Amministrazione semplice ed efficace e la visualizzazione di microparticelle nell'apparato circolatorio di piccoli pesci mediante l'inserimento di rene

Summary

Questo articolo illustra i principi di un'iniezione rapida, come minimo dilagante di microparticelle fluorescenti in circulatory system di piccoli pesci e la visualizzazione in vivo delle microparticelle in sangue di pesce.

Abstract

La somministrazione sistemica di particelle micro-dimensione in un organismo vivente può essere applicata per la visualizzazione del sistema vascolare, droga e distribuzione del vaccino, l'impianto di cellule transgeniche e piccoli sensori ottici. Tuttavia, microiniezioni endovenosa in piccoli animali, che sono principalmente utilizzati nei laboratori biologici e veterinari, sono molto difficili e richiedono personale qualificato. Qui, dimostriamo un metodo robusto ed efficiente per l'introduzione di microparticelle nell'apparato circolatorio di adulto zebrafish (Danio rerio) tramite l'iniezione nel rene pesce. Per visualizzare le microparticelle introdotte nel sistema vascolare, vi proponiamo una semplice tecnica di imaging videomicroscopia nelle branchie di pesce. In vivo monitoraggio del pH del sangue di zebrafish è stato compiuto usando un fluorescente microincapsulati iniettato sonda, SNARF-1, per dimostrare una delle possibili applicazioni della tecnica descritta. Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata di incapsulamento di pH sensibili colorante e dimostra i principi dell'iniezione rapida e la visualizzazione di microcapsule ottenute per registrazione in vivo del segnale fluorescente. Il metodo proposto di iniezione è caratterizzato da un tasso di mortalità basso (0-20%) e ad alta efficienza (70-90% di successo) ed è facile da Istituto utilizzando attrezzature comunemente disponibili. Tutte le procedure descritte possono essere eseguite su altre specie di piccoli pesci, come i guppies e medaka.

Introduction

La somministrazione di particelle micro-dimensione in un organismo animale è un compito importante in tali zone come droga e vaccino consegna¹, sistema vascolare visualizzazione², cellula transgenica impianto³e l'impianto piccolo sensore ottico ^{4 , 5}. Tuttavia, la procedura di impianto per le particelle di Microscala nel sistema vascolare di piccoli animali da laboratorio è difficile, soprattutto per gli organismi acquatici delicati. Per campioni di ricerca popolari come zebrafish, è consigliabile che queste procedure essere chiarita media....

Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono stati condotti in conformità con la direttiva europea 2010/63/UE per gli esperimenti sugli animali e sono state approvate da animale soggetti ricerca comitato di Istituto di biologia all'Università statale di Irkutsk.

1. fabbricazione di microcapsule

Nota: Microcapsule che trasportano una tintura fluorescente sono preparati utilizzando un assembly di strato dopo strato di carica opposta polielettroliti^7,8. Tutte le procedure sono state effettuate a temperatura ambiente.

1. Per sintetizzare poroso CaCO₃

Results

I risultati ottenuti provengono da una delle tre principali categorie del protocollo presentato: la formazione di microparticelle fluorescenti di incapsulamento di un colorante fluorescente (Figura 1), l'iniezione di rene di microcapsule con ulteriore visualizzazione in Gill capillari (Figura 2 e 3) e, infine, la in vivo spettrale registrazione della fluorescenza di SNARF-1 per il monito.......

Discussion

Per dimostrare l'iniezione di microparticelle in zebrafish rene, abbiamo usato semipermeabile microcapsule caricati con un colorante indicatore. Così, il protocollo contiene le istruzioni per la fabbricazione di microcapsule usando l'Assemblea strato dopo strato di carica opposta polielettroliti^{7,8,15,16,17 ,18} (

