Method Article

Split-BioID — Analisi proteomica dei complessi della proteina contesto specifico in ambiente nativo di cellulare

DOI:

10.3791/57479

⸱

April 20th, 2018

 , 
1Cluster of excellence CellNetworks, Heidelberg University, 2Heidelberg University Biochemistry Center (BZH)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Forniamo un protocollo dettagliato per Spalato-BioID, un'analisi di frammenti-complementazione della proteina basata sulla tecnica di prossimità-etichettatura BioID. Attivato sull'interazione di due proteine specificate, permette l'analisi proteomica dei complessi della proteina contesto-dipendente in ambiente nativo di cellulare. Il metodo è semplice, economica e richiede solo la normale attrezzatura da laboratorio.

Abstract

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Per completare la purificazione di affinità esistente (AP) e approcci per l'identificazione delle interazioni proteina-proteina (PPI), sono stati introdotti gli enzimi che permettono l'etichettatura di prossimità-dipendente delle proteine in cellule viventi. Una tale enzima, BirA * (utilizzato nell'approccio BioID), media la biotinilazione delle proteine all'interno di un intervallo di circa 10 nm. Quindi, quando fusa ad una proteina di interesse ed espressa in cellule, permette l'etichettatura delle proteine prossimale nel loro ambiente nativo. Al contrario di AP che si basa sulla purificazione dei complessi della proteina assemblato, BioID rileva proteine che sono state contrassegnate all'interno delle cellule non importa se ancora stanno interagendo con la proteina di interesse quando sono isolate. Dal momento che biotinylates prossimale proteine, uno può inoltre sfruttare l'eccezionale affinità di streptavidina per biotina per isolarli in modo molto efficiente. Mentre BioID si comporta meglio di AP per identificazione transitori o interazioni deboli, entrambi gli approcci spettrometria di massa di AP e BioID forniscono una panoramica di tutte le possibili interazioni che può avere una data proteina. Tuttavia, non forniscono informazioni sul contesto di ogni PPI identificati. Infatti, la maggior parte delle proteine in genere fanno parte di diversi complessi, corrispondenti a maturazione distinti passaggi o diverse unità funzionali. Per risolvere questa limitazione comune di entrambi i metodi, abbiamo progettato un saggio di complementazione di frammenti proteici basato sull'enzima di BirA. In questo test, due frammenti di BirA * inattivi possono Riassemblare in un enzima attivo quando portato in prossimità di due proteine interagenti a cui essi sono fuse. Il dosaggio di Spalato-BioID risultante permette così l'etichettatura delle proteine che assemblano intorno a una coppia di proteine interagenti. Purché questi due interagire solo in un determinato contesto, Spalato-BioID quindi permette l'analisi di specifiche unità funzionali di contesto-dipendente in ambiente nativo di cellulare. Qui, forniamo un protocollo passo-passo per testare e applicare Spalato-BioID a una coppia di proteine interagenti.

Introduction

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Funzioni più cellulari sono interpretato da proteine che assemblare dinamicamente complessi macromolecolari, l'identificazione delle interazioni proteina-proteina (PPI) è uno sforzo maggiore nella ricerca biomedica. Infatti, PPI sono spesso liberalizzati nella malattia e rappresentare un potenziale bersaglio per terapie1. Metodo il più ampiamente usato per l'identificazione di PPI è l'approccio di purificazione (AP) di affinità in cui, a seguito di lisi delle cellule, una proteina di interesse viene purificata in particolare su una matrice e proteine associate vengono successivamente identificate mediante spettrometria di massa (MS). Mentre AP-MS è un approccio potente, in genere non esegue bene su complessi proteici scarsamente solubili, interazioni molto transitorie o PPI che richiedono una struttura subcellulare intatta. Inoltre, l'interpretazione dei dati può essere complicata dalla natura dinamica delle reti PPI, come una singola proteina è spesso parte di diversi complessi proteici distinti.

Tecniche di prossimità-etichettatura come BioID2 o APEX23,4 recentemente sono state sviluppate per risolvere alcune delle limitazioni degli approcci AP-MS. In BioID, l'enzima BirA * (corrispondente a una variante di G115R dell'enzima wild-type e. coli ) catalizza la formazione di biotynil-AMP labile (bio-AMP) che possono reagire con le ammine primarie. In contrasto con l'enzima di tipo selvaggio, che conserva bio-AMP nel suo centro attivo, BirA * rilascia bio-AMP permettendo la sua diffusione al suo ambiente limitrofo. Quindi, quando fusa ad una proteina di interesse ed espressa in cellule, proteine prossimale possono essere biotinilati entro un intervallo stimato di 10 nm5. Questi contrassegnati prossimali proteine sono quindi isolate da streptavidina pulldown e identificate da MS. Al contrario di AP-MS, BioID richiede l'espressione di una proteina di fusione. Solo così può essere applicato a proteine la cui funzione non è ostacolata da tagging. Inoltre, la velocità di etichettatura è lenta, in genere 6 – 24 h2,6, rendendo difficile il rilevamento delle proteine di breve durata. Eppure, rispetto ad AP-MS, BioID-MS offre parecchi vantaggi chiave: primo, la sua cattura le interazioni in ambiente nativo di cellulare; in secondo luogo, etichettate proteine piuttosto che complessi montati sono isolati dopo lisi cellulare; in terzo luogo, streptavidina pulldowns consentire l'utilizzo di buffer denaturante e condizioni di lavaggio difficili. Quindi, il metodo è più sensibile per rilevare transitori o interazioni deboli7 interazioni che si verificano su una specifica e difficile da isolare la struttura subcellulare8.

Tuttavia, la maggior parte delle proteine sono solitamente parte di più grandi complessi che possono rimodellare secondo stimoli cellulari o per la funzione che deve essere eseguita. Quindi, una singola proteina è in genere parte di diversi complessi, corrispondenti a distinte unità funzionali coinvolgendo distinte o sovrapposizione PPI. Entrambi gli approcci offrono una panoramica di tutte le associazioni che può avere una data proteina, ma non riescono ad affrontare il contesto di PPI individuali. Per aumentare la risoluzione di quest'ultimo, abbiamo progettato un test di complementazione di frammenti proteici (PCA) in cui due frammenti inattivi di BirA * (NBirA *, che contiene il dominio catalitico, e CBirA * che può essere visto come il dominio di riattivazione) può Rimontare in un enzima attivo quando portato in prossimità di due interagendo proteine9. Il dosaggio di Spalato-BioID risultante si concentra il biotinylation vicinanza-dipendente sulle proteine che assemblare intorno a una coppia di proteine interagenti e così permette l'identificazione del contesto gli assembly dipendenti della proteina. Recentemente abbiamo dimostrato la potenza di un'eccezionale risoluzione di Spalato-BioID risolvendo due distinte proteine complessi coinvolti nel miRNA-mediata silenziamento genico via9.

