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Articolo metodologico

Assemblaggio e purificazione del prototipo Virus schiumoso Intasomes

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⸱

DOI:

10.3791/57453

⸱

19 marzo 2018

 ,  , 
1Department of Cancer Biology and Genetics, The Ohio State University College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Integrasi retrovirale recombinante e oligomeri del DNA che imita le estremità del DNA virale possono formare un complesso enzimaticamente attivo conosciuto come un intasome. Intasomes possono essere utilizzati per studi biochimici, strutturali e cinetici. Questo protocollo i dettagli di come assemblare e purificare prototipo schiumoso virus intasomes.

Abstract

A definire funzionalità e necessario passaggio del ciclo di vita di retrovirus è l'integrazione del genoma virale nel genoma ospite. Tutti i retrovirus codificare un enzima integrasi (IN) che catalizza l'Unione covalente di virale all'host del DNA, che è conosciuto come trasferimento di filo. Integrazione può essere modellato in vitro con ricombinante IN retrovirali e oligomeri di DNA che imita le estremità del genoma virale. Per ricapitolare maggiormente la reazione di integrazione che si verifica in vivo, integrazione complessi sono assemblati da ricombinante IN e oligomeri sintetici da dialisi in un buffer di ridotta concentrazione di sale. L'integrazione complessa, detta un intasome, può essere purificato da cromatografia di esclusione di formato. Nel caso di virus schiumoso del prototipo (PFV), il intasome è un tetramero di IN e due DNA oligomeri e prontamente è separato dal IN monomerico e gratuito oligomero del DNA. L'efficienza di integrazione di PFV intasomes può essere dosato con una varietà di condizioni sperimentali per meglio comprendere le dinamiche e la meccanica dell'integrazione retrovirale.

Introduzione

Integrazione del genoma virale nel genoma ospite è un passaggio obbligatorio nel ciclo di vita di tutti i retrovirus1. L'enzima virale dell'integrasi (IN) catalizza l'Unione covalente di ciascuna estremità del genoma del DNA virale per l'host del DNA. Durante un'infezione cellulare, fa parte di un complesso di pre-integrazione che media integrazione IN. Ricombinante IN complessato con oligomeri del DNA incagliati doppi che imita le estremità del DNA virale può anche eseguire l'integrazione in una destinazione del DNA in vitro2. Una comune integrazione test in vitro utilizza un plasmide supercoiled il DNA dell'obiettivo. Integrazione di entrambi oligomeri del DNA virali (vDNA) per il plasmide si traduce in un prodotto lineare e viene definito integrazione concertata (Figura 2A). L'integrazione test in vitro può anche produrre prodotti con un solo vDNA covalentemente unita al plasmide di destinazione risultante in un cerchio rilassato. Questo prodotto di integrazione del metà-sito sembra essere un manufatto del analisi in vitro.

Ricombinante IN e vDNA possono effettuare integrazione in vitro, ma non sono i reagenti ideali per lo studio delle dinamiche o la struttura dei complessi di integrazione quando IN monomerico oscurerebbero visualizzazione pertinenti. Sono necessari per gli studi strutturali o analisi dinamica singola molecola purificata integrazione complessi, o "intasomes,". PFV IN e vDNAs possono essere assemblati da dialisi da un buffer relativamente alta concentrazione di sale a una bassa concentrazione di sale3,4. Durante la dialisi, un precipitato forme. Questo precipitato è rimosso dalla dialisi e la concentrazione di sale è aumentata. La concentrazione di sale superiore solubilizza il precipitato contenente PFV intasomes. La intasomes quindi sono purificati mediante cromatografia di esclusione di formato (SEC). Ricombinante prototipo virus schiumoso (PFV) IN ha dimostrato di esistere come un monomero in soluzione a concentrazioni fino a 225 µM5. Frazionamento di SEC separa efficacemente il intasomes PFV (225,5 kDa), che comprende un tetramero di PFV IN e due vDNAs, da monomerico PFV IN (44,4 kDa) e gratuito vDNA (24.0 kDa). Il intasomes PFV possono essere congelati e mantenere attività di integrazione per almeno sei mesi di conservazione a-80 ° c.

