La determinazione della specificità della proteasi nel Mouse tessuto estratti mediante spettrometria di massa MALDI-TOF: manipolazione di PH per causare i cambiamenti di specificità

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per determinare la specificità di proteasi in tessuto grezzo del mouse estratti usando spettrometria MALDI-TOF.

Abstract

Proteasi hanno diverse funzioni biologiche, tra cui la digestione della proteina di attivazione/inattivazione e cibo. Identificazione della proteasi specificità è importante per rivelare la funzione di proteasi. Il metodo proposto in questo studio determina la specificità della proteasi misurando il peso molecolare dell'unici substrati utilizzando Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization spettrometria di massa di tempo di volo (MALDI-TOF). I substrati contengono iminobiotin, mentre il sito fenduto è composto da aminoacidi, e il distanziatore è costituito da polietilene glicole. Il substrato fenduto genererà un unico peso molecolare usando un aminoacido spaccato. Uno dei meriti di questo metodo è che può essere effettuata in una pentola utilizzando campioni di greggi, ed è anche adatto per valutare campioni multipli. In questo articolo, descriviamo un metodo sperimentale semplice ottimizzato con campioni estratti dal tessuto polmonare di topo, compresa l'estrazione del tessuto, inserimento di substrati digestivi in campioni, purificazione dei substrati digestivi in condizioni di pH diversi e la misurazione del peso molecolare dei substrati utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF. In sintesi, questa tecnica consente l'identificazione della specificità di proteasi in campioni grezzi derivati da estratti di tessuto mediante spettrometria di massa MALDI-TOF, che facilmente può essere scalata per elaborazione di campione più.

Introduzione

Proteasi regolano processi fisiologici fendendo proteine, e l'avvio di attività di proteasi a orari specifici e posizioni è regolato¹. Pertanto è importante per identificare l'espressione e l'attività dei tessuti che sono regolate localmente e per sviluppare un nuovo metodo per rilevare le proteasi. Il metodo proposto questo studio mira a identificare le specificità di proteasi in parallelo al rilevamento di proteasi.

Ci sono alcuni metodi per la rilevazione di specificità di proteasi. Il metodo azocaseina è ben noto per il suo utilizzo nella rilevazione di proteasi² ma è limitato nella sua capacità di ottenere ulteriori informazioni. Zymography è un altro metodo di rilevamento di proteasi completa che può essere utilizzato per determinare il peso molecolare di proteasi³, ma non può essere utilizzato per esaminare la specificità di substrato. Specificità della proteasi può essere determinato dalle analisi spettrometriche, utilizzando substrati quali p-nitroanilide⁴e le analisi fluorometriche, utilizzando substrati di cumarina⁵ o fluorescenza Resonance Energy Transfer (FRET) saggi⁶. Questi metodi consentono la rilevazione di singolo-specificità dei substrati contenute in un singolo pozzo. Nello studio presente, la specificità di proteasi di estratti di tessuto viene esaminata in varie condizioni, come questi estratti contengono proteasi multiple. L'attività della proteasi è regolata da diversi fattori, tra cui pH, coenzimi, gruppi prostetici e resistenza dello ione. Recentemente, metodi basati sulla proteomica sono state usate per identificare la specificità della proteasi; ad esempio, il metodo riportato da Biniossek et al. ⁷ utilizza il proteoma per determinare la specificità di substrato anche in estratti grezzi e consente la determinazione accurata dell'attività delle proteasi che riconoscono più dell'amminoacido sequenze⁸clivaggio. Tuttavia, questo metodo non è adatto per l'analisi di numerosi campioni. Al contrario, il nostro metodo consente l'elaborazione simultanea di più campioni e l'uso di Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) spettrometria di massa per l'analisi facilita la rilevazione rapida e facile della spaccati substrati.

