Integrasi retrovirale recombinante e oligomeri del DNA che imita le estremità del DNA virale possono formare un complesso enzimaticamente attivo conosciuto come un intasome. Intasomes possono essere utilizzati per studi biochimici, strutturali e cinetici. Questo protocollo i dettagli di come assemblare e purificare prototipo schiumoso virus intasomes.
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Articolo metodologico
Assemblaggio e purificazione del prototipo Virus schiumoso Intasomes
In questo articolo
Sommario
Abstract
A definire funzionalità e necessario passaggio del ciclo di vita di retrovirus è l'integrazione del genoma virale nel genoma ospite. Tutti i retrovirus codificare un enzima integrasi (IN) che catalizza l'Unione covalente di virale all'host del DNA, che è conosciuto come trasferimento di filo. Integrazione può essere modellato in vitro con ricombinante IN retrovirali e oligomeri di DNA che imita le estremità del genoma virale. Per ricapitolare maggiormente la reazione di integrazione che si verifica in vivo, integrazione complessi sono assemblati da ricombinante IN e oligomeri sintetici da dialisi in un buffer di ridotta concentrazione di sale. L'integrazione complessa, detta un intasome, può essere purificato da cromatografia di esclusione di formato. Nel caso di virus schiumoso del prototipo (PFV), il intasome è un tetramero di IN e due DNA oligomeri e prontamente è separato dal IN monomerico e gratuito oligomero del DNA. L'efficienza di integrazione di PFV intasomes può essere dosato con una varietà di condizioni sperimentali per meglio comprendere le dinamiche e la meccanica dell'integrazione retrovirale.
Introduzione
Integrazione del genoma virale nel genoma ospite è un passaggio obbligatorio nel ciclo di vita di tutti i retrovirus1. L'enzima virale dell'integrasi (IN) catalizza l'Unione covalente di ciascuna estremità del genoma del DNA virale per l'host del DNA. Durante un'infezione cellulare, fa parte di un complesso di pre-integrazione che media integrazione IN. Ricombinante IN complessato con oligomeri del DNA incagliati doppi che imita le estremità del DNA virale può anche eseguire l'integrazione in una destinazione del DNA in vitro2. Una comune integrazione test in vitro utilizza un plasmide supercoiled il DN....
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Protocollo
1. ricottura di vDNA
- Unire 1 X dieci Buffer (10 X dieci stock: 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, NaCl di 1m, 10mm EDTA), 10 µM 1 Oligo (ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3' 5', 100 µM stock) e 10 µM 2 Oligo (CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3' 5', 100 µM stock) in un volume finale di 1,5 mL . Aliquotare e 25 µ l in sessanta provette di reazione a catena (PCR) 0,2 mL della polimerasi.
Nota: A seconda dell'applicazione, oligomeri possono essere modificati con fluorofori o tag alle estremità 5'-di Oligo 2 o come un ammino-T interno base 13 dall'estremità 5' di Oligo 1. Oligomeri modificati dovrebbero essere purificati mediante cromatografia liquida ad al....
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Risultati
PFV intasomes vengono assemblati dalle ricombinante IN e vDNA. Dopo l'assemblaggio, intasomes sono purificati dalla SEC (Figura 1). Attività di integrazione di ogni frazione è analizzata con un supercoiled destinazione e agarosio gel elettroforesi del DNA (Figura 2). Questo gel è imaged con uno scanner fluorescente impostato per rilevare EtBr (e fluoroforo, se viene utilizzato il fluoroforo vDNA). Utilizzando software di analisi .......
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Discussione
Retrovirali INs formano un complesso con il DNA di genomic virale per eseguire l'integrazione e continuare il ciclo di vita virale multimerico. Il numero di nei monomeri per intasome può essere tetrameri, octamers o possibilmente più alto ordine multimeri11,12,13,14. PFV intasomes sono un tetramero di ricombinante con oligomeri di DNA double-stranded che imitano DNA genomic virale finisce
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da NIH AI099854 e AI126742 a chiave.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Oligomeri | di DNA IDT | N/A | Oligo di DNA personalizzati |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Filtri centrifughi Amicon Ultra 0,5 mL Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propano,>=99,0% (titolazione) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Punte per il caricamento del gel, 1 - 200 μ L | Corning | CLS4853-400EA Lama di | |
| rasoio; A taglio singolo; 100/confezione; Confezione da 100 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| con membrana PES > 250 ml | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Clip per tubi per dialisi | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Tubo per dialisi | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarosio | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Bromuro di etidio | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 corsie | Denville Scientific | CB4225-4 |
Riferimenti
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, ....
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Ristampe e permessi