Complessivamente, in un'unica e semplice analisi, Spalato-BioID permette alla scoperta e in particolare assegnando PPI definiti unità funzionali in cui una data proteina è coinvolta, fornito che un ulteriore interazione della proteina della corrispondente proteina complessa è noto.

Protocol

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Nota: Una panoramica del metodo è illustrata nella Figura 1.

1. pianificazione della strategia di clonazione

  1. Selezionare due proteine interagenti putativamente da testare.
    Nota: Ciascuna delle due proteine verrà fusa a un frammento di Spalato-BioID: NBirA * o CBirA *. Come controllo negativo, le proteine di fusione CBirA * saranno testate con fusa per la proteina fluorescente verde NBirA * (NBirA *-GFP). Come un ulteriore controllo, le fusioni NBirA * possono essere collaudate da solo, senza cognate CBirA * fusione oppure in combinazione con un CBirA * fusa ad una proteina non correlata. È consigliabile non utilizzare CBirA *-GFP come controllo negativo come esso è stato indicato per portare costantemente a sfondo principale quando combinato a qualsiasi NBirA * fusione proteina9. La causa di questa osservazione potrebbe essere il livello di espressione di CBirA *-GFP, molto superiore a qualsiasi altro CBirA * proteine di fusione che abbiamo usato finora, che possono portare a significativi riassociazione con il frammento di NBirA.
  2. Dopo aver selezionati due proteine, controllare la letteratura per trovare se entrambi sono già stati correttamente etichettati negli studi funzionali (per esempio come una proteina di fusione GFP-etichettato).
    1. In presenza di tali studi, si noti la posizione del tag (a N - o C-terminale) e utilizzare lo stesso orientamento di codificare le proteine di interesse con i frammenti di Spalato-BioID.
    2. Se non esiste nessun tale studio, piano costrutti codificanti per entrambe le proteine taggati a N - e C-terminale e piano un test per verificare la funzionalità delle proteine di fusione (ad esempio, un esperimento di salvataggio in una linea cellulare impoverito per la proteina WT).
      Nota: Quando si accoppia due proteine di fusione utilizzando plasmidi che codificano linker flessibile lungo descritti nella Figura 2 , l'orientamento delle proteine di fusione (BirA * frammenti con fusibile a Monte o a valle delle proteine di interesse) generalmente non importa . Infatti utilizzando FRB e FKBP come proteine modello, è stato dimostrato che tutte le quattro possibili iterazioni (entrambi i frammenti alla N-termini, entrambi alla C-termini, uno al N-terminale e l'altro C-terminale e viceversa) rendimento comparabile biotinylation9.
  3. Disegnare primers per amplificare ORFs delle due proteine di interesse per il clonaggio in plasmidi Spalato-BioID. Prestare attenzione che i fotogrammi di traduzione sono gli stessi come i frammenti di BirA. Se usando i plasmidi descritti nella Figura 2, è possibile utilizzare gli enzimi di restrizione PmeI e PacI per costruire la fusione CBirA * e gli enzimi ClaI e MluI per la fusione di NBirA *.
    Nota: I plasmidi rappresentati nella Figura 2 portano un elemento di tet-sensible a reagire di bi-direzionale affiancato da siti di ricombinazione di F3/FRT. Questo consente la co-espressione regolata all'incirca sullo stesso livello delle due proteine di fusione dal plasmide stesso10e la possibilità di costruire rapidamente linee cellulari stabili di cambio cassetta ricombinazione-mediata (RMCE). In questi plasmidi, NBirA * ha un tag di myc mentre CBirA * ha un tag di bandiera. ORFs naturalmente può anche essere clonate singoli plasmidi con promotori costitutivi.
    Passaggio critico: Durante il test di due proteine interagenti, si consiglia di confrontare fusa alla proteina 1 combinata con fuso a proteina 2 CBirA * NBirA * e NBirA * fusa alla proteina 2 combinata con CBirA * fusa alla proteina 1. Infatti, è frequentemente osservato che un'iterazione funziona meglio di altro.

2. clonazione ORFs dei geni di interesse nel plasmide Split-BioID

Nota: In questo esempio, vengono considerate due proteine che possono essere contrassegnate al N-terminale. Quattro condizioni saranno testate e confrontate alle cellule non trasfettate (tabella 1).

  1. Reazione a catena della polimerasi (PCR) consente di amplificare ORFs delle due proteine da testare con i primer appropriati. Disegnare primers che introducono il ClaI e MluI siti di restrizione per le proteine di fusione NBirA * e il PacI e PmeI siti per le proteine di fusione di CBirA *.
    Nota: La PCR può essere eseguita con tutte le attività commerciali, preferenzialmente, correzione bozze, DNA polimerasi. Seguire il protocollo standard da manuale e adattare la temperatura di fusione dei primer e la lunghezza del ORF per essere amplificati secondo le indicazioni del produttore.
  2. Subclone il primo ORF
    1. Digerire sia plasmide (circa 2 μg) e PCR-amplificato ORF1 (per essere fusa a NBirA *) con ClaI e MluI. Eseguire reazioni di digestione utilizzando 1 μL di ogni enzima, mescolato con il volume appropriato di tampone del DNA e la reazione in un volume totale di 20 μL in una provetta da 1,5 mL per 1 h a 37 ° C.
    2. Eseguire entrambi esempi di digestione su un gel del DNA dell'agarosi-TAE di 1%. Asportare le bande corrispondenti a plasmide digerito e ORF1 con un bisturi pulito e trasferimento in provette da 1,5 mL.
    3. Purificare entrambe le bande utilizzando un kit di estrazione del DNA standard.
    4. Lega i plasmidico digerito e ORF1 utilizzando reagenti standard.
      1. Se utilizzando il kit di legatura indicato nella Tabella materiali, lega i 100 ng di DNA contenente eccesso molare di tempo di tre-cinque inserire sopra del plasmide in un volume totale di 4,5 μL. Aggiungere 5 µ l di tampone di ligasi x T4 2 e 0,5 μL di T4 DNA ligasi dal kit di legatura. Eseguire la reazione di legatura in una provetta da 1,5 mL per 10 min a temperatura ambiente (TA).
    5. Trasformare in celle competenti standard DH-5 α Escherichia coli (preparate secondo il metodo11 di Inoue).
      1. Mix 3 μL della reazione di legatura con 50 μL di cellule competenti in un 1,5 mL tubo sul ghiaccio ed incubare per 30 min. trasferimento alle cellule di un calore bloccano insieme a 42 ° C per 30-45 s e poi incubare in ghiaccio per 2 min. aggiungere 250 μL di pre-riscaldata (37 ° C) Lisogenesi brodo (LB) medio e piastra 100 μL di cellule su una piastra di LB-agar contenente ampicillina pre-riscaldata (37 ° C). Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C.
    6. Il giorno successivo, è possibile scegliere quattro-sei colonie e li Incubare a 37 ° C, 180 giri/min, pernottamento in 3 mL di terreno LB contenente 100 μg⋅mL-1 ampicillina in una provetta da 15 mL.
    7. Isolare i plasmidi dalle colonie raccolte utilizzando un kit di DNA MiniPrep standard.
    8. Verificare la correttezza dei plasmidi di Sanger sequenziamento utilizzando il primer reverse Cassette 2 (tabella 2).
  3. Una volta che è stato identificato un plasmide contenente il primo ORF, subclone secondo ORF in tale plasmide seguendo la stessa procedura come passo 2.2 ma usando gli enzimi PmeI e PacI.
  4. Sequenza i plasmidi risultanti utilizzando il primer reverse Cassette 1 (tabella 2).