Questa carta descrive un metodo per valutare la specificità della proteasi mediante spettrometria di massa MALDI-TOF per misurare il peso molecolare di substrati unici. Le forme molecolari di substrati spaccati, insieme al loro peso molecolare teorico, sono mostrate in Figura 1 e tabella 1. Gli studi precedenti hanno usato substrati contenenti polyglycine distanziali e biotina⁹; Tuttavia, questi substrati sono viziati perché la sequenza di polyglycine può essere clivata da enzimi che riconoscono la sequenza di glicina. Inoltre, l'alta affinità tra avidina e la biotina può portare a un tasso basso di recupero. Per migliorare questi inconvenienti, in questo studio che abbiamo sintetizzato un substrato unico, che era composta di polietilenglicole (PEG), iminobiotin e un aminoacido che potrebbe identificare il sito di clivaggio (Figura 1). Per discriminare tra amminoacidi di simili pesi molecolari, D-serina è stato aggiunto tra il distanziale di PEG e dell'aminoacido nel sito spaccati.

il N-terminale del substrato è stato etichettato con iminobiotin, che permette la purificazione di affinità da campioni di greggi. L'uso di iminobiotin invece di biotina è critico; la biotina ha una forte affinità con avidina, che si traduce in tassi di recupero basso di biotina substrati da resina avidina, mentre affinità di iminobiotin per avidina può essere alterato da pH. Iminobiotin-etichettati substrati legheranno per avidina in condizioni sopra pH 9, mentre avidina rilascia iminobiotin-etichettati substrati in condizioni sotto pH 4. Pertanto, iminobiotin è stato usato per la purificazione di affinità¹⁰. In breve, descriviamo un protocollo dettagliato per la rilevazione di specificità di proteasi utilizzando substrati unici.

Protocollo

Protocolli sperimentali animali erano approvati dal comitato etico dell'Università Nihon Pharmaceutical ed eseguiti in conformità con le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio dell'Università Nihon Pharmaceutical. Il protocollo è stato regolato per estratti di tessuto derivati da topi ICR. Topi ICR sono stati acquistati da Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Giappone)

1. preparazione del substrato con etichetta Iminobiotin

Il substrato subisce sintesi in fase solida utilizzando gruppo 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-protetti aminoacidi come descritto di seguito¹¹. Utilizzare la tabella 2 per determinare il Fmoc-composto utilizzato, a seconda del desiderato dell'aminoacido e la fase di sintesi.

