Valutazione dell'impatto dell'aggregazione proteica su Stress ossidativo cellulare nel lievito

Sommario

L'aggregazione della proteina induce stress ossidativo cellulare. Questo protocollo descrive un metodo per il monitoraggio degli Stati intracellulari di proteine amiloidogeniche e lo sforzo ossidativo connesso con loro, mediante citometria a flusso. L'approccio viene utilizzato per studiare il comportamento delle varianti solubile e soggetto a aggregazione del peptide amiloide-β.

Abstract

Misfolding e aggregazione amiloide conformazioni hanno riguardati l'insorgenza e la progressione di parecchie malattie neurodegenerative. Tuttavia, ci sono ancora poche informazioni sulla proteina insolubile come aggregati esercitano loro effetti tossici in vivo. Organismi di modello semplice di procarioti ed eucarioti, come batteri e lieviti, hanno contribuito notevolmente alla nostra comprensione attuale dei meccanismi dietro la formazione intracellulare dell'amiloide, propagazione di aggregati e tossicità. In questo protocollo, l'uso del lievito è descritto come un modello da dissezionare il rapporto tra la formazione di aggregati proteici e del loro impatto su stress ossidativo cellulare. Il metodo combina la rilevazione dello stato solubile/aggregati intracellulare di proteina amiloidogenica con la quantificazione del danno ossidativo cellulare derivanti dalla sua espressione mediante citometria a flusso (FC). Questo approccio è semplice, veloce e quantitativa. Lo studio illustra la tecnica correlando lo stress ossidativo cellulare causato da una vasta serie di varianti del peptide amiloide-β con loro propensioni di aggregazione intrinseco rispettivi.

Introduzione

Proteostasis è un determinante fondamentale dei processi di fitness e invecchiamento delle cellule. Nelle cellule, omeostasi della proteina è mantenuto da controllo di qualità di proteina sofisticate reti intendevano ad assicurare il corretto ripiegamento di conformeri proteine misfolded da accompagnatori e/o loro proteolisi mirata con diversi meccanismi ben conservati^{1 ,2,3,4,5}. Un gran numero di studi fornisce il supporto per il collegamento tra l'inizio e la progressione di una vasta gamma di malattie umane e il fallimento di proteostasis, che conduce al misfolding e aggregazione. Per esempio, la presenza di depositi proteici è considerata un marchio di garanzia patologico di molti disordini neurodegenerative, quali Alzheimer, Parkinson e malattie^6,7,8, di Huntington prionogenic malattie e non degenerativa amiloidosi⁹. È stato suggerito che presto assembly oligomerici e protofibrillar nella reazione di aggregazione sono i principale elicitori di citotossicità, stabilendo aberrante interazioni con altre proteine nell' affollato ambiente cellulare¹⁰. Inoltre, inclusioni di proteina (PI) possono essere trasmessi tra le cellule, propagando il loro effetto tossico^11,12. Di conseguenza, potrebbe essere che la formazione di PI potrebbe infatti costituire un meccanismo di disintossicazione che limita la presenza di specie pericolose aggregati a posizioni specifiche in cella, dove possono essere elaborati o accumulati senza effetti secondari importanti ^{13 , 14}.

Standard in vitro approcci biochimici hanno fornito importanti intuizioni le diverse specie che popolano le reazioni di aggregazione e loro proprietà^15,16. Tuttavia, le condizioni utilizzate in queste analisi sono chiaramente diverse da quelli che si verificano all'interno della cellula e, pertanto, chiedo loro rilevanza fisiologica. A causa della notevole conservazione delle vie cellulari come controllo di qualità di proteine, l'autofagia o il regolamento del^17,stato redox cellulare¹⁸ tra eucarioti^{19,20,21 ,22,23}, il lievito Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) è emerso come un modello di cellulare semplice privilegiato per studiare i determinanti molecolari dell'aggregazione proteica e il suo impatto citotossico associato in ambienti biologicamente rilevanti^24,25,26.

