Sequenziamento di MicroRNA retrospettiva: Protocollo di preparazione libreria DNA complementare utilizzando campioni di RNA di paraffina-incastonato formalina-fisso

Olivier Loudig; Christina Liu; Thomas Rohan; Iddo Z. Ben-Dov

doi:10.3791/57471

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Articolo metodologico

Sequenziamento di MicroRNA retrospettiva: Protocollo di preparazione libreria DNA complementare utilizzando campioni di RNA di paraffina-incastonato formalina-fisso

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DOI:

10.3791/57471

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5 maggio 2018

Olivier Loudig¹^,²^,³ , Christina Liu¹^,² , Thomas Rohan³ , Iddo Z. Ben-Dov⁴

¹Department of Research, Hackensack University Medical Center, ²Department of Medical Sciences, Seton Hall University, ³Department of Epidemiology and Population Health, Albert Einstein College of Medicine, ⁴Department of Nephrology and Hypertension, Hadassah - Hebrew University Medical Center

In questo articolo

Sommario

Esemplari di paraffina-incastonati formalina-fisse rappresentano una preziosa fonte di biomarcatori molecolari delle malattie umane. Qui presentiamo un protocollo di preparazione libreria cDNA laboratorio-basato, inizialmente progettato con RNA congelato fresco e ottimizzato per l'analisi dei microRNA archiviati dai tessuti stored fino ai 35 anni.

Abstract

– Archiviata, clinicamente classificati formalina tessuti paraffina-incastonati (FFPE) è in grado di fornire acidi nucleici per studi retrospettivi molecolari dello sviluppo del cancro. Utilizzando lesioni non invasive o pre-maligne da pazienti che successivamente sviluppano la malattia invasiva, analisi di espressione genica possono contribuire ad identificare le alterazioni molecolari iniziali che predispongono al rischio di cancro. È stata descritta bene che gli acidi nucleici recuperati dai tessuti FFPE hanno subito gravi danni fisici e modificazioni chimiche, che rendono difficile la loro analisi e generalmente richiede dosaggi adattati. I microRNA (Mirna), tuttavia, che rappresentano una piccola classe di molecole di RNA che coprono solo fino a ~ 18 – 24 nucleotidi, hanno dimostrato di resistere a deposito a lungo termine e sono state analizzate con successo in campioni FFPE. Qui presentiamo un 3' con codice a barre del DNA (cDNA) Biblioteca preparazione protocollo complementare specificamente ottimizzato per l'analisi di piccole molecole di RNA estratto dai tessuti archiviati, che recentemente è stata dimostrata per essere robusto e altamente riproducibile quando utilizzando archiviati campioni clinici memorizzati fino a 35 anni. Questa preparazione di libreria è ben adattata per l'analisi multiplex del materiale compromessa/degradato dove campioni di RNA (fino a 18) sono legati con singoli 3' adattatori con codice a barre e poi sommati insieme per le successive preparazioni enzimatiche e biochimiche prima dell'analisi. Tutte le purificazioni vengono eseguite mediante elettroforesi in gel di poliacrilamide (pagina), che consente dimensioni specifiche selezioni e arricchimenti di piccole specie di RNA con codice a barre. Questa preparazione di libreria di cDNA è ben adattata al minuto ingressi di RNA, come un pilota catena della polimerasi (PCR) consente la determinazione di un ciclo di amplificazione specifica di produrre quantità ottimale di materiale per il sequenziamento di nuova generazione (NGS). Questo approccio è stato ottimizzato per l'uso di RNA FFPE degradato dagli esemplari conservati per fino a 35 anni e fornisce dati NGS altamente riproducibili.

Introduzione

Mirna sono straordinariamente ben conservati in formalina-fisso paraffina (FFPE) esemplari¹^,²^,³. Lavoro precedente ha dimostrato che l'espressione di queste breve non codificanti singolo incagliato RNA molecole regolatorie possono essere correttamente valutate utilizzando RNA totale da campioni FFPE e fornire dati di espressione genica rilevanti rispetto ai freschi originale tessuti⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸. Rispetto al RNA messag....