1. Broda 0,2 g di resina Fmoc-NH-SAL con 10 mL di N, N-dimetilformammide (DMF) in una colonna di sintesi.
2. Aggiungere 5 mL di 30% piperidina in DMF. La soluzione per 10 min a fendere Fmoc-gruppo della roccia.
3. Verifica Fmoc scissione con l'acido trinitrobenzenesulfonic (TNBS) prova¹²: aggiungere 10 µ l di 1% TNBS in DMF e 10 µ l di diisopropylethylamine (DIPEA) per un tubo di vetro 10 x 75 mm² , poi trasferire una piccola quantità di resina al vetro tubo. La resina Fmoc-spaccati dovrebbe sviluppare un colore arancione.
   1. Ripetere i passaggi da 1.2-1.3 Se questo risultato è negativo.
4. Lavare la resina tre volte con 5 mL di DMF.
5. Aggiungere 5 mL di DMF contenenti 0,3 mmol di Fmoc-composto elencati nella tabella 2 (a partire con il composto utilizzato nella fase 1), 0,3 mmol di Esafluorofosfato di O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium (HCTU), 0,3 mmol di 1- Idrossi-1h-benzotriazolo, monoidrato (HOBt) e 0,6 mmol di diisopropylethylamine (DIPEA). La soluzione per 30 min per abbinarlo con la resina della roccia.
   1. Controllare questo passaggio con il test TNBS. Se il risultato è positivo, questo significa che la reazione non è sufficientemente progredita e questo passaggio deve essere ripetuto.
6. Lavare la resina tre volte con 5 mL di DMF.
7. Ripetere la reazione di allungamento ripetendo i punti 1.2-1.6, cambiando il Fmoc-composto utilizzato nel passaggio 1.5 secondo la tabella 2.
8. Aggiungere 1 mL di acqua di 2,5%, 1% triisopropylsilane (TIS) e 2,5% etanditiolo (EDT) in acido trifluoroacetico fendere peptidi dai gruppi di resina e protezione. Roccia la soluzione per 60 min.
9. Filtrare e raccogliere il filtrato in un tubo da 50 mL.
10. Aggiungere 40 mL di etanolo freddo etilico e store durante la notte a-20 ° C.
11. Centrifugare a 4.000 x g a-20 ° C per 30 min. raccogliere il pellet.
12. Utilizzare un essiccatore per 3 h per eliminare l'etere etilico.
13. Aggiungere 1 mL di acetonitrile 50% acqua e sciogliere i peptidi grezzi. Lyophilize la soluzione per rimuovere l'acido trifluoroacetico. Ripetere questa operazione più volte.
14. Purificare i peptidi utilizzando una colonna di cartuccia C18.
    1. Attivare la resina nella colonna Cartuccia C18 con 3 mL di acetonitrile (ACN).
    2. Equilibrare con 5 mL di ACN di 5%, 0,1% TFA in H₂O.
    3. Caricare i greggi peptidi sintetici nella colonna Cartuccia C18.
    4. Lavare con 10 mL di ACN di 5%, 0,1% TFA in H₂O.
    5. Eluire i campioni con 3 mL di 60% ACN, 0,1% TFA in H₂O.
15. Controllare i peptidi misurando il loro peso molecolare mediante spettrometria di massa MALDI-TOF.
    1. Pipettare 1 µ l di eluente su una zolla di destinazione. Aggiungere immediatamente la soluzione satura di α-ciano-4-idrossicinnamico acido (CHCA) in 50% acetonitrile in 0,1% acido trifluoroacetico
    2. Cristallizzare la miscela di essiccamento ad aria.
    3. Acquisire spettri di massa dei campioni secondo il protocollo del produttore dello strumento.
       1. Impostare manualmente lo spettrometro di massa MALDI-TOF ad un positivo riflettono modalità.
       2. Calibrare lo spettrometro di massa utilizzando CHCA, bradichinina frammento 1-7 (peso molecolare monoisotopic = Da 756.3997) e dell'angiotensina II (peso molecolare monoisotopic = Da 1,045.5423).
       3. Acquisire spettri di massa dei peptidi sintetici e valutare quindi confrontarlo con il peso molecolare teorico.

2. preparazione di estratti di tessuto

1. Anestetizzare topi ICR maschii in una camera di inalazione isoflurane e verificare la profondità di anestesia tramite pizzico di punta. Eutanasia i topi di dislocazione cervicale.
2. Utilizzando le forbici, fare un'incisione addominale del midline attraverso la pelle che si estende fino al processo xifoideo.
3. Tagliare attraverso il diaframma e raccogliere tutto il tessuto del polmone. Tagliare il tessuto in piccoli pezzi.
4. Lavare il tessuto tre volte con soluzione fisiologica tamponata ghiacciata 50 mM (pH 7.4).
5. Pesare i tessuti e il trasferimento di circa 100 mg di tessuti in una provetta di vetro² 12 x 75 mm.
6. Aggiungere 0,3 mL di tampone di estrazione (50mm Tris-tampone, pH 7.4, contenenti 0,1% poli (oxyethylene) octylphenyl etere).
7. Omogeneizzare i campioni di tessuto polmonare utilizzando un omogeneizzatore di miscelazione.
   1. Raffreddare i campioni su ghiaccio.
   2. Omogeneizzare i campioni a 20.000 giri/min per 30 s in un frullatore. Ripetere questo passaggio fino a quando i campioni sono completamente omogenei.
      Nota: Non omogeneizzare per più di 1 minuto di continuo, al fine di evitare un aumento della temperatura.
8. Trasferire 1.000 µ l dell'omogenato in una provetta da 1,5 mL e centrifugare per 5 min a 10.000 x g a 4 ° C.
9. Trasferire 500 µ l del surnatante ad un nuovo tubo di plastica da 1,5 mL.
10. Utilizzare 10 µ l di campione per determinare la concentrazione di proteine, mediante metodi quali il bicinconinico acido (BCA) o il metodo di Coomassie Brilliant Blue (CBB).
11. Per evitare il congelamento, aggiungere 80% glicerolo ai campioni per una concentrazione finale di glicerolo al 50%.
12. Conservare i campioni a-80 ° C fino all'utilizzo ulteriore.