Propensione di aggregazione della proteina è una caratteristica intrinsecamente codificata nella sequenza primaria. Così, la formazione di amiloide-come le strutture può essere preveduta basato sull'identificazione e la valutazione della potenza di aggregazione-promuovere le regioni polipeptidi²⁷. Tuttavia, nonostante il successo di algoritmi bioinformatici per predire le proprietà di aggregazione in vitro di sequenze proteiche, sono ancora lontano da come queste propensioni si traducono in vivo effetto citotossico di previsione. Gli studi che affrontano il legame tra lo stato aggregato di una data proteina e suoi associato danno cellulare in maniera sistematica possono contribuire ad per aggirare questa limitazione computazionale. Questa connessione è indirizzata nello studio presente, approfittando di un grande insieme di varianti del peptide amiloide-β Aβ42 differiscono solo per un singolo residuo, ma la visualizzazione di un intervallo continuo di aggregazione propensioni in vivo²⁸. In particolare, è descritto un approccio basato su FC per identificare la specie conformazionale contabilità per il danno ossidativo suscitato da aggregazione-incline proteine in cellule di lievito. La metodologia fornisce molti vantaggi come la semplicità, funzionalità di alto-rendimento e accurata misurazione quantitativa. Questo approccio ha permesso di confermare che svolgono un ruolo protettivo contro lo sforzo ossidativo di PI.

Protocollo

1. S. cerevisiae culture e l'espressione della proteina

Nota: Varianti Aβ presentano propensioni di aggregazione relativo diversi a causa di una mutazione in un singolo residuo alla posizione 19 (Phe19) del peptide Aβ42 (Figura 1A). Queste varianti del peptide sono contrassegnate con la proteina fluorescente verde (GFP), che agisce come un'aggregazione reporter (Figura 1)²⁹.

1. Trasformare i plasmidi codifica per 20 varianti di Aβ42-GFP in cellule di lievito con un BY4741 sfondo parentale (MATa sua3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0)³⁰. Ogni plasmide codifica per un mutante di Aβ42 fuso alla GFP da un linker GSSGSSG. I plasmidi sono pESC(-URA) e comprendono il marcatore selezionabile URA3²⁹.
   1. Preparare il supporto completo sintetico senza uracile (SC-URA) con i seguenti componenti: 1,9 g/L azoto lievito base senza uracile, 5 g/L di solfato di ammonio e 900 mL di ddH₂O combinato con 100 mL di glucosio 20% (p/v).
   2. Mettere una colonia delle cellule del lievito trasformato in 20 mL di terreno SC-URA contenente 2% di glucosio e far crescere le colture durante la notte a 30 ° C sotto agitazione a 210 giri/min.
2. Il giorno successivo, crescere nuove culture di cellule di lievito inoculando 100 µ l della coltura durante la notte in 5 mL di terreno nuovo SC-URA.
3. A un OD₅₉₀ di 0,5, centrifugare le culture a 3.000 x g per 4 minuti, eliminare il supernatante e risospendere le cellule nello stesso volume di terreno nuovo SC-URA contenente 2% raffinosio.
4. Incubare a 30 ° C sotto agitazione a 210 giri/min per 30 min. Centrifugare le cellule a 3.000 x g per 4 minuti, quindi eliminare il supernatante. Risospendere le cellule in mezzo SC-URA fresco contenente 2% galattosio per indurre l'espressione di proteine ricombinanti.
5. Dopo 16h di indurre l'espressione della proteina in mezzo SC-URA contenente 2% galattosio, vendemmia 1 mL di cellule indotte in microcentrifuga sterile per centrifugazione a 3.000 x g per 4 min.
   Nota: Le differenze più rilevanti si verificano dopo un periodo di induzione di cellule di lievito indotto 16 h. esprimendo la varianti di Aβ42-GFP possa essere visualizzato da microscopia di fluorescenza per determinare la distribuzione della proteina ricombinante all'interno delle cellule (Figura 2B).

2. cellula di colorazione

Nota: Cellule fresche indotto non sono necessari come controllo negativo per stabilire una soglia fluorescente durante un'analisi FC.

1. Prendere le cellule di lievito indotta da h 16 e determinare la densità ottica a 590 nm (OD₅₉₀)_. Diluirli in una soluzione salina tamponato fosfato sterile (PBS) a un OD₅₉₀ di 0.1.
   1. Preparare 1 x tamponato fosfato salino come segue: aggiungere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na₂HPO₄, e 0,24 g di KH₂PO₄ a 800 mL di ddH₂O. riempire la soluzione fino a 1 L di ddH₂O dopo aver regolato il pH 7.4 con HCl. filtrare il buffer su un filtro di 0,2 µm.
2. Trasferire le sospensioni delle cellule che esprimono adeguatamente etichettate provette (polistirolo mm turno-fondo di 12 × 75) e proteggerli dalla luce. Assicurarsi che sono pronti per essere caricati sul citometro a flusso per l'analisi, insieme alle cellule indotto non e non tinto.
3. Aggiungere la sonda di stress ossidativo (ad es., CellROX profondo rosso) per ogni campione a una concentrazione finale di 5 µM e incubare le cellule a 30 ° C per 30 min al buio.
4. Dopo l'incubazione, lavare le cellule 3 volte con 1x PBS e risospendere li nello stesso volume del buffer prima di loro analisi di FC.

