi ottenuti usando questo protocollo in articoli precedentemente pubblicati23,24. In particolare, questo protocollo è stato utilizzato in precedenza per valutare l’accumulo, e…

Discussion

Drosophila melanogaster è stato stabilito come un potente modello per una gamma di processi biologici a causa la conservazione ricca di geni e percorsi tra d. melanogaster e gli esseri umani^13,14. Per le stesse ragioni che è un potente modello di scienza medica, Drosophila è emerso come un sistema di modello adatto per studiare l’impatto dell’inquinamento di origine antropica su una gamma di endpoint tossicologici. Diversi laboratori…

Materials

Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24	Carolina Biological	173204
Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit	Genessee Scientific	32-116SB	Used to store flies
Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials	Genessee Scientific	49-102	Used to store flies
Cardboard trays, trays only, narrow	Genessee Scientific	32-124	Used to organize populations of flies
Cardboard trays, dividers only, narrow	Genessee Scientific	32-126	Used to organize populations of flies
Thermo Scientific Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure	Fischer Scientific	03-312D	Useful for storage of contaminants
Thermo Scientific Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles	Fischer Scientific	03-409-17C	Useful for storage of contaminants
Eppendorf Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser	Fischer Scientific	14-287-150	Used to prepare medium
Combitips Advanced Pipetter Tips – Standard, Eppendorf Quality Tips	Fischer Scientific	13-683-708	Used to prepare medium
Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm)	Genessee Scientific	59-114	Used to anesthetize flies
Flystuff foot valve	Genessee Scientific	59-121	Used to anesthetize flies
Tubing, green (1 continguous foot/unit)	Genessee Scientific	59-124G	Used to anesthetize flies
Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle	VWR	97064-130	Used to make a morgue
Glass Erlenmeyer Flask Set – 3 Sizes – 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2	Walmart	Not applicable	Used to make a morgue
BGSET5 Glass Beaker Set Of 5	Walmart
Inbred or wildtype line of Drosophila	Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University		https://bdsc.indiana.edu
Wild popultions of Drosophila	UC San Diego Drosophila Stock Center		https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php