3. test delle proteine di fusione

Nota: Le seguenti istruzioni sono per il duplice espressione inducibile plasmidi (Figura 2) e HeLa-11ht cellule, una linea di cellule HeLa-CCL2 subclonal, che esprimono stabilmente la trascrizione inversa di tetraciclina-controllato attivatore rtTA-M2 e contenente un locus per RMCE12. Il mezzo di crescita per queste cellule è per volta Eagle Medium (DMEM di Dulbecco) contenente 10% siero bovino fetale privo di tetraciclina (FBS). Quando si utilizza un altro tipo di cellula, esatte condizioni di semina e crescita medio dovrà essere adattato.

  1. Trasfezione transiente
    1. Cellule di seme ad una concentrazione di 1 x 105 celle in 2 mL per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti il giorno prima di transfezione e incubare le cellule durante la notte a 37 ° C, 5% CO2 in un'incubatrice di coltura cellulare.
    2. Il giorno della transfezione, rimuovere il supporto di ciascun pozzetto e sostituire con 2 mL di terreno nuovo.
    3. Preparare le quattro reazioni di transfezione secondo la tabella 1. Per ciascun pozzetto a transfect, aggiungere 6 µ g di polyethylenimine a 3 µ g di DNA plasmidico in una provetta sterile da 1,5 mL e riempire a 500 µ l con il mezzo di DMEM senza siero.
    4. Incubare ogni mix di transfezione per almeno 5 min a temperatura ambiente prima di aggiungere il saggio di goccia in ciascun pozzetto. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C, 5% CO2.
  2. Induzione e vicinanza-etichettatura
    1. Il giorno dopo la trasfezione, rimuovere il mezzo e sostituirli con supplementato con biotina a 50 µM per stimolare biotinylation e doxiciclina a 200 ng⋅mL−1 per indurre l'espressione di proteine di fusione. Incubare le cellule per almeno 20 ore a 37 ° C, 5% CO2.
      1. Per rendere una soluzione stock di biotina, sciogliere Biotina presso 50 mg⋅mL-1 (corrisponde a ca. 200 mM) a 2 M di idrossido di ammonio. Una volta che è completamente dissolto, diluirlo a 50 mM a 500 mM Hepes, pH 7.4, quindi regolare il pH a 7.4 con HCl. aliquota e memorizzare la risultante 1.000 x soluzione di riserva a-20 ° C. Sciogliere la doxiciclina a mg⋅mL 10-1 in etanolo al 70% e conservare in una microprovetta tappo a vite a-20 ° C al buio.
  3. Preparazione del lysate delle cellule
    1. Lavare le cellule una volta con soluzione fisiologica 1 mL di freddo (4 ° C) in tampone fosfato (PBS).
    2. In ciascun pozzetto, aggiungere 100 µ l di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5 mM DTT e inibitori della proteasi).
    3. Raccogliere le cellule con una scrapper cella e trasferimento in provette da 1,5 mL.
    4. Centrifugare i campioni a 14.000 x g per 10 min a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari.
    5. Trasferire i surnatanti in provette di freschi e metterli su ghiaccio.
    6. Determinare la quantità di proteine con un'analisi di Bradford.
  4. Elettroforesi del gel di SDS-poliacrilammide (PAGE) e Western blotting
    1. Preparare un gel di SDS-poliacrilammide.
    2. Per ciascuna deselezionata lisato, preparare un campione di pagina di 30 µ g (per un minimo di 15 µ g) della proteina in un totale di 30 µ l di tampone di caricamento SDS. Quindi caricare quantità uguali di ogni campione (20 µ l/pozzetto) su gel di SDS-poliacrilammide e procedere per elettroforesi.
    3. Dopo l'elettroforesi, trasferire le proteine frazionate ad una membrana di macchia bassa fluorescenza PVDF utilizzando qualsiasi protocollo standard.
      Nota: Per l'analisi della proteina biotinylation, un tempo di trasferimento di 10 min con il programma "alta MW" di un veloce trasferimento semi-secco Western blotting dispositivo di solito funziona bene.
    4. Dopo il trasferimento, bloccare la membrana nel latte in polvere 5% in PBS per 30 minuti a TA.
    5. Incubare la membrana per 30 – 60 min a RT con fluorescente streptavidina coniugata 1:15,000 diluito in PBS contenente 2% BSA e 0,1% Tween-20.
    6. Lavare la membrana tre volte, ognuna per 10 min, con PBS contenente 0,1% di Tween-20 e poi una volta di più con PBS.
    7. Scansione la membrana su un sistema di imaging scanner di fluorescenza.
      Tipica macchia occidentale Nota: A è mostrata in Figura 3. La procedura di cui sopra descrive una rilevazione basata su fluorescente ma una rilevazione basata su luminescenza utilizzando streptavidina accoppiata HRP funziona altrettanto bene.

4. Split-BioID per studi di proteomica

Nota critica: Per l'analisi di spettrometria di massa finale, tutti i passaggi seguenti devono essere eseguite in condizioni prive di cheratina, tutti i materiali e i reagenti dovrebbero essere più possibile privo di cheratina.