3. analisi di citometria a flusso di

Nota: Utilizzare un'installazione FC con laser appropriato e filtri per rilevare GFP e segnale di fluorescenza sonda di stress ossidativo. Può essere utilizzato un citometro a flusso dotato di un laser di 488 nm blu per la rilevazione di GFP e un laser 635 nm rosso per la rilevazione della fluorescenza di sonda di stress ossidativo. Acquisizione di fluorescenza emissione di GFP e stress ossidativo sonda viene eseguita con un 530/30 nm BP e un filtro di BP di 660/20, rispettivamente (tabella 1).

1. Fare clic su Nuovo foglio di lavoro aperto Pannello e creare le seguenti trame di puntino di acquisizione.
   1. Selezionare lo Scatter Plot strumento dalla barra degli strumenti e creare una trama con le variabili zona Side Scatter (SSC-A) sull'asse y vs Forward Scatter-Area (FSC-A) in una scala lineare sull'asse x.
   2. Fare clic sullo Scatter Plot strumento dalla barra degli strumenti e creare una trama con le variabili FL1-Area (FITC) sul asse x vs. FL3-Area (APC) in una scala logaritmica sull'asse y.
2. Fare clic sull'icona Strumenti impostazioni . Fare clic sulla scheda compensazione e impostare tutti i livelli di compensazione. Fare clic sulla scheda di acquisizione e selezionare un numero totale di 20.000 eventi da registrare.
3. Fare clic sull'icona di Portata per passare la portata a bassa.
4. Fare clic sulla scheda Acquisisci per avviare l'esecuzione le cellule non-indotta, non macchiate e regolare la tensione nell' Impostazioni dello strumento di avanti e dispersione di lato fino a quando la popolazione è distribuita nel quadrante centrale a sinistra.
   1. Fare clic sull'icona del poligono per impostare una regione R1 intorno la popolazione delle cellule escluse detriti cellulari e utilizzare questa popolazione gated P1 = R1 per tutte le trame puntino fluorescente e rappresentanze di istogramma (Figura 3).
5. Per regolare la tensione PMT del segnale di fluorescenza, eseguire le cellule senza macchiate nella trama FL1-FL3 dot, tuning il guadagno nella scheda di Impostazione dello strumento , fino a quando le cellule sono distribuite nel quadrante inferiore sinistro.
6. Cambiare il campione per le cellule indotte per misurare la fluorescenza di GFP. Nella scheda Impostazione dello strumento , è necessario impostare il guadagno nella FSC-A vs FL1 (FITC) quando la popolazione è distribuita nel quadrante inferiore destro. Definire la popolazione di cellule positive con un cancello (cancello P2).
7. Cambiamento del campione indotto non macchiato celle per visualizzare lo sforzo ossidativo dalla fluorescenza su un terreno di dot FSC-A vs FL3 (APC). Sintonizzare il guadagno fino a che la popolazione delle cellule è distribuita nel quadrante superiore sinistro. Porta la popolazione cellulare positiva nel P3.
8. Fare due appezzamenti di istogramma con l'icona di istogramma per rappresentare la fluorescenza delle cellule. Per rappresentare l'intensità di fluorescenza, assicurarsi FL1 (FITC) che rappresenta la fluorescenza di GFP è nell'asse x e FL3 (APC) che rappresenta la fluorescenza è nell'asse y, l'applicazione di popolazioni P2 e P3 su una scala logaritmica, rispettivamente.
   Nota: Istogramma sovrapposizioni sono un buon modo per illustrare le differenze tra i profili di fluorescenza delle cellule che esprimono diverse varianti Aβ.

