Qui, presentiamo lo screening preclinico di cumarine anticancro utilizzando zebrafish e cultura 3D.
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Articolo metodologico
Valutazione preclinica della bioattività dell'OT48 di cumarina anticancro di sferoidi, Colony Assays formazione e xenotrapianti di Zebrafish
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo screening pre-clinico in vitro e in vivo di nuovi agenti terapeutici sono uno strumento essenziale nella scoperta della droga di cancro. Anche se linee cellulari tumorali umane rispondono ai composti terapeutici nelle colture delle cellule dello strato monomolecolare (dimensionali) 2D, 3D cultura sistemi sono stati sviluppati per comprendere l'efficacia delle droghe nei modelli più fisiologicamente rilevanti. Negli ultimi anni, un cambiamento di paradigma è stata osservata in ricerca pre-clinica per convalidare la potenza di nuove molecole in sistemi di coltura 3D, più precisamente che imita il microambiente tumorale. Questi sistemi caratterizzano lo stato di malattia in un modo più fisiologicamente rilevante e aiutano ad per acquisire meglio meccanicistico conoscenza e la comprensione della potenza farmacologica di una data molecola. Inoltre, con l'attuale tendenza al miglioramento in vivo modelli del cancro, zebrafish è emerso come un importante modello di vertebrati di valutare in vivo la formazione del tumore e di studiare l'effetto degli agenti terapeutici. Qui, abbiamo studiato l'efficacia terapeutica di hydroxycoumarin OT48 da solo o in combinazione con BH3 mimetics nella linea cellulare di cancro del polmone delle cellule A549 utilizzando tre sistemi differenti della coltura 3D tra cui saggi di formazione di Colonia (CFA), analisi di formazione della sferoide (SFA) e in vivo gli xenotrapianti zebrafish.
Introduzione
Il cancro è causato da mutazioni cellulari e di conseguenza pathway biochimici sono interrotti innescando la divisione cellulare incontrollata e resistenza alla morte cellulare. I tumori interferiscano con funzioni fisiologiche dell'apparato digerente, nervoso, circolatorio e successivamente vicini tessuti1. Nonostante gli sforzi di ricerche approfondite, il cancro rimane la malattia pericolosa più diffusa nel mondo2. Medicina di precisione è stato riconosciuto come il fondamento della terapeutica del cancro futuro. Nuove entità molecolari sono testate regolarmente in combinazione con farmaci già esistenti per migliorare....
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Protocollo
1. colony formazione Assays
- Cellulari cellule A549 cultura ad una concentrazione di 20.000 cellule/cm2 a 15 mL di RPMI1640 cultura supplementato con 10% FBS (siero fetale bovino) e 1% antibiotici in un pallone da2 cm 75 in incubatore a CO2 a 37 ° C e 5% CO2.
- Il giorno dell'esperimento, determinare la concentrazione di cellule utilizzando un emocitometro. Raccogliere 50.000 cellule mediante centrifugazione a 400 x g per 7 min in una microcentrifuga da 1,5 mL e risospendere le cellule in 100 µ l di 1 x sterile PBS (Phosphate Buffered Saline) in provette da 1,5 mL.
- Dispensare 1,1 mL di mez....
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Risultati
Nella Figura 2, il cancro del polmone delle cellule linea A549 è stato seminato in MCBM di formare le colonie dopo il trattamento con OT48 da solo o in combinazione con BH3 mimetico A1210477 alle concentrazioni indicate. I risultati hanno mostrato che la combinazione significativamente ridotto numero, dimensione e superficie totale delle colonie dopo 10 giorni di incubazione.
Nella
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Discussione
I tassi di formazione della Colonia ottenuti con MCBM dipende dal tipo delle cellule. Di solito, per cellule non aderenti, il numero di colonie è molto superiore rispetto a cellule aderenti. Abbiamo osservato che le cellule A549 formano colonie di 30 a 40 dopo 10 giorni. Precedentemente abbiamo segnalato per le cellule di leucemia differenti che il numero di colonie è compreso tra 200-2509. I nostri risultati hanno mostrato che OT48 da solo non ha prodotto una diminuzione significativa del numero .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ricerca presso SNU è sostenuta da Fondazione nazionale per la ricerca (NRF) MEST di Corea per concessione di tumore microambiente Global Core Research Center (GCRC), [numero di grant 2011-0030001]; da la Seoul National University Research Grant e dal cervello Corea (BK21) oltre a programma.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiali necessari per i saggi di formazione delle colonie | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 gradi |
| FBS | Biowest | S1520-500-20 | C° |
| Penicillina-Streptomicina | Lonza | 17-602E-20 | C° |
| Pallone per colture cellulari T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS soluzione | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Provetta da 1,5 ml | Extragene | Tube-170-C | RT |
| Provetta da 15 ml | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| Piastra a 12 pozzetti | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230-20 | C° |
| Bromuro di Tetrazolio Blu Tiazolico (polvere MTT) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| strong>Materiali necessari per il test di formazione degli sferoidi | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 gradi |
| FBS | Biowest | S1520-500-20 | C° |
| Penicillina-streptomicina | Lonza | 17-602E-20 | C° |
| Pallone per colture cellulari T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS soluzione | Hyclone | SH30256,02 | RT |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra basso attachemnt 96 pozzetti | piastra Corning | 3474 | RT |
| Microscopia | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| strong>Materiali necessari per xenotrapianti di zebrafish | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 gradi |
| FBS | Biowest | S1520-500-20 | C° |
| Penicillina-streptomicina | Lonza | 17-602E-20 | C° |
| Pallone per colture cellulari T25 | SPL | 70025 | RT |
| Pallone per colture cellulari T75 | SPL | 70075 | RT |
| Pallone per colture cellulari T175 | SPL | 71175 | RT |
| Provetta da 1,5 ml | Extragene Tube-170-C | RT | |
| Piastra a 24 pozzetti | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| Soluzione PBS | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Cloruro di potassio (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Nitrato di calcio tetraidrato (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| Soluzione | HEPES Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Etil 3-amminobenzoato metanosolfonato (Tricaina) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Soluzione di fenolo rosso | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Metilcellulosa | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-fenil-2-tiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil colorante | Invitrogen | C7001-20 C° | |
| Capillare in vetro | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Estrattore per micropipette | Strumento otturatore, USA | Iniettore P-97 | RT |
| Micro | World Precision Instruments | Siringa PV820 | RT |
| KOVAX | 1ml | ||
| RT Micro caricatore | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Vetrino | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Microscopia a fluorescenza | Leica | DE/DM 5000B | RT |
Riferimenti
- Giancotti, F. G. Deregulation of cell signaling in cancer. FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Santo, V. E., et al.
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Ristampe e permessi