  1. Trasfezione transiente
    1. Il giorno prima di transfezione, seme 10cm tre o quattro piastre per ogni condizione ad una concentrazione di 8 x 105 cellule di 10 mL per piastra e incubare le cellule durante la notte a 37 ° C, 5% CO2 in un'incubatrice di coltura cellulare.
    2. Il giorno successivo, è necessario preparare un mix di transfezione master per ogni condizione di transfezione: per tre piastre per patologia, 36 µ g di polyethylenimine e 18 µ g di DNA plasmidico disciolto in 900 µ l DMEM privo di siero. Incubare ogni mix master per almeno 5 minuti a TA.
    3. Nel frattempo, sostituire il mezzo di ogni piatto con mezzo fresco e quindi aggiungere 300 µ l della goccia di miscele di transfezione saggia per ogni piatto.
    4. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C, 5% CO2.
  2. Induzione e vicinanza-etichettatura
    1. Il giorno dopo la trasfezione, trasferire le cellule ai piatti di 15 cm. Per ogni piatto, rimuovere il mezzo, lavare le cellule con 7 mL di PBS, aggiungere 1,5 mL di una soluzione di tripsina-EDTA e incubare per 5 min a RT. aggiungere 3,5 mL di terreno di coltura per risospendere le cellule e trasferire la sospensione cellulare a un piatto di 15cm riempito con 20 mL di terreno di coltura completati con biotina a 50 µM per stimolare biotinylation e doxiciclina a 200 ng⋅mL− 1 (concentrazioni finali) di indurre l'espressione di proteine di fusione.
    2. Incubare le cellule per almeno 20 ore a 37 ° C, 5% CO2.
  3. Raccolta e conservazione delle cellule
    1. Lavare le cellule due volte con PBS, poi aggiungere 1,5 mL di PBS per ogni piatto e raccogliere le cellule con una scrapper.
    2. Trasferire le cellule prelevate, corrispondente a una condizione in una provetta da 15 mL e raccoglierle mediante centrifugazione a 1.200 x g, 5 min, 4 ° C.
    3. Rimuovere i surnatanti e snap congelare i pellet in azoto liquido, quindi conservare a 80 ° C fino a ulteriore elaborazione.
      Nota: In alternativa, le cellule possono anche staccate dal trypsinization, raccolte in terreno di coltura, trasferite in una provetta da 15 mL e lavare tre volte con PBS prima del congelamento.
  4. Preparazione dei lisati cellulari
    1. Risospendere il pellet di cellule in 1 mL di tampone di lisi (50mm Tris pH 7.4, 500 mM NaCl, 0,4% SDS, 5 mM EDTA, 1 millimetro DTT, 1 x inibitore della proteasi completa) a RT. Pass le cellule 10 – 20 volte (cinque-dieci colpi) attraverso un ago 25 G.
    2. Sonicare i campioni con un dispositivo di sonificazione.
      Nota: Con il dispositivo di sonificazione indicato in Tabella materiali, il seguente programma può essere utilizzato: quattro cicli ad alta intensità, 30 s per ciclo in un freddo (4 ° C) bagno d'acqua. Qualsiasi altro dispositivo di sonificazione è adatto ma parametri potrebbe essere necessario essere regolata di conseguenza.
    3. Aggiungi X-100 Triton a recuperato sonicato lisato di raggiungere una concentrazione finale di 2% (in genere, aggiungere 100 μL di 20% Triton X-100 a 900 μL sonicato lysate delle cellule) e poi 2,3 mL 50 mm Tris, pH = 7,4 per 1 mL di lisato per regolare la concentrazione di NaCl a 150 mM prima b obbligatoriodel ai branelli di streptavidina-accoppiato.
      Nota critica: Più alte concentrazioni di sale spesso provocano molto meno efficiente associazione ai talloni.
    4. Distribuire i lisati regolati in provette da 1,5 mL (ca. 1,1 mL in tre tubi) e li Centrifugare a 16.000 x g, 10 min, 4 ° C.
    5. Trasferire i surnatanti (ca. 3,2 mL) in una provetta da 15 mL e tenere 50 – 100 μL come materiale di INPUT.
    6. Misurare la concentrazione di ciascun campione con un saggio di Bradford e utilizzare l'equivalente del contenuto proteico 3 a 3,5 mg per il pulldown streptavidina.
  5. Streptavidina pulldown
    Nota: Una panoramica della procedura pulldown è mostrata in Figura 4. È quasi identico al protocollo originale pubblicato da Roux e colleghi2. La prima volta che viene eseguita il pulldown, campioni di flusso attraverso e lavare 1 – 4 possono essere messo da parte per l'analisi Western blot garantire la procedura ha funzionata correttamente (Figura 5).
    1. Per ogni condizione, è necessario trasferire 200 μL della sospensione di microsfere magnetiche streptavidina-accoppiato a una provetta da 1,5 mL. Posizionare i tubi su un rack magnetico, attendere fino a quando le perline bastone al lato dei tubi (ca. 1 minuto) e rimuovere il buffer di memoria.
    2. Lavare le perle mescolando delicatamente con 1 mL di tampone di equilibrazione (Tris 50 mM a pH 7 – 4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100 e 1 millimetro DTT).
    3. Spedire le perline equilibrate in pari quantità del numero necessario di tubi (solitamente quando si inizia con 3 – 3,5 mg di proteina contenuto, che i lisati da ogni condizione possono essere spediti in due-quattro provette da 1,5 mL) e posto indietro sulla griglia magnetica.
    4. Rimuovere il buffer di equilibrazione e Risospendere ciascun set di perline con uguali quantità dei corrispondente lisati cellulari dal punto 4.4.7. Incubare per una notte a 4 ° C su una ruota in movimento.
    5. Il giorno successivo, posizionare le provette da 1,5 mL su un rack magnetico, attendere che le perline bastone al lato dei tubi e trasferire i surnatanti etichettato come flusso attraverso un tubo da 15 mL.
      Nota: da questo momento in poi, tutti i passaggi sono eseguiti a temperatura ambiente a meno che non diversamente indicato.
    6. Risospendere le sfere in ogni provetta con 200 μL di tampone di lavaggio 1 (2% SDS in acqua) e combinare ogni set di perline sedimento corrispondente a una condizione in provette da 1,5 mL.
    7. Lavare le perle due volte per 8 min su una rotella di rotazione con 1 mL di tampone di lavaggio 1.
    8. Lavare le perle due volte per 8 min su una rotella di rotazione con 1 mL di tampone di lavaggio 2 (50 millimetri HEPES pH 7.4, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100 e 0.1% Na-desossicolato).
    9. Lavare le perle due volte per 8 min su una rotella di rotazione con 1 mL di tampone di lavaggio 3 (10 mM Tris-HCl pH 8, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40 e 0,5% Na-desossicolato).
    10. Lavare le perle due volte per 8 min su una rotella di rotazione con 1 mL di tampone di lavaggio 4 (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 50 mM NaCl, 0.1% NP-40).
    11. Per assicurarsi che il tampone di lavaggio viene completamente rimosso dopo l'ultimo passaggio di lavaggio, rimuovere la maggior parte del surnatante e poi girare giù i campioni. Rimetterle sul rack magnetico, attendere che le perline bastone al lato dei tubi e quindi rimuovere il buffer rimanente.
    12. Aggiungere 30 µ l di tampone di eluizione (Tris 10 mM pH 7.4, 2% SDS e 5% β-mercaptoetanolo 2 mM biotina) ai talloni. Incubare a 98 ° C per 15 minuti, quindi rimuovere immediatamente le perle su una griglia magnetica.
    13. Trasferire il campione eluito per una nuova provetta e conservare a-20 ° C fino a ulteriore elaborazione.
  6. SDS-PAGE e Western blotting
    Nota: Prima dell'analisi di spettrometria di massa, si consiglia di valutare il successo della biotinilazione e pulldown mediante SDS-PAGE e Western blot. Se non si osserva nessun modello di biotinilazione, si può considerare che dox o biotina non è stato aggiunto al medium o che una delle due soluzioni è compromessa.
    1. Per ogni esempio di input, è necessario preparare un campione di pagina mescolando uguali quantità di campione della proteina con il volume appropriato di tampone di caricamento SDS x 3 in un totale di 28 μL. Preparare i campioni pagina 5 µ l di ciascun campione di eluizione con 2,5 µ l di tampone di caricamento SDS x 3.
    2. Caricare i campioni (25 µ l/pozzetto per ingressi, 7 µ l/pozzetto per campioni di eluizione) su un gel di SDS-poliacrilammide. Procedere per elettroforesi e Western blotting come descritto nella sezione 3.4.
    3. Se eseguendo il pulldown per la prima volta, preparare pagina campioni per ciascuna fase del pulldown (Input, flusso attraverso, eluizione 1 – 4, Wash) mescolando 20 µ l di ciascun campione (Input, flusso attraverso, lavaggio 1 – 4) con 10 µ l di tampone di caricamento SDS o 5 µ l (eluizione) con 2,5 µ l di 3: 3x x S DS-caricamento del buffer e procedere come da punto 4.6.4 (Figura 5).
  7. SDS-PAGE per analisi MS
    Nota: Per minimizzare la contaminazione potenziale di cheratina, gel prefabbricati e buffer di caricamento del campione commerciale possono essere utilizzati.
    1. Aggiungere 6,25 μL di tampone di campione 4 x a 18,75 μL di ciascun campione di eluizione ed eseguire gli esempi su un gel di SDS 4 – 20% prefabbricati, fino a quando non migrano 2 – 3 cm nel gel.
    2. Macchia il gel con G250 blu brillante di Coomassie colloidale macchiatura13 in una capsula Petri 15 cm.
    3. Utilizzare un bisturi pulito per asportare l'intere corsie per ogni campione, escluse la band di streptavidina (in esecuzione a ca. 17 kDa, Figura 6) e trasferire le bande asportate per provette da 1,5 mL.
    4. Invia questi campioni per un impianto di proteomica per ulteriori analisi.
      Nota: MS tipici risultati possono essere visto in riferimento 9 (Figura 3 e Figura 7e tabelle supplementari). L'intero set di dati sono disponibili sul repository di orgoglio (numero di accessione PXD005005).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per illustrare il funzionamento di questo metodo, l'open reading frame (ORF) delle proteine Ago2, TNRC6C e Dicer (tutti i soggetti coinvolti nel gene miRNA-mediata del silenziamento via) sono stati clonati in plasmidi di Spalato-BioID. Ago2 è noto per interagire con TNRC6C all'interno di un indotto da miRNA silenziamento complesso (miRISC) che reprime la traduzione e stimolare il decadimento di destinazione mRNAs14. Prima di montare la miRISC, Ago2 interagire con Dicer, l'enzima che produce Mirna maturi, all'interno di un complesso in cui potrebbe ottenere caricato con un miRNA15. Spalato-BioID è stato quindi applicato alla coppia Ago2/Dicer o la coppia Ago2/TNRC6C. Per ogni coppia di proteine provate, Ago2 era sia fuso a NBirA * o CBirA * utilizzando nostro Spalato-BioID plasmidi (Figura 2) e il giocatore di dadi e TNRC6C a BirA cognate corrispondente * frammento. Inoltre, ogni proteina è stata fusa per CBirA * e accoppiato con un NBirA *-fusione di GFP come controllo negativo. In questo modo test quattro iterazioni per ogni coppia di testata della proteina (tabella 1).