Ricombinante PFV intasomes possono anche essere modificate per includere IN sostituzioni dell'amminoacido o mutazioni di troncamento o vDNAs etichettato con fluorofori o biotina4,6. Il intasomes PFV purificata eseguire prontamente l'integrazione in un target di plasmide supercoiled DNA in vitro. Saggi biochimici integrazione alla rinfusa con intasomes possono testare gli effetti delle mutazioni, IN inibitori o altri additivi chimici. Biotinilati intasomes può essere utilizzato per sondare affinità con acidi nucleici o proteine. PFV intasomes sono funzionali a temperatura ambiente, permettendo per analisi di microscopia di singola molecola di pinzette magnetiche per misurare il tempo tra la giunzione dei due vDNA punte o fluorescenza di riflessione interna totale per visualizzare la ricerca di intasome sul bersaglio DNA6. Inoltre, PFV intasomes sono stati i primi ad essere strutturalmente caratterizzato impattare significativamente il campo di integrazione retrovirale3.

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Protocollo

1. ricottura di vDNA

  1. Unire 1 X dieci Buffer (10 X dieci stock: 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, NaCl di 1m, 10mm EDTA), 10 µM 1 Oligo (ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3' 5', 100 µM stock) e 10 µM 2 Oligo (CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3' 5', 100 µM stock) in un volume finale di 1,5 mL . Aliquotare e 25 µ l in sessanta provette di reazione a catena (PCR) 0,2 mL della polimerasi.
    Nota: A seconda dell'applicazione, oligomeri possono essere modificati con fluorofori o tag alle estremità 5'-di Oligo 2 o come un ammino-T interno base 13 dall'estremità 5' di Oligo 1. Oligomeri modificati dovrebbero essere purificati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) prima di ricottura. Abbiamo trovato che 5'-fine Cy3 o Cy5 fluoroforo etichettatura di Oligo 2 riduce l'efficienza di assemblaggio intasome 10 volte. Interno fluoroforo etichettatura non riduce efficienza di assemblaggio.
  2. Tempri utilizzando un termociclatore con i seguenti orari e temperature: 1 ciclo a 94,0 ˚ c 3 min, 99 cicli a (94,0 ˚ c 1 min, 93,6 ˚ c 1 min) diminuendo entrambe le temperature di 0,8 ° c per ciclo (l'ultimo ciclo è 14,8 ˚ c 1 min, 14,4 ˚ c 1 min) e conservare a 4.0 ˚ c.
  3. Combinare le reazioni ricottura da sessanta tutte le provette. Caricare 500 µ l a due 0,5 mL 3 kDa peso molecolare cutoff (MWCO) filtro ultracentrifughe unità di concentrazione. Concentrare il ricotto vDNA mediante centrifugazione in una microcentrifuga a 14.000 x g per 10 min a temperatura ambiente (TA).
    Nota: Il volume di retentato dovrebbe essere ~ 50 µ l in ogni unità di concentrazione.
  4. Scartare il flusso attraverso. Aggiungere 250 µ l del restante vDNA ricotto ad ogni unità filtrante. Ripetere lo spin e scartare il flusso attraverso. Tampone di cambio in buffer di TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) da lavare tre volte con 450 µ l TE.
  5. Invertire l'unità filtro e spin a 1.000 x g per 2 minuti a TA. Il volume finale retentato per ogni unità di filtro dovrebbe essere ~ 50 µ l. combinare il materiale e trasferirlo in una provetta di 1,5 mL tappo a vite.
  6. Misurare l'assorbanza 260 nm (UV) ultravioletto della vDNA. Utilizzare questo valore per calcolare la concentrazione molare finale di DNA. Il coefficiente di estinzione (ε260) di questo vDNA è 622.803 cm-1 M-1 e il suo peso molecolare è 23.972 procuratore. Conservare a-20 ˚ c.

