Articolo metodologico

Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un Laser del due-fotone e sua valutazione usando formazione immagine del calcio e registrazione del comportamento nelle larve di Zebrafish

DOI:

10.3791/57485

⸱

2 giugno 2018

 , 
1Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, Department of Genetics, SOKENDAI (The Graduate University for Advanced Studies)

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un protocollo per l'ablazione di una sottopopolazione geneticamente con etichetta dei neuroni da un laser del due-fotone da larve di Zebrafish.

Abstract

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Per identificare il ruolo di una sottopopolazione di neuroni nel comportamento, è essenziale per verificare le conseguenze di bloccare la sua attività in animali vivi. L'ablazione laser dei neuroni è un metodo efficace per questo scopo quando i neuroni sono etichettati in modo selettivo con sonde fluorescenti. Nello studio presente, vengono descritti i protocolli per il laser, l'ablazione di una sottopopolazione di neuroni utilizzando un microscopio a due fotoni e test delle sue conseguenze funzionali e comportamentali. In questo studio, comportamento di cattura di prede nelle larve di zebrafish è utilizzato come un modello di studio. Il circuito pretecto-ipotalamico è conosciuto per essere alla base di questa preda visivamente-driven cattura il comportamento. Zebrafish pretetto erano ablazione laser, e l'attività neuronale nel lobo inferiore dell'ipotalamo (ILH; la destinazione della proiezione pretectal) è stato esaminato. Comportamento di cattura di prede dopo ablazione pretectal inoltre è stato provato.

Introduzione

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Per capire come comportamento nasce dall'attività neuronale nel cervello, è necessario identificare i circuiti neurali che sono coinvolti nella generazione di quel comportamento. Allo stadio larvale, zebrafish fornisce un modello animale ideale per studiare la funzione del cervello connesso con il comportamento, perché i loro cervelli piccoli, trasparenti consentono di indagare l'attività di un neurone ad una risoluzione cellulare in una vasta zona della cervello osservando il comportamento1. La formazione immagine dell'attività neuronale in neuroni specifici è diventato possibile attraverso l'invenzione di indicatori codificato geneticamente c....

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Protocollo

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1. ablazione di una sottopopolazione di neuroni usando un microscopio a due fotoni Laser

Nota: Se gli utenti intenzione di eseguire l'ablazione seguente imaging Ca, utilizzare il UAShspzGCaMP6s linea21. Se gli utenti intenzione di eseguire la registrazione del comportamento dopo ablazione, utilizzare la riga di UAS:EGFP, come l'ablazione delle cellule EGFP-positive è più facile da eseguire rispetto delle cellule che esprimono GCaMP6s.

  1. Iniziare impostando l'accoppiamento di una linea di Gal4 che etichette neuroni specifici per essere studiato e UAS:EGFP o UAShspzGCaMP6s. Assicurarsi di utili....

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Risultati

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Neuroni specifici geneticamente sono stati etichettati con EGFP o GCaMP6s, la cui espressione sono stati guidati in Gal4 linee. Un gSAIzGFFM119B di linea Gal4 è stato utilizzato per etichettare un nucleo nella zona pretectal (magnocellulare nucleo pretectal superficiale) e una sottopopolazione di neuroni del bulbo olfattivo. Un'altra linea di Gal4, hspGFFDMC76A, è stata usata per etichettare il ILH. Abbiamo laser-ha rimosso i neuroni pretectal bilateralmente (Figura 2.......

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Discussione

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Anche se il laser del due-fotone ha un'ottima risoluzione spaziale per specificamente l'ablazione singoli neuroni, deve essere grande cautela per evitare danni indesiderati sul tessuto cerebrale a causa del calore. Il passo più importante nell'esperimento ablazione consiste nel determinare la quantità ottimale di irradiazione del laser. Irraggiamento insufficiente riesce a uccidere i neuroni. Troppa irradiazione sarà danno termico al tessuto circostante, che si tradurrà in effetti indesiderati. La gamma ottimale di irrad.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse al rapporto.

Ringraziamenti

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Questi studi sono stati finanziati da contributi ricevuti dal MEXT, JSPS KAKENHI Grant numeri JP25290009, JP25650120, JP17K07494 e JP17H05984.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
NuSieve GTG AgarosioLonzaCat.#50080agarosio a bassa temperatura di fusione
6 cm piastra di PetriFALCONProdotto#:351007
ago da dissezioneAS ONE CorporationCat. No. 2-013-01
https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 LSM7MPMicroscopio a scansione laser a duefotoni Carl Zeiss
W Plan-Apochromat 63x/1.0Obiettivo Carl Zeiss63X
Imager.Z1Carl Zeissun microscopio a epifluorescenza
ZENCarl Zeissper microscopi confocali
Guarnizione per camera di ibridazione Secure-Seal, 8 camere, 9 mm di diametro x 0,8 mm di profonditàSonde molecolariCatalogo # S-24732Utilizzato come camera di registrazione nelle
camere di imagingGrace Bio-LabsCoverWell PCI-A-2.5Utilizzato come camera di registrazione comportamentale
Coltello chirurgicoMANIColtello oftalmico MST15
ORCA-Flash4.0Hamamatsu Photonicsmodello: C11440-22CUuna fotocamera CMOS scientifica
HCImageHamamatsu Photonicsimage acuisition software
Modulo di registrazione su disco rigidoHamamatsu PhotonicsUn modulo software che consente di salvare i file del film su un'unità disco rigido in breve tempo
SZX7Olympusstereoscopio
DF PL 0.5XOlympusobiettivo per SZX7
Point Grigio Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 VisioFLIR Systems, Inc.N. prodotto GS3-U3-41C6NIR-CFotocamera CMOS
XIMEA xiQ FotocameraXIMEACodice prodotto. Telecamera CMOS
a luce LED ad anelloCCSModello: LDR2-100SW2-LALED
Rete di nylon 32µ mTokyo SchermoN-No.380Thttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Maglia di nylon 13µ mTokyo ScreenN-No. 508T-Khttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Metal seive 150 micron aperturaTokyo Screenhttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
Metal seive 75 micron aperturaTokyo Screenhttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOSAsahi Food & Sanità, Co. Ltd.lievito di birra secco
LabVIEWNational Instrumentsun ambiente di sviluppo integrato per la programmazione
Mai-Tai HPSpectra Physics laser a due fotoni 
Software di acquisizione immagini per imaging Ca Camere di imaging MQ042RG-CM bianco

Riferimenti

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  1. Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. Neuroscience. 296, 26-38 (2015).
  2. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K.

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Ablazione laser a due fotoniAblazione di popolazioni neuronaliAnalisi di imaging del calcioRegistrazione comportamentale in zebrafishCircuito pretecto ipotalamicoCervello di larve di zebrafishComportamento di cattura delle predeLobo inferiore dell ipotalamoMicroscopia a epifluorescenzaAcquisizione Z stack

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