4. Immunodetection recombinant della proteina

1. Per determinare i livelli di espressione della proteina, raccogliere le colture di lievito indotte per 16 h mediante centrifugazione a 4.000 x g per 6 min e conservare il pellet di cellule a-80 ° C.
   1. Risospendere le cellule raccolte che esprimono la proteina ricombinante per 16 h in PBS. Preparare sospensioni cellulari di 200 µ l di ogni mutante di Aβ42-GFP a un OD₅₉₀ di 20.
2. Per l'analisi di frazione della proteina totale, 100 µ l di ogni mutante della raccolta mediante centrifugazione a 14.000 x g per 20 min e risospendere il pellet cellulare nello stesso volume di tampone di lisi del lievito Y-a (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1% DMSO, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA contenente 10 mg/mL SB3-14 (myr istyl solfobetaina) completati con 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF)).
   1. Incubare i campioni per 20 min a temperatura ambiente sotto lieve agitazione.
3. Determinare la concentrazione di Estratto di proteine usando l'analisi di Bradford. Caricare fino a 5 µ g di estratto proteico di ogni campione su un gel di elettroforesi SDS-PAGE 15% di acrilammide e macchia su una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) a 100 V per 60 min.
   1. Preparare un Bradford reagente con 100 mg di Coomassie Brilliant Blue G-250 disciolto in 50 mL di etanolo al 95% e aggiungere 100 mL di acido fosforico 85% (p/v). Poi, quando il colorante è completamente sciolto, stemperate il composto con ddH₂O a 1 L e filtrare attraverso carta da filtro cellulosa appena prima dell'uso.
      Nota: Il reagente di Bradford dovrebbe essere marrone chiaro.
   2. Preparare un standard di albumina di siero bovino (BSA) che vanno da 5-100 µ g di proteina in 1.000 µ l del reagente Bradford.
   3. Aggiungere 1-10 µ l di proteina estrarre a 1 mL di reattivo di Bradford e incubare la miscela a temperatura ambiente per 5 min.
   4. Misurare l'assorbanza dei campioni e la proteina estrarre campioni OD₅₉₅.
   5. Per l'analisi, fare una trama con i valori di assorbanza ottenuti per il standard vs. µ g di proteina. Sulla curva standard, determinare le concentrazioni dei campioni originali dalla quantità di proteine, considerando il volume e la diluizione, se presente.
4. Risciacquare la membrana con 1x Tris-buffered saline (TBS), 0.1% Tween 20 (Immunotyping) e bloccarlo utilizzando latte in polvere senza grassi 5% (p/v) in 1 x TTBS.
   1. Per preparare 1 L di 10 x TBS, sciogliere 24 g di Tris base e 88 g di NaCl in 900 mL di H₂O_dd e regolare il pH a 7,6. Aggiungere ddH₂O ad un volume finale di 1 L. Per una soluzione 1x, miscelare 1 parte di stock x 10 con 9 parti di ddH₂O.
5. Incubare la membrana per 1 h con un anticorpo primario di β-amiloide 6E10 diluito 1:1,000 e per 1 h a temperatura ambiente con una capra di anticorpo secondario coniugato IgG-HRP anti-topo diluito 01:10, 000.
6. Sviluppare le membrane con 1 mL di reagente fluorescente Luminata e quantificare le bande di analisi densitometrica come descritto al punto 5.2.

5. analisi dei dati

1. Per analizzare i dati ottenuti da FC, creare una tabella che mostra l'intensità di fluorescenza media (MFI) e mediana fluorescenza con relativo errore standard corrispondenti e/o il coefficiente di variazione (CV) per fluorescenza GFP e livelli di stress ossidativo.
   1. Fare clic sulla scheda "Impostazioni" e l'icona di statistiche per personalizzare i dati statistici necessari per ogni canale.
      Nota: Quando si confrontano le varianti della proteina, convertire dati dei valori di fluorescenza in uno sfondo di piega o metrica ad alta risoluzione (RD):
      