2. Intasome Assembly

  1. Se possibile, eseguire il montaggio di intasome in una piccola stanza con un termostato regolabile. Regolare il termostato a circa 18-22 ° c.
    Nota: Nella nostra esperienza, Assemblea di intasome a 4 ˚ c è inefficiente.
  2. Preparare 1 L di tampone di dialisi (20mm propano Bis-tris, pH 7.5, 200 mM NaCl, 2mm ditiotreitolo (DTT), 25 µM ZnCl2) in un becher da 2 L con un ancoretta su una piastra stir. Equilibrare il buffer in camera 18-22 ° c per almeno 6 ore.
  3. Per assemblare il intasomes, combinare propano 50 mM Bis-tris, pH 7.5, 500 mM NaCl, 120 µM IN PFV e 50 µM vDNA in un volume totale di 150 µ l.
    Nota: Il PFV IN dovrebbe essere libero di contaminare nucleasi attività7,8. Se la concentrazione di PFV IN è troppo diluita per ospitare 120 µM IN 150 µ l di volume, quindi è possibile aumentare il volume finale a 200 µ l. I fattori critici di questo passaggio sono di mantenere il rapporto molare di IN a vDNA (2,4: 1) e di avere abbastanza complesso da visualizzare durante la cromatografia.
  4. Pulire un ~ 10 cm e lungo pezzo di tubazione di 10 mm 6-8 kDa MWCO dialisi e clip con doppia acqua distillata (ddH2O), o l'acqua di purezza più alto disponibile. Agganciare un'estremità del tubo.
    Nota: Tubi di dialisi devono essere maneggiato con cura per evitare qualsiasi possibile contaminazione dallo spazio lab.
  5. Fare 15 mL di buffer di risciacquo di tubatura di dialisi (propano 50 mM Bis-tris, pH 7.5, 500 mM NaCl). Sciacquare l'interno del tubo di dialisi tre volte con 1-2 mL di tampone di risciacquo. Rimuovere la maggior quantità di buffer di risciacquo come possibile con una pipetta e gel sottile punta di carico.
  6. Se necessario, utilizzare una lama di rasoio pulito o bisturi per tagliare i tubi di dialisi affinché una punta di gel sottile carico raggiunga l'estremità del tubo.
  7. Trasferire l'assembly intasome dal passaggio 2.3 alla tubazione di dialisi con una pipetta e un sottile punta di caricamento del gel. Agganciare l'estremità aperta del tubo di dialisi, riducendo al minimo la quantità di aria immessa all'interno del tubo. Inserire il tubo nel buffer di dialisi.
  8. Dializzare pernottamento (16-20 h) con dolce mescolando in modo che il tubo ruota ma non è in un vortice. Assicurarsi che la tubazione di dialisi sia sommersa e mobile. Dopo circa un'ora, osservare un precipitato visibile all'interno delle tubazioni.
    Nota: Con Cy3 o Cy5 fluorescente etichettati vDNA, il precipitato è più evidente. Questo è vero sia per fine etichettati e internamente con etichetta fluorescente vDNA.

3. Intasome solubilizzazione

  1. Preparare due ampio foro puntali rimuovendo 2-4 mm dall'estremità di una punta di 200 µ l con una lama di rasoio o bisturi nuova su una superficie pulita.
    Nota: I suggerimenti serviranno al punto 3.3 e 3.5.
  2. Rimuovere il tubo di dialisi dal buffer di dialisi. Al fine di evitare la diluizione del campione intasome con buffer di dialisi che potrebbe rimanere all'estremità della tubazione vicino la clip, utilizzare una micropipetta con un piccolo puntale per rimuovere qualsiasi buffer di dialisi in eccesso. Rimuovere la clip da un'estremità del tubo di dialisi.
  3. Uso un ampio foro punta della pipetta dal punto 3.1 per trasferire il campione tra cui il precipitato all'interno dei tubi di dialisi in una provetta da 1,5 mL sul ghiaccio. Nota il volume totale del materiale recuperato; il volume totale è in genere ~ 140 µ l.
  4. Il campione con precipitato è a 200mm NaCl; aumentare il sale ad una concentrazione finale di 320 mM NaCl aggiungendo il volume appropriato di una soluzione di NaCl 5m stock. Ad esempio, per un campione di 150 µ l, µ l 3,9 5m NaCl e 1,1 µ l ddH2O per un volume finale di 155 µ l. trasferimento ice bucket con campione in una stanza fredda 4 ˚ c.
  5. Uso un ampio foro punta della pipetta dal punto 3.1 per risospendere e solubilizzare il precipitato di pipettaggio. Ripetere ogni 20 min per almeno 1 h. nota che la maggior parte del precipitato dovrebbe entrare in soluzione.
    Nota: Pipettaggio per risospendere il precipitato può essere interrotto quando è evidente che il precipitato non più notevolmente è ridotta tra i punti di tempo. Quando vDNA non è etichettato o internamente con l'etichetta, il precipitato è ridotto di ~ 90% basato su ispezione visiva. Nel caso di Cy5 fine etichettato vDNA, il precipitato è ridotta solo del ~ 20%; la maggior parte del precipitato con fluoroforo fine etichettato vDNA non si solubilizzano. La quantità di precipitato che effettivamente viene solubilizzato è variabile e deve essere determinata empiricamente.