3. la digestione dei substrati in estratti di tessuto e modello della proteasi

1. Aggiungere 10 µ l di 0,1 µ g / µ l del chetone di clorometil N-tosyl-L-fenilalanina (TPCK)-tripsina, 0.1 µ g / µ l della proteasi di Staphylococcus aureus V8 o 10 µ g / µ l di estratti di tessuto in 890 µ l di un tampone di digestione.
   1. Per chiarire la differenza nella specificità di proteasi a seconda del pH, utilizzare buffer regolata a pH 3, 5, 7 e 9. La composizione del buffer digestione è mostrata nella tabella 3.
   2. Eseguire un controllo negativo usando proteasi inattivi in estratti di tessuto, preparati da incubazione in acqua bollente (o riscaldamento a 100 ° C) per 10 min.
2. Aggiungere 10 µ l di iminobiotin-etichettati substrati (disciolto in dimetilsolfossido (DMSO), concentrazione finale = 100 pmol/10 µ l).
3. Incubare per 3 ore a 37 ° C per digerire i substrati iminobiotin-labeled.
4. Dopo l'incubazione, è necessario interrompere la digestione di substrati con acqua bollente (o di riscaldamento a 100 ° C) per 10 min.
5. Centrifugare i substrati digeriti per 5 min a 10.000 x g a 4 ° C.
6. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL.

4. purificazione del substrato con etichetta Iminobiotin

1. Aggiungere 50 µ l di 50% streptavidin sepharose perline in etere octylphenyl di 1m tampone Tris (pH 9) contenente 0,1% poly(oxyethylene).
   1. Utilizzare carta pH test per assicurarsi che la soluzione sia intorno a pH 9. Se il pH della soluzione è basso, la regolazione a circa pH 9 aggiungendo etere octylphenyl di 1m tampone Tris (pH 9) contenente 0,1% poly(oxyethylene). Questo passaggio è importante, come comporta l'associazione del substrato marcato iminobiotin di streptavidina.
2. Incubare per una notte a 4 ° C con miscelazione delicata continuo su una ruota di rotatore per associare i substrati iminobiotin-etichettati per la streptavidina. Le perle dovrebbero restare sospese durante l'incubazione.
3. Centrifugare per 1 min a 10.000 x g a 4 ° C. Eliminare il surnatante.
4. Lavare le perle cinque volte come segue:
   1. Aggiungere 1.000 µ l di tampone di lavaggio (50 mM Tris-tampone di pH 9) ai talloni.
   2. Lavare per 10 min a 4 ° C con miscelazione delicata continuo su una ruota di rotatore. Le perle dovrebbero restare sospese durante l'incubazione.
   3. Centrifugare per 1 min a 10.000 x g a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
5. Aggiungere 100 µ l di acido trifluoroacetico 0,2% ai talloni.
   1. Utilizzare carta pH test per assicurarsi che la soluzione sia sotto pH 2. Se il pH della soluzione è elevato, è possibile regolare il pH a sotto 2 aggiungendo acido trifluoroacetico 1%.
6. Incubare per 30 min a temperatura ambiente con miscelazione delicata continuo su una ruota di rotatore.
7. Centrifugare per 1 min a 10.000 x g a 4 ° C, quindi trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL.

5. preparazione e Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (spettrometria di massa MALDI-TOF) spettrometria di massa del campione

Nota: Tutte le soluzioni di seguito dovrebbero essere preparate con cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC)-acqua di sequenziamento-grado grado o dell'amminoacido.