Per verificare se Spalato-BioID è attivato sull'interazione della coppia di proteine provate, abbiamo seguito lo schema raffigurato in Figura 1. I plasmidi sono stati trasfettati in una linea di tet-sistema compatibile delle cellule HeLa. L'espressione delle proteine di fusione è stata indotta con doxiciclina (dox) e biotinylation è stata stimolata con l'aggiunta di biotina in eccesso al medium di crescita. A seguito di un periodo di incubazione di 20 h con dox e biotina, cellule erano lisate e analizzate mediante Western blotting con streptavidina coniugata per rilevare proteine biotinilate. In cellule di mammifero, due importanti bande musicali vengono in genere rilevati dalla streptavidina coniugata nel campione untransfected (Figura 3, stelle) e corrispondono alle proteine di biotinylated (molto probabilmente mitocondriali carbossilasi) in modo endogeno. Queste due bande sono presenti in tutti i campioni e possono essere comodamente utilizzate come carico interno controlli, quindi, la rilevazione di una proteina di pulizia per controllare il caricamento degli importi uguali di proteina è superflua. Tipico per un esperimento di BioID/Spalato-BioID, principali bande supplementari che possono essere osservate sono le proteine di fusione che ha auto-biotinilato. Anche se non sono visto senza altre proteine biotinilate, rilevazione biotinilazione delle proteine di fusione in questa fase già indica che le due proteine testate interagito nelle cellule. Nell'esperimento raffigurato in Figura 3, è chiaro che, avendo un NBirA *-proteina di fusione Ago2 accoppiata con CBirA * fusioni a TNRC6C o Dicer è più efficiente rispetto le combinazioni opposte in cui CBirA *-Ago2 è abbinato al NBirA * fusioni degli altri due proteine (Figura 3, pannello superiore, confrontare le intensità delle corsie 2-3 a corsie 6-7). Inoltre, l'attivazione era specifico come nessuno delle fusioni CBirA * potrebbe attivare il NBirA *-proteina di fusione GFP controllo a livelli apprezzabili (Figura 3, confronta i vicoli 1, 4-5 alla corsia 8 che corrisponde alle cellule untransfected). Poiché nel nostro plasmidi, NBirA * ha un tag di myc e CBirA * ha un tag di bandiera (Figura 2), i livelli di espressione di ogni proteina di fusione possono essere analizzati con gli anticorpi contro questi due tag (Figura 3, pannello inferiore).