4. Intasome purificazione

  1. Preparare 250 mL di cromatografia di esclusione di formato (SEC) in esecuzione di tampone (propano 20 mM Bis-tris, pH 7.5, 320 mM NaCl, 10% glicerolo). Filtro sterile il buffer con un-0,2 µm unità filtro e conservare a 4 ° c.
    Nota: Tutte le fasi di depurazione vengono eseguite in una stanza fredda 4 ˚ c.
  2. Equilibrare una colonna di agarosio reticolato SEC (diametro = 10 mm; lunghezza = 300mm; volume del letto = 24 mL; volume del campione = 25-500 µ l; pressione massima = 1,5 MPa; limite di esclusione = 4 x 107 Da; separa pesi molecolari tra 5.000 e 5 kDa, vedere la della stuoia di tabella erials) con il buffer in esecuzione SEC ad una portata di 0,4 mL/min.
    Nota: Questa purificazione può essere adattata alle colonne di esclusione di formato differente, se essi sono in grado di separare in maniera efficace 300 kDa da 44 kDa, come Superose 12 10/300 GL o aumentare la Superose 6. Superose 12 10/300 GL ha una risoluzione inferiore, portando a più sovrapposizione dei picchi. Al contrario, aumentare la Superose 6 ha una risoluzione superiore e offre la migliore separazione.
  3. Centrifugare il campione di intasome in un microfuge a 14.000 x g per 10 min a 4 ˚ c a pellet qualsiasi precipitato rimanente. Rimuovere con cautela il supernatante. Caricare il surnatante di un ciclo di iniezione di 200 µ l (tubazione che può contenere ~ 200 μL). Applicare il campione alla colonna SEC.
    Nota: Più piccoli volumi di carico consentono una maggiore risoluzione di SEC.
  4. Eluire con 25 mL SEC in esecuzione nel buffer e raccogliere 95 frazioni di 270 µ l. osservare che il cromatogramma SEC Visualizza picchi di260 A280/A tre (Figura 1).
    Nota: Il primo dovrebbe essere una funzione di aggregazione (~9.0 - eluizione 11,5 mL), seguita dal PFV tetramero intasome peak (~12.0 - eluizione 14,75 mL) e il monomero IN PFV con libero vDNA peak (~15.0 - 18,0 mL).

5. integrazione Strand Transfer Assay, frazione selezione e archiviazione

  1. Combinare 2 µ l di ciascuna frazione di picco di intasome e 50 ng 3 kb supercoiled DNA plasmidico (concentrazione stock è 50 ng / µ l) in tampone di reazione (propano 10 mM Bis-tris, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 µM ZnCl2, 10 mM DTT) in un volume di reazione finale di 15 µ l. Incubare a 37 ° c per 5 min.
  2. Includere un controllo negativo con nessun intasome PFV aggiunto. Interrompere la reazione con proteinasi di 0,75 µ l K (20 mg/mL di soluzione madre) e 0,75 µ l SDS (10% soluzione di riserva). Incubare a 55 ˚ c 1 h. esempi di Store come necessario a-20 ˚ c per successive analisi.
    Nota: Questo test è una valutazione qualitativa delle attività di integrazione. La concentrazione molare di intasome di ciascuna frazione non è determinata prima di questo test. Le frazioni incluse nell'analisi di trasferimento di filo della integrazione possono essere memorizzate su ghiaccio (anche notturno) fino a integrazione attività è confermata e frazioni selezionate sono aliquotate. Qui usiamo pMP2, un derivato di pUC199. Abbiamo utilizzato con successo anche il 5,4 kb plasmide pcDNA 3.1. Ogni plasmide che può essere risolto in rilassato cerchio, lineare, e forme supercoiled possono essere utilizzate come destinazione per l'integrazione.
  3. Preparare un peso di 1% 120 mL per gel di agarosio di volume (p/v) in 1x tampone TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) con 0,1 μg/mL etidio bromuro (EtBr, 10 mg/mL di soluzione madre)10. Sciogliere la soluzione di agarosio e versarlo in un vassoio di colata di gel 15 x 10 cm. Inserire un pettine 15-pozzo con 5 mm largo, 0,75 mm spessore pozzi.
    Nota: Più stretti pozzi resa migliore risoluzione di banda rispetto ai pozzi spessore 1,5 mm.
  4. Lasciare che il gel a solidificare a temperatura ambiente. Immergere il gel in 1 X TAE con EtBr 0,1 μg/mL.
  5. Aggiungere glicerolo al 50% 3 µ l per ogni reazione di integrazione dal punto 5.2. Caricare il volume intero reazione al gel. Caricare 1 µ l di marcatore del DNA (concentrazione stock di 150 ng / µ l) della dimensione di 10 kb a corsie su entrambi i lati dei campioni; in altre parole, il marcatore del DNA dovrebbe fiancheggiano le corsie di campione.
  6. In una corsia esterna, caricare tintura di 6 µ l Orange G (0,25% arancia G, 30% glicerolo). Esegua il gel a tensione costante, 10 V/cm (100 V) a temperatura ambiente per 1 h, o fino a quando la parte anteriore della tintura di Orange G raggiunge la fine del gel.
  7. Immediatamente l'immagine del gel dell'agarosi con uno scanner fluorescente impostato per rilevare EtBr (532 nm di eccitazione, filtro di emissione 610 nm). Se fluoroforo etichettato vDNAs sono stato usato, anche immagine con le impostazioni appropriate fluoroforo.
    Nota: ad esempio, per rilevare Cy5 DNA, immagine utilizzando eccitazione di 633 nanometro e 670 nm emissione filtri contrassegnato. Prodotti di integrazione concertata (CI, DNA lineare) deve essere eseguito con taglia standard ~ 3 kb, non reagito plasmide supercoiled (SC) dovrebbe più veloce (~ 2 kb), e prodotti di metà-sito integrazione (HSI, rilassato cerchio DNA) va più lento (~3.5 kb). Non reagito vDNA deve essere eseguito con taglia standard ~ 40 bp.
  8. Quantificare le bande in ogni corsia con imaging software7. Calcolare la frazione di DNA in ogni corsia che è CI, HSI o SC; vDNA non è incluso in questo calcolo.
    Nota: L'efficienza di integrazione, o la frazione di SC convertito in un prodotto lineare, è stata calcolata dividendo il volume di pixel di prodotti di integrazione concertata (CI) per il volume totale di pixel di tre bande (HSI + CI + SC). Se intasomes sono fluoroforo etichettato, i prodotti HSI e CI possono anche quantificati dalla fluorescenza.
  9. Selezionare le frazioni che presentano l'attività di integrazione più concertata.
    Nota: Nella nostra esperienza, l'attività di integrazione di picco concertata coincide con il picco di proteina identificato come tetramerica PFV intasomes. A280 di ciascuna di queste frazioni di misurare e calcolare la concentrazione finale intasome. La ε280 per un tetramero di tipo selvaggio PFV IN con due vDNAs descritto qui è 908.339 cm-1M-1 e il peso molecolare è 225.5 kDa. Le concentrazioni devono seguire il modello stesso come il picco del cromatogramma SEC e nell'analisi di trasferimento della strand.
  10. Ogni frazione in aliquote di 5 µ l di distribuire e far scattare congelamento in azoto liquido. Conservare le aliquote a-80 ° c. Le frazioni selezionate per la conservazione sono in genere tra 200-600 nM.