1. Pipettare 500 µ l di acetonitrile su una resina C18 per attivarlo. Rimuovere l'acetonitrile usato. Ripetere questa operazione tre volte.
2. Equilibrare la resina C18 con 100 µ l di acido trifluoroacetico 0,1%. Rimuovere l'eluente. Ripetere questa operazione tre volte.
3. Per caricare i campioni, è necessario associare i campioni per la resina con una pipetta.
4. Lavare la resina con 20 µ l di acido trifluoroacetico 0,1%. Ripetere questo passaggio cinque volte.
5. Eluire i campioni con 3 µ l di acetonitrile 60% in acido trifluoroacetico 0,1%. Pipettare l'eluente su una piastra di destinazione per la spettrometria di massa MALDI-TOF. Immediatamente aggiungere soluzione satura di α-ciano-4-idrossicinnamico acido (CHCA) nel 50% acetonitrile in acido trifluoroacetico 0,1%.
6. Cristallizzare la miscela di essiccamento ad aria.
7. Acquisire spettri di massa dei campioni secondo il protocollo del produttore dello strumento.
   1. Impostare manualmente lo spettrometro di massa MALDI-TOF ad un positivo riflettono modalità.
   2. Calibrare lo spettrometro di massa utilizzando CHCA, bradichinina frammento 1-7 (peso molecolare monoisotopic = Da 756.3997) e dell'angiotensina II (peso molecolare monoisotopic = Da 1,045.5423).
   3. Acquisire gli spettri di massa di campioni, prestando particolare attenzione a spettri di massa da 700 a 900 Da per il modulo spaccato dei substrati biotina.
8. Identificare i picchi rilevati utilizzando la tabella 1. Rilevamento del peso molecolare appropriato indica fenditura al C-terminale dell'amminoacido pertinente.

Risultati

Valutazione del metodo per l'identificazione della specificità di proteasi di proteasi di modello

L'efficienza di questo sistema è stata valutata usando TPCK-tripsina e V8 proteasi, cui specificità del substrato sono state ottenute. TPCK-tripsina e V8 proteasi sono stati stimati a fendere la sequenza dell'amminoacido al C-terminale dei residui di lisina e arginina e sul lato di carboxy del acido aspartico e acido glutammico residui...

Discussione

Questo protocollo utilizza la spettrometria di massa MALDI-TOF per identificare specificità di proteasi in campioni grezzi derivati da estratti di tessuto e facilmente può essere scalato per elaborazione di campione più. In particolare, abbiamo maneggiato pH per causare un cambiamento nella specificità di substrato.

Il metodo (ABC) complesso avidina-biotina, che è stato ampiamente usato in biochimica a causa della sua specificità di legame, è stato utilizzato nel nostro protocollo. A causa del...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Resina Fmoc-NH-SAL(-[2,4-Dimetossifenil-N-(9-fluorenilmetossicarbonil) amminometil]fenossi resina)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00102
N,N-dimetilformammide (DMF)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00185
piperidina	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00176
acido trinitrobenzensolfonico (TNBS)	WAKO Chemical	209-1483
O-(6-cloro-1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio esafluorofosfato (HCTU)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00067
1-idrossi-1H-benzotriazolo, monoidrato (HOBt)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00014
diisopropiletilamina (DIPEA)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00030
triisopropilsilano (TIS)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00170
ethanedithiol (EDT)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00057
acido trifluoroacetico (TFA)	Millipore	S6612278 403
acetonitrile	Kokusan Chemical	2153025
C18 colonna cartuccia	Acque	WAT051910
poli(ossietilene) ottilfenile etere	WAKO Chemical	168-11805	Triton X-100
omogeneizzatore di miscelazione	Kinematica	PT3100	omogeneizzatore polytron
Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250	Nakarai Chemical	094-09
glicerolo	Nakarai Chemical	170-18
N-tosil-L-fenilalanina clorometil chetone (TPCK)-tripsina	Sigma-Aldrich	T1426
dimetil solfossido (DMSO)	WAKO Chemical	043-07216
streptavidina sefarosio	GE Healthcare	17-511-01
ZipTipC18	Millipore	ZTC18S096
&alfa;-ciano-4-idrossicinnamico acido (CHCA)	Sigma-Aldrich	C2020
MALDI-TOF spettrometria di massa	Bruker Daltonics, Germania	autoflex
2-iminobiotina	Sigma-Aldrich	I4632
Fmoc-aminoacidi	Watanabe Chemical Co., Ltd.