Quando indotta da interazione biotinylation è osservato, l'esperimento può essere scalato, e le proteine biotinilate isolato su perle di streptavidina-accoppiato come indicato al paragrafo 4 del protocollo (Figura 4). Quando si esegue l'isolamento la prima volta, tutti i passaggi della purificazione possono essere analizzati da Western blotting (Figura 5). In genere, associazione ai talloni deve essere quasi quantitativa e praticamente nessuna perdita attraverso dovrebbe essere osservata nei lavaggi. Previo trattamento dei campioni per la spettrometria di massa, si consiglia di eseguire un Western blot per garantire indotto-biotinylation ha funzionato come previsto e che le proteine di fusione sono stati espressi. La mancanza di espressione di proteine di fusione è dovuto efficienza di trasfezione scadente o difettoso dox induzione. Se le proteine di fusione sono stati espressi ma nessun biotinylation è osservato, controllare se la biotina in eccesso (50 μM) è stata effettivamente aggiunta al medium e che la biotina stock è ancora attiva. Quando il materiale viene analizzato su un gel di proteina Coomassie-macchiato (Figura 6), in genere, la band più forte deve essere osservato viene eseguito al kDa circa 17 e corrisponde alla streptavidina monomerico. Bande corrispondenti alle proteine biotinilate endogeno e le proteine di fusione possono anche essere osservati. Asportiamo in genere l'area della corsia campione sopra la banda di streptavidina fino al caricamento ben (Figura 6). La band asportata può essere memorizzata in una provetta da 1,5 mL e inviata a un centro di spettrometria di massa. In alternativa, proteine rilegate possono anche essere tripsina-digerito le perline streptavidina-accoppiato e digeriti peptidi eluiti formano la colonna. Utilizziamo abitualmente i MaxQuant software16 (utilizzando principalmente i parametri predefiniti e aggiunta di lisina biotinylation come una possibile modificazione post-traduzionale, vedere riferimento 9 per ulteriori dettagli e per i risultati tipici di MS) per analizzare i dati grezzi di MS e il Perseo suite17 per la successiva analisi statistica, entrambi sono software libero. I campioni vengono in genere eseguiti in tre replicati biologici. Utilizzando quantificazione privo di etichetta, in particolare arricchito di proteine possono essere identificati in condizioni di controllo. Per filtrare in modo endogeno biotinilati proteine e proteine che non specificamente indicate per l'enzima di BirA, consideriamo solo proteine che sono significativamente sopra Risultati da sei set di dati generato con sei proteine non correlate. Inoltre, consideriamo solo i successi che si sono arricchite nel corso di un dataset di Spalato-BioID in cui le proteine di fusione NBirA * sono state sostituite da NBirA *-GFP. Altre strategie di analisi dei dati sono state proposte in particolare mediante etichettatura isotopo stabile con gli amminoacidi nella coltura delle cellule (SILAC) per proteomica quantitativa18. Inoltre, sono state descritte diverse strategie per l'isolamento diretto di biotinylated peptidi usando una variante di streptavidina con affinità indebolito a biotina18, condizioni di eluizione speciale utilizzando solventi organici19 o biotina-specifiche gli anticorpi20,21. Mentre non necessariamente conduce alla scoperta di altre proteine, l'identificazione dei siti di biotinilazione aggiungere più fiducia per quanto riguarda la specificità dei successi e utile quando si sta occupando la topologia di un'interazione.

Flusso di lavoro dell'analisi proteomica: Split-BioID, clonaggio, trasfezione, biotinilazione, MS, Western blot.
Figura 1: Panoramica della procedura Spalato-BioID. Proteina 1 interagisce con la proteina 2 come parte del complesso A o con proteina 3 come parte del complesso B. Per sondare in particolare la composizione del complesso A, Spalato-BioID può essere applicato alle proteine 1 e 2. La fotografia di uno spettrometro di massa è sotto una licenza Creative Commons Attribution-Share Alike 3.0 Unported ed è stata scaricata da https://commons.wikimedia.org con il nome del file di ThermoScientificOrbitrapElite.JPG. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Mappe plasmidiche di editing genico con siti di restrizione BamHI, MluI, ClaI; Diagramma per le configurazioni di clonazione.
Figura 2: cassette di espressione dei plasmidi Spalato-BioID. Mettiamo a disposizione quattro plasmidi per consentire la verifica di tutte le combinazioni di NBirA * e CBirA * proteine di fusione. I plasmidi e mappe complete sono disponibili presso addgene.org sotto i numeri indicati. I plasmidi hanno un elemento tet-sensible a reagire (7 x tetO) e devono essere utilizzati in una linea cellulare che è compatibile con il sistema di espressione di tet. Si noti inoltre che in tutti i plasmidi del ORFs di FKBP e FRB sono fuse alla NBirA * e CBirA * frammenti rispettivamente. Queste due proteine interagiscono solo in presenza di rapamicina e quindi i plasmidi possono essere utilizzati per testare rapidamente il sistema in presenza o in assenza di questa chimica9. I siti di restrizione indicata sono unici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati dell'elettroforesi delle proteine; analisi western blot di Dicer, TNRC6C, Ago2 con anticorpi.
Figura 3: tipico Western blot per un esperimento di Spalato-BioID. Pannello superiore: la rilevazione delle proteine biotinilate con streptavidina fluorescente contrassegnato. Pannello inferiore: rilevamento delle proteine di fusione con gli anticorpi anti--Myc e anti-FLAG. Due coppie di proteine sono state testate: Ago2/TNRC6C e Ago2/Dicer. Nelle corsie 2 & 3, Ago2 è stato aggiunto il frammento di CBirA. Nelle corsie 6 & 7, Ago2 è stato aggiunto il frammento di NBirA. Nessun segnale significativo è stato osservato quando uno qualsiasi dei tre proteine sono stato combinato con NBirA *-GFP (corsie 1, 4-5). Le stelle indicano le bande corrispondenti in modo endogeno proteine biotinilate che possono fungere da controlli di carico interno. Questa figura è adattata da figura 5B di Schopp et al. 9 sotto una licenza Creative Commons Attribuzione 4.0 internazionale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Flusso di lavoro di purificazione cellulare mediante biglie magnetiche; Risultati SDS-PAGE; Metodo di analisi delle proteine.
Figura 4: Panoramica della procedura di pulldown streptavidina. Passaggi principali per l'isolamento delle proteine biotinilate per analisi di spettrometria di massa sono raffigurati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultato della purificazione delle proteine SDS-PAGE, interazione streptavidina coniugata, gel per elettroforesi.
Figura 5: tipico Western blot per un esperimento di pulldown streptavidina. Volumi di ogni campione indicato uguali sono stati caricati su un gel di SDS-poliacrilammide. A seguito di Western blotting, proteine biotinilate sono state rilevate con streptavidina HRP-accoppiato. Bande corrispondenti a NBirA *-TNRC6C e CBirA *-Ago2 sono indicati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