      In questa metrica, il campione medio è la media di fluorescenza di campioni di problema, il controllo medio è la media di fluorescenza delle cellule usate come controllo e la SD è la deviazione standard della media di fluorescenza. Fattore di RD è un indice più accurato rispetto valore MFI non solo calcola la differenza tra i campioni, ma anche gli account per la diffusione dei dati. Questo calcolo è specificamente rilevante quando il confronto dei dati provenienti da diversi esperimenti effettuati nel corso del tempo. Una volta sono stati calcolati il RDs, l'uso di un test statistico è consigliabile confermare il significato delle differenze osservate tra varianti della proteina.
2. Per proteina immunodetection, quantificare i livelli di proteina ricombinante mediante Western blot utilizzando software ImageJ.
   1. Prima dell'analisi densitometria, convertire le immagini raw originale della membrana sviluppata in modalità di scala di grigi e il formato di file JPEG.
   2. Regolare la sezione Impostare misure di menu analizza a Dire valore di grigio.
   3. Fare clic sullo strumento rettangolo da ImageJ e definire un'area di interesse (ROI) con una dimensione coerente per l'analisi di densitometria di banda. Centro di ciascuna banda sull'immagine della membrana all'interno della cornice rettangolare creata e registrare la misurazione uno utilizzando Ctrl + M (il comando di misurazione).
   4. Misurare lo sfondo locale adiacente per ogni banda, applicando la stessa area ROI. Dopo la misurazione, sottrarre lo sfondo locale corrispondente da ogni banda individuo.

Risultati

Questo protocollo descrive come impiegare una collezione di 20 varianti del peptide Aβ42 dove Phe19 è stato mutato a tutti naturale proteinogenici aminoacidi²⁸. Le propensioni di aggregazione teorica di queste proteine possono essere analizzati usando due algoritmi bioinformatici diversi (AGGRESCAN e TANGO^31,32). In entrambi i casi, questa analisi esegue il rendering di una gradazione progressiva delle tend...

Discussione

Una vasta gamma di malattie è legata all'accumulo di proteine misfolded in depositi cellulari^6,7,8,33. Molti sforzi sono stati fatti per svelare i meccanismi molecolari che determinano l'insorgenza di queste malattie utilizzando approcci computazionali, che non tengono in concentrazioni di proteina di conto, o in vitro si avvicina, in cui la concentrazione nella proteina rimane costant...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cellule di lievito BY4741	ATCC	201388	Genotipo: MATa his3Δ 1 leu2Δ 0 met15Δ 0 ura3Δ 0
plasmidi pESC(-Ura)	Agilent Genomics	217454	Plasmide di espressione del lievito con un promotore Gal. Marcatore selezionabile URA3
Lievito sintetico Drop-out Medium Integratori	Sigma	Y1501	Lievito in polvere
Base azotata senza aminoacidi	Sigma	Y0626	Raffinosio in polvere
	Sigma	R7630	Glucosio in polvere
	Sigma	G7021	Galattosio in polvere
	Sigma	G0750	Fosfato in polvere
Soluzione salina tamponata (PBS)	Fisher Scientific	BP3991	Soluzione 10X
Reagente CellROX rosso intenso	Life Technologies	C10422	Sensore fluorescente a presenza di radicali liberi, non fluorescente in uno stato ridotto, che presenta una fluorescenza brillante in seguito all'ossidazione da parte di specie reattive dell'ossigeno (ROS), con valori massimi di assorbimento/emissione a 644/665 nm.
Reagente per l'estrazione di proteine Y-PER	Thermo Scientific	78990	Tampone di lisi cellulare liquida
Acrilammide/Bis-acrilammide	Sigma	A6050	Soluzione
Reagente colorante Bradford	Bio-Rad	5000205	Reagente colorante per la determinazione in un'unica fase della concentrazione proteica
dell'anticorpo beta-amiloide 6E10	BioLegend	803001	IgG1 di topo. L'epitopo si trova all'interno degli amminoacidi 3-8 della beta amiloide (EFRHDS).
Coniugato IgG-HRP anti-topo di capra	Bio-Rad	1721011
Membrana Immobilon-P, PVDF	Millipore	IPVH00010
Luminata forte	Merk	WBLUF0100	Reagente di rilevamento HRP chemiluminescente premiscelato, pronto all'uso
Soluzione di fluoruro di fenilmetansulfonile (PMSF)	Sigma	93482	Inibitore della proteasi. Disciolto a 0,1 M in etanolo
FACSCantometro a flusso	BD Biosciences	657338	dotato di un 488  laser blu nm per la rilevazione di GFP, e 635  laser rosso nm / filtro BP 530/30 nm e filtro BP 660/20
Elettroforesi Mini Trans-Blot Cella di trasferimento	Bio-Rad	1703930	Sistema di trasferimento proteico
Sistemi portatili Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems	Bio-Rad	1658000FC	Sistema di elettroforesi