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Risultati

PFV intasomes vengono assemblati dalle ricombinante IN e vDNA. Dopo l'assemblaggio, intasomes sono purificati dalla SEC (Figura 1). Attività di integrazione di ogni frazione è analizzata con un supercoiled destinazione e agarosio gel elettroforesi del DNA (Figura 2). Questo gel è imaged con uno scanner fluorescente impostato per rilevare EtBr (e fluoroforo, se viene utilizzato il fluoroforo vDNA). Utilizzando software di analisi ...

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Discussione

Retrovirali INs formano un complesso con il DNA di genomic virale per eseguire l'integrazione e continuare il ciclo di vita virale multimerico. Il numero di nei monomeri per intasome può essere tetrameri, octamers o possibilmente più alto ordine multimeri11,12,13,14. PFV intasomes sono un tetramero di ricombinante con oligomeri di DNA double-stranded che imitano DNA genomic virale finisce

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da NIH AI099854 e AI126742 a chiave.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Oligomeridi DNA IDTN/AOligo di DNA personalizzati
Tris Ultra PureGojira Fine ChemicalsUTS1003
NaClP212121RP-S23020
UltraPure EDTAInvitrogen/Gibco15575
Filtri centrifughi Amicon Ultra 0,5 mL Sigma-AldrichZ677094-24EA3 kDa MWCO
DTTP212121SV-DTT
BIS-TRIS propano,>=99,0% (titolazione)Sigma-AldrichB6755-500G
ZnCl2Sigma-Aldrich208086
MgSO4Amresco0662
GlycerolThermo Fisher ScientificG37-20
Punte per il caricamento del gel, 1 - 200 μ LCorningCLS4853-400EA Lama di
rasoio; A taglio singolo; 100/confezione; Confezione da 100Fisher Scientific12-640
con membrana PES > 250 mlThermo Fisher Scientific568-0020
Clip per tubi per dialisiSpectrum Labs132734
6-8 kDa 10 mm Tubo per dialisiSpectrum Medical132645
Superose 6 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences17517201
Hi-Res Standard AgarosioAGTC BioproductsAG500D1
Bromuro di etidioThermo Fisher ScientificBP1302
Orange GFisher Scientific0-267
Hyladder 10kb, 500 corsieDenville ScientificCB4225-4
unità filtranti monouso sterili

Riferimenti

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