SDS-PAGE gel, separazione delle bande proteiche, Split-BioID, streptavidina, marcatori di peso molecolare.
Figura 6: gel macchiato di Coomassie tipico proteina per l'analisi di spettrometria di massa. Campione eluito dalla streptavidina-accoppiato perline era caricato su un gel di proteina prefabbricati ed eseguire fino a quando il campione migrare 2-3 cm. La band principale vista al kDa circa 17 è streptavidina. L'area direttamente sopra quella banda è asportato e inviato a un centro di spettrometria di massa. Bande corrispondenti a NBirA *-TNRC6C e CBirA *-Ago2 sono indicati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Campione di transfezioneStato testato
1NBirA *-protein1 / CBirA *-protein2
2CBirA *-protein1 / NBirA *-protein2
3NBirA *-GFP / CBirA *-protein1
4NBirA *-GFP / CBirA *-protein2
5Nessun transfezione

Tabella 1: Testato in genere condizioni applicando Spalato-BioID di due proteine.

Primer di sequenziamentosequenza
Primer reverse cassetta 1 (CBirA * fusione)TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC
Primer reverse cassetta 2 (NBirA * fusione)GTGGTTTGTCCAAACTCATC

Tabella 2: Sequencing primers per i plasmidi di Spalato-BioID.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La procedura delineata descrive come clonare geni di interesse in Spalato-BioID plasmidi, come testare per biotinylation indotta da interazione e come isolare proteine biotinilate per analisi di spettrometria di massa. Descriviamo qui una procedura basata sulla trasfezione transiente. Mentre l'espressione delle proteine di fusione può essere regolato dalla quantità di dox aggiunto al medium, trasfezione transiente può portare all'espressione di proteine non omogenea con alcune cellule che iperesprimono grossolanamente le proteine di fusione rispetto all'endogena controparti. Questo può causare distorsioni dell'Interattomi corrispondente e al PPI che non rispecchiano fedelmente le interazioni che coinvolgono le proteine endogene. Così è in genere consigliabile costruire linee cellulari stabili una volta Spalato-BioID stabilita con il sistema transitorio. I plasmidi sono compatibili con il sistema di ricombinazione Flp-mediata e posizionare entrambi i geni di interesse ai sensi del regolamento dello stesso elemento tet-sensible a reagire. Se necessario e quando viene utilizzato con cellule di mammifero compatibili, consentono la facile creazione di linee cellulari stabilizzate inducibile. Ad esempio, usiamo la linea di HeLa-EM2-11 che esprime l'attivatore di trascrizione attivato da tetraciclina rtTA e un unico locus genomico indirizzabile da cui l'espressione genica di tetraciclina-mediata può essere strettamente regolato12. Utilizzare questa linea cellulare e ricombinazione Flp-mediata, linee cellulari stabili che contengono solo una copia del transgene possono essere ottenuti entro due-tre settimane. In alternativa, uno potrebbe anche utilizzare attuali tecniche di editing del genoma per introdurre i frammenti di BirA * nei nativi loci genomici dei geni di interesse.

Come in qualsiasi test che si basa sulla codifica una proteina, uno deve considerare se le proteine di fusione risultante sono funzionali. Dati disponibili nelle quali le proteine di interesse sono stata codificate (per esempio con GFP per gli studi di imaging) e funzionalmente testato sono utili per decidere se i frammenti di BirA dovrebbero essere clonato a Monte o a valle dei geni di interesse. Se tali dati non sono disponibili, uno dovrebbe testare N-terminalmente o C-terminali contrassegnati proteine in un'analisi funzionale. Ad esempio, l'attività delle proteine di fusione possa essere testato in una linea cellulare in cui la proteina endogena è stato eliminato e rispetto alla situazione di tipo selvaggio. Se le proteine di interesse tollerano entrambi i tag N - e C-terminale, entrambi devono essere testati. Infatti, in esperimenti di BioID, l'orientamento della proteina di fusione possa influenzare l'efficienza di etichettatura22. Inoltre, abbiamo osservato che quando l'applicazione di Spalato-BioID a una coppia di proteine, che delle due proteine viene aggiunto a entrambi i NBirA * o CBirA * frammento inoltre influenza l'efficienza di etichettatura9. Nei plasmidi di Spalato-BioID, l'16 amminoacido lungo glicina/serina ricco linker accoppiamento le proteine di interesse per i frammenti di BirA vennero presi da un altro PCA23 e ha lavorato per noi per tutte le proteine interagenti abbiamo testato finora. Tuttavia, si dovrebbe considerare che alcune coppie di proteine potrebbero funzionare meglio con linker più o meno lunghi. Della nota finale, un altro saggio è stato descritto dal gruppo Bollen24. In questo saggio, BirA * è diviso in un altro sito (E140/Q141) della nostra (E256/G257). Abbiamo testato entrambi sapori di Spalato-BioID side-by-side e trovato che E256/G257, descritti nel presente protocollo, porta alla riattivazione più forte quando accoppiati a due proteine interagenti9.