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SNARF-1-destrano, 70000 MW	Thermo Fisher Scientific	D3304	Sonda fluorescente. Qualsiasi altro colorante fluorescente legato al polimero appropriato può essere utilizzato come riempitivo per microcapsule
Coniugato di isotiocianato di albumina-fluoresceina (FITC-BSA)	SIGMA	A9771	Sonda fluorescente
Isotiocianato di rodamina B-destrano (RITC-destrano)	SIGMA	R9379	Sonda fluorescente
Cloruro di calcio	SIGMA	C1016	Formazione
di modelli CaCO3Carbonato di sodio	SIGMA	S7795	CaCO3 modelli
formazione Poli(allilammina cloridrato), MW 50000 (IPA)	SIGMA	283215	Polimero cationico
Poli(sodio 4-stirensolfonato), MW 70000 (PSS)	SIGMA	243051	Polimero anionico
Poli-L-lisina [20 kDa] innestato con polietilenglicole [5 kDa], g = da 3,0 a 4,5 (PLL-g-PEG)	SuSoS	PLL(20)- g[3.5]-PEG(5)	Polimero finale per aumentare la biocompatibilità delle microcapsule
Cloruro di sodio	SIGMA	S8776	Per sciogliere i polimeri applicati Sistema
purificazione dell'acqua	Millipore	SIMSV0000	Per preparare acqua deionizzata
Agitatore magnetico	Stegler		Per la formazione
di modelli CaCO3Eppendorf  Ricerca  più pipetta, 1000 & micro; L	Eppendorf		Soluzioni di dosaggio
Eppendorf  Ricerca  più pipetta, 10 & micro; L	Eppendorf		Soluzioni di dosaggio
Puntali per pipette, gamma di volume da 200 a 1000 &; L	F.L. Medical	28093	Soluzioni di dosaggio
Puntali per pipette, gamma di volume 0,1-10  μ L	Eppendorf	Z640069	Soluzioni di dosaggio
Mini-centrifuga Microspin 12, BioSan			Per la procedura di centrifugazione-lavaggio delle microcapsule
Provette per microcentrifuga, 2 mL	Eppendorf	Z666513	Sintesi e conservazione delle microcapsule
Agitatore Intelli-mixer RM-1L	ELMY Ltd.		Per ridurre l'aggregazione delle microcapsule
Pulitore			ad ultrasuoni Per ridurre l'aggregazione delle microcapsule
Cuffie			Per proteggere le orecchie dagli ultrasuoni
Acido etilendiamminotetraacetico	SIGMA	EDS	Per sciogliere i modelli CaCO3
Fosfato monosodico	SIGMA	S9638	Preparazione di tamponi pH
Fosfato disodico	SIGMA	S9390	Preparazione di tamponi pH
Idrossido di sodio	SIGMA	S8045	Per regolare il pH della soluzione di EDTA e dei tamponi
Camera termostatica			Per essiccare le microcapsule su un vetrino di vetro
		la conta delle cellule del sangue dell'emocitometro	Per studiare la distribuzione dimensionale e la concentrazione delle microcapsule preparate
Microscopio a fluorescenza Mikmed 2	LOMO		Visualizzazione in vivo delle microcapsule nel sangue
dei pesciSet di filtri fluorescenti per SNARF-1 (da scegliere in base al modello di microscopio; l'esempio è fornito)	Chroma	79010	Visualizzazione di microcapsule con sonde fluorescenti
Spettrometro a fibra QE Pro	Ocean Optics		Calibrazione di microcapsule al microscopio
Fibra ottica QP400-2-VIS NIR, 400 μ m, 2 m	Ocean Optics	Per collegare lo spettrometro con la
Collimatore F280SMA-A	Thorlabs		Per collegare lo spettrometro con la porta del microscopio
Vetrino per microscopio	Fisherbrand	12-550-A3	Calibrazione di microcapsule al microscopio
Vetrini coprioggetti, 22 x 22 mm	Pearl	MS-SLIDCV	Calibrazione di microcapsule al microscopio
Microcapillari in vetro Intra MARK, 10 µ L	Blaubrand	BR708709	Per raccogliere il sangue di pesce
Olio di chiodi di garofano	SIGMA	C8392	Anestesia di pesce
Lancetta n. 11	Apexmed international BV	P00588	Per tagliare la coda di pesce e rilasciare l'ago d'acciaio dalla punta dell'autoiniettore di insulina
Eparina, 5000 U/mL	Calbiochem	L6510-BC	Per il trattamento di tutte le superfici che vengono a contatto con il sangue di pesce durante la raccolta del sangue di pesce
Seven, 2 Go Pro pH-meter con un microelettrodo	Mettler Toledo		Per determinare il pH del sangue di pesce
Aghi per penna per insulina Micro-Fine Plus, 0,25 x 5 mm	Becton, Dickinson and Company		Per la procedura di iniezione. Qualsiasi ago sottile (Ø 0,33 mm o meno) è appropriato
Capillari di vetro, 1 x 75 mm	Hirschmann Laborgerä te GmbH & Co	9201075	Per la procedura di iniezione
Torcia			a gas Per saldare l'ago d'acciaio al capillare di vetro
Microiniettore IM-9B	NARISHIGE		Per il dosaggio preciso di microcapsule in sospensione
Piastre di Petri, 60 mm x 15 mm, polistirene	SIGMA	P5481	Per manipolazioni con pesci sotto anestesia
Cucchiaio			di plasticaPer manipolazioni con pesci in anestesia
Spugna			Per manipolazioni con pesci in anestesia
Forbici da dissezione	Thermo Scientific	31212	Per rimuovere il coperchio branchiale dalla testa del pesce
Pipetta Pasteur, 3,5 mL	MARCA	Z331767	Per inumidire le branchie dei pesci