Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un Laser del due-fotone e sua valutazione usando formazione immagine del calcio e registrazione del comportamento nelle larve di Zebrafish

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per l'ablazione di una sottopopolazione geneticamente con etichetta dei neuroni da un laser del due-fotone da larve di Zebrafish.

Abstract

Per identificare il ruolo di una sottopopolazione di neuroni nel comportamento, è essenziale per verificare le conseguenze di bloccare la sua attività in animali vivi. L'ablazione laser dei neuroni è un metodo efficace per questo scopo quando i neuroni sono etichettati in modo selettivo con sonde fluorescenti. Nello studio presente, vengono descritti i protocolli per il laser, l'ablazione di una sottopopolazione di neuroni utilizzando un microscopio a due fotoni e test delle sue conseguenze funzionali e comportamentali. In questo studio, comportamento di cattura di prede nelle larve di zebrafish è utilizzato come un modello di studio. Il circuito pretecto-ipotalamico è conosciuto per essere alla base di questa preda visivamente-driven cattura il comportamento. Zebrafish pretetto erano ablazione laser, e l'attività neuronale nel lobo inferiore dell'ipotalamo (ILH; la destinazione della proiezione pretectal) è stato esaminato. Comportamento di cattura di prede dopo ablazione pretectal inoltre è stato provato.

Introduzione

Per capire come comportamento nasce dall'attività neuronale nel cervello, è necessario identificare i circuiti neurali che sono coinvolti nella generazione di quel comportamento. Allo stadio larvale, zebrafish fornisce un modello animale ideale per studiare la funzione del cervello connesso con il comportamento, perché i loro cervelli piccoli, trasparenti consentono di indagare l'attività di un neurone ad una risoluzione cellulare in una vasta zona della cervello osservando il comportamento¹. La formazione immagine dell'attività neuronale in neuroni specifici è diventato possibile attraverso l'invenzione di indicatori codificato geneticamente c....

Protocollo

1. ablazione di una sottopopolazione di neuroni usando un microscopio a due fotoni Laser

Nota: Se gli utenti intenzione di eseguire l'ablazione seguente imaging Ca, utilizzare il UAShspzGCaMP6s linea²¹. Se gli utenti intenzione di eseguire la registrazione del comportamento dopo ablazione, utilizzare la riga di UAS:EGFP, come l'ablazione delle cellule EGFP-positive è più facile da eseguire rispetto delle cellule che esprimono GCaMP6s.

1. Iniziare impostando l'accoppiamento di una linea di Gal4 che etichette neuroni specifici per essere studiato e UAS:EGFP o UAShspzGCaMP6s. Assicurarsi di utili....

Risultati

Neuroni specifici geneticamente sono stati etichettati con EGFP o GCaMP6s, la cui espressione sono stati guidati in Gal4 linee. Un gSAIzGFFM119B di linea Gal4 è stato utilizzato per etichettare un nucleo nella zona pretectal (magnocellulare nucleo pretectal superficiale) e una sottopopolazione di neuroni del bulbo olfattivo. Un'altra linea di Gal4, hspGFFDMC76A, è stata usata per etichettare il ILH. Abbiamo laser-ha rimosso i neuroni pretectal bilateralmente (Figura 2.......

Discussione

Anche se il laser del due-fotone ha un'ottima risoluzione spaziale per specificamente l'ablazione singoli neuroni, deve essere grande cautela per evitare danni indesiderati sul tessuto cerebrale a causa del calore. Il passo più importante nell'esperimento ablazione consiste nel determinare la quantità ottimale di irradiazione del laser. Irraggiamento insufficiente riesce a uccidere i neuroni. Troppa irradiazione sarà danno termico al tessuto circostante, che si tradurrà in effetti indesiderati. La gamma ottimale di irrad.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
NuSieve GTG Agarosio	Lonza	Cat.#50080	agarosio a bassa temperatura di fusione
6 cm piastra di Petri	FALCON	Prodotto#:351007
ago da dissezione	AS ONE Corporation	Cat. No. 2-013-01
https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 LSM7MP	Microscopio a scansione laser a due	fotoni Carl Zeiss
W Plan-Apochromat 63x/1.0	Obiettivo Carl Zeiss		63X
Imager.Z1	Carl Zeiss	un microscopio a epifluorescenza
ZEN	Carl Zeiss		per microscopi confocali
Guarnizione per camera di ibridazione Secure-Seal, 8 camere, 9 mm di diametro x 0,8 mm di profondità	Sonde molecolari	Catalogo # S-24732	Utilizzato come camera di registrazione nelle
camere di imaging	Grace Bio-Labs	CoverWell PCI-A-2.5	Utilizzato come camera di registrazione comportamentale
Coltello chirurgico	MANI	Coltello oftalmico MST15
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	modello: C11440-22CU	una fotocamera CMOS scientifica
HCImage	Hamamatsu Photonics		image acuisition software
Modulo di registrazione su disco rigido	Hamamatsu Photonics		Un modulo software che consente di salvare i file del film su un'unità disco rigido in breve tempo
SZX7	Olympus		stereoscopio
DF PL 0.5X	Olympus		obiettivo per SZX7
Point Grigio Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio	FLIR Systems, Inc.	N. prodotto GS3-U3-41C6NIR-C	Fotocamera CMOS
XIMEA xiQ Fotocamera	XIMEA	Codice prodotto.	Telecamera CMOS
a luce LED ad anello	CCS	Modello: LDR2-100SW2-LA	LED
Rete di nylon 32µ m	Tokyo Schermo	N-No.380T	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Maglia di nylon 13µ m	Tokyo Screen	N-No. 508T-K	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Metal seive 150 micron apertura	Tokyo Screen		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
Metal seive 75 micron apertura	Tokyo Screen		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOS	Asahi Food & Sanità, Co. Ltd.		lievito di birra secco
LabVIEW	National Instruments		un ambiente di sviluppo integrato per la programmazione
Mai-Tai HP	Spectra Physics		laser a due fotoni

Software di acquisizione immagini per imaging Ca Camere di imaging MQ042RG-CM bianco