Generale uno svantaggio di questo metodo è la lenta velocità di etichettatura. In genere, il tempo di incubazione di 6-24 h con biotina è necessario ottenere apprezzabili biotinylation6, precludendo l'utilizzo di questa tecnica per lo studio della dinamica di rimodellamento dei complessi della proteina. Mentre questo test risolve parzialmente questo avvertimento come si attiva solo quando le due proteine interagiscono, la bassa velocità di etichettatura precludono l'uso per lo studio della risposta di processi molto dinamici o per analizzare le proteine di breve durata. La perossidasi derivati dal APEX2 è conosciuta per promuovere etichettatura efficiente delle proteine prossimale entro 1 min3. Un PCA basato su APEX2 così potrebbe affrontare le limitazioni della velocità d'etichettatura lenta di saggi BioID-derivato. Uno studio di prova-de-principio descritto un tale Spalato-APEX2 dosaggio25. Tuttavia, anche se una proteina di homodimerizing era con successo biotinilato, se l'analisi può anche essere usata per etichettare e identificare le proteine che assemblano intorno a una coppia di proteine interagenti resta da dimostrare. Molto recentemente, diretta evoluzione è stata utilizzata per creare TurboID e miniTurbo, due varianti di BirA * con attività migliorata che consentono a windows molto più breve di tempo a etichettatura, fino a 10 min26. Spalato-BioID per queste nuove varianti di adattamento estenderà ulteriormente l'uso di questa tecnica a un più ampio campo di applicazioni.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato finanziato dal Consiglio di ricerca tedesco (DFG) attraverso l'iniziativa di eccellenza tedesco (CellNetworks DFG-EXC 81) e un finanziamento parziale dal centro di ricerca in collaborazione SFB638.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acido acetico (glaciale)VWR20104.298Per fare il tampone TAE
AgarosioSigmaA9539Prendere gel di TAE-agarosio per l'analisi e l'estrazione del DNA
Soluzione di ammoniaca 25% NH3Bernd Kraft6012Per sciogliere la biotina
AmpicillinaSigmaA9518Per selezionare i batteri trasformati
Bioruptor plus dispositivo di sonificazioneDiagenodeB01020001Anche altri dispositivi di sonificazione sono ok
BiotinaSigmaB4639Da aggiungere al terreno di crescita per stimolare un'efficiente biotinilazione
Frazione di albumina sierica bovina VCarl Roth8076Utilizzato nei tamponi Western blot e uno standard proteico nei saggi Bradford
Reagente Bradford UltraExpedeonBFU05LQualsiasi altro metodo/kit per la determinazione delle proteine va bene, questo particolare reagente è più tollerante al detergente rispetto ad altri reagenti Bradford
Raschiatori cellulariTPP99002Anche qualsiasi altro modello va bene
ClaINew England BiolabsR0197Enzima di restrizione per la clonazione nei plasmidi split-BioID (fusione NBirA*)
DMEM mediumSigmaD6046Se si utilizza un'altra linea cellulare, utilizzare il corrispondente kit di miniprep del DNA del mezzo di crescita ottimale
SigmaPLN350Qualsiasi altro kit va bene anche
DoxiciclinaApplichemA2951Dox è sensibile alla luce
DTTApplichemA2948Prepara 1M soluzione stock, conservare a -20 ° C e utilizzare sempre
streptavidina coniugata DyLight 680Thermo scientific21848da utilizzare con un dispositivo di scansione LiCor Western blot
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Invitrogen65002Le perle C1 non sono rivestite di BSA, il che è preferibile per le applicazioni MS a valle (nessuna perdita di BSA nell'eluizione finale)
EDTAApplichemA5097Preparare un stock da 500 mM, regolare il pH a 8 mentre si scioglie la polvere di EDTA
EtanoloSigma32205Preparare una soluzione madre al 70% in cui la doxiciclina può essere disciolta a 10 mg.mL-1Fastgene
Gel/PCR Kit di estrazione del DNANippon GeneticsFG-91302Anche qualsiasi altro kit va bene
HCl 37%Merck1.00317.1000Per regolare il pH della soluzione madre di biotina
HEPESCarl Roth6763Preparare una soluzione madre da 500 mM, regolare il pH a 7,4
Membrana Immobilon-FL PVDF, 0,45  µ mMilliporeIPFL00010Questa membrana mostra un'autofluorescenza minima se utilizzata con un dispositivo di scansione LiCor Western blot
LiClGrü ssing GmbH12083Realizzare una soluzione stock 5M
Sistema di imaging Odyssey CLxLI-CORN/APer scansionare la membrana Western blot decorata con anticorpi marcati con fluoroforo
Polietilenimmina lineare (PEI)Polysciences23966-2Anche qualsiasi altro reagente di trasfezione va bene
Latte in polvereCarl RothT145Per bloccare le membrane Western blot
MluI-HFNew England BiolabsR3198Enzima di restrizione per la clonazione nei plasmidi split-BioID (fusione NBirA*)
Na-desossicolatoSigma30970Produrre una soluzione madre al 10% (p/v)
NaClSigma31434Produrre una soluzione madre 5M
NP-40 (sostituto Nonidet P40)Sigma74385Realizzare una soluzione madre al 20% (v/v)
PacINew England BiolabsR0547Enzima di restrizione per la clonazione nei plasmidi split-BioID (fusione CBirA*)
Soluzione salina tampone fosfato (PBS)Sigma806552Per lavare le cellule prima di rottamare
PmeINew England BiolabsR0560Enzima di restrizione per la clonazione nei plasmidi split-BioID (fusione CBirA*)
Cocktail di inibitori della proteasiRoche4693132001Aggiunto al tampone di lisi per prevenire le proteine degradazione
pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBPAddgene90003Plasmide Split-BioID, media la co-espressione di NBirA*-FKBP e CBirA*-FRB, FKBP e FRB possono essere sostituiti da altri due ORF
pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-NbirAddgene90004Plasmide Split-BioID, media la co-espressione di FKBP-NBirA* e CBirA*-FRB, FKBP e FRB possono essere sostituiti da altri due ORF
pSF3-Flag-FRB-Cbir_ Myc-NBir-FKBPAddgene90008Plasmide Split-BioID, media la co-espressione di NBirA*-FKBP e FRB-CBirA*, FKBP e FRB possono essere sostituiti da altri due ORF
pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-NbirAddgene90009Plasmide Split-BioID, media la co-espressione di FKBP-NBirA* e FRB-CBirA*, FKBP e FRB possono essere sostituiti da altri due ORF
Q5 Kit PCR ad alta fedeltàNew England BiolabsE0555SAmplificare la codifica ORF per le proteine da testare. Qualsiasi altra DNA polimerasi termostabile va bene.
Kit di legatura rapidaNew England BiolabsM2200SPer legare frammenti di DNA nei plasmidi split-BioID, qualsiasi altro sistema di legatura del DNA va bene.
RunBlue 4-20% SDS gel prefabbricatiExpedeonBCG42012Da utilizzare durante l'esecuzione di campioni per l'analisi MS
RunBlue LDS Sample BufferExpedeonNXB31010Buffer di corsa per i gel prefabbricati RunBlue
SDSSigma5030Viene fornito come una soluzione madre al 20%
siero senza tetBiowestS181Tutilizziamo siero privo di tet per ridurre al minimo l'espressione basale delle proteine di fusione
Sistema di trasferimento Trans-Blot TurboBio-Rad1704150Sistema di trasferimento Western blotting ad alta velocità, anche qualsiasi altro sistema di trasferimento va bene
TrisCarl Roth4855Realizzare soluzioni stock 1M con pH adeguato (7,4 e 8)
Triton X-100ApplichemA4975Realizzare una soluzione stock al 20% (v/v)
Tween-20Carl Roth9127Utilizzato nei tamponi Western blot, Tween 20 porta a un'elevata fluorescenza di fondo e deve essere omesso nella fase di blocco e nell'ultima fase di lavaggio
la fresca di

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