Articolo metodologico

Generazione di cellule epiteliali nasali umane sferoidi per studio di regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica individualizzato

DOI:

10.3791/57492

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11 aprile 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Pulmonary Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

In questo articolo

Sommario

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Qui descriviamo un metodo per generare colture sferoide tridimensionale di cellule epiteliali nasali umane. Sferoidi quindi sono stimolati a regolatore di conduttanza del Transmembrane fibrosi cistica (CFTR) in auto-dipendente dello ione e secrezione fluida, quantificare il cambiamento nella dimensione del luminal sferoide come proxy per funzione CFTR.

Abstract

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Mentre l'introduzione di farmaci modulatore regolatore di conduttanza del Transmembrane fibrosi cistica (CFTR) ha rivoluzionato la cura nella fibrosi cistica (CF), il modello di terapia genotipo-diretta attualmente in uso presenta diverse limitazioni. Gruppi di mutazione prima, rare o understudied sono esclusi dagli studi clinici definitivi. Inoltre, come farmaci aggiuntivi modulatore entrino sul mercato, sarà difficile ottimizzare le scelte di modulatore per un singolo soggetto. Entrambe le questioni sono affrontate con l'uso di sistemi modello preclinico paziente-derivato, individualizzato di funzione CFTR e modulazione. Cellule epiteliali nasali umane (HNEs) sono una fonte facilmente accessibile del tessuto respiratorio per tale modello. Qui, descriviamo la generazione di un modello tridimensionale della sferoide di funzione CFTR e modulazione utilizzando HNEs primario. HNEs sono isolati da soggetti in modo minimamente invasivo, ampliato in condizioni di riprogrammazione condizionale e seminato nella cultura della sferoide. Entro 2 settimane dalla semina, culture sferoide generano sferoidi HNE che possono essere stimolate con 3', 5'-adenosina monofosfato ciclico (cAMP)-generazione di agonisti per attivare la funzione CFTR. Gonfiore della sferoide è poi quantificato come proxy dell'attività CFTR. Sferoidi HNE capitalizzano l'origine come minimo dilagante, eppure respiratorio delle cellule nasali per generare un modello personalizzato, accessibile pertinente ad un epitelio che riflette la mortalità e la morbosità di malattia. Rispetto per le culture HNE interfaccia aria-liquido, sferoidi sono relativamente veloce per maturare, che riduce il tasso di contaminazione globale. Nella sua forma attuale, il modello è limitato dalla bassa velocità effettiva, anche se questo è compensata dalla relativa facilità di acquisizione del tessuto. Sferoidi HNE possono essere utilizzati per quantificare e caratterizzare l'attività CFTR a livello individuale in modo affidabile. Uno studio in corso per legare questa quantificazione di risposta ai farmaci in vivo stabilirà se sferoidi HNE sono un vero preclinico preannunciatore della risposta del paziente alla modulazione di CFTR.

Introduzione

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La fibrosi cistica (CF) è una malattia fatale, autosomica recessiva riguardano oltre 70.000 persone in tutto il mondo1. Questa malattia genetica di vita-riduzione è causata da mutazioni nella conduttanza del Transmembrane di fibrosi cistica regolatore della proteina (CFTR)2. CFTR è un membro della famiglia vassoio Trifosfato di adenosina-legante e funzioni come un canale ionico che permette il movimento del cloruro e bicarbonato attraverso le membrane apicali di epiteli polarizzati multiple compreso il tratto gastrointestinale, della ghiandola di sudore, respiratorio e albero, tra gli altri3,4. Come tale, disfunzionale CFTR conduce alla disfunzione epiteliale multisistemica, con maggior mortalità derivante dalla malattia respiratoria1. Nel polmone CF, perdita di CFTR-driven delle vie respiratorie superficie liquida (ASL) regolamento e muco rilascio porta a muco ispessito, ostruzione delle vie respiratorie, infezione cronica e rimodellamento delle vie respiratorie progressiva e perdita di funzione polmonare1,5.

Nonostante l'identificazione della disfunzione CFTR come la causa della malattia, terapie in CF tradizionalmente focalizzato sulla mitigazione dei sintomi (ad esempio, la terapia sostitutiva enzimatica pancreatica, terapie di clearance delle vie aeree)1. Questo approccio è stato recentemente rivoluzionato dall'avvento di nuove terapie, definita "Modulatori CFTR," che incidono direttamente CFTR disfunzionale. Questo approccio ha spostato il paesaggio clinico da gestione dei sintomi a modificante la malattia cura ma comporta diverse limitazioni6,7,8,9,10. Attività di modulatore è specifico per il difetto di proteina che accompagna ogni mutazione CFTR e limitato a selezionare popolazioni genetiche11. Questa limitazione è guidata dalla natura eterogenea dei difetti di proteina, ma anche dall'impraticabilità delle sperimentazioni cliniche in gruppi di rara mutazione. Inoltre, fra gli oggetti con ben studiati genotipi (ad es., CFTR F508del/F508del, la più comune mutazione CFTR), c'è ampia variabilità nella malattia onere e modulatore risposta6,7,8 ,9,11.

Per risolvere entrambi i problemi, gli investigatori hanno proposto l'utilizzo di modelli personalizzati per test preclinici12. Questo concetto utilizza tessuto paziente-specifico per generare un sistema individualizzato ex vivo modello per test composto, predizione in vivo soggetto risposta alle terapie in modo personalizzato. Una volta convalidato, un tale modello potrebbe essere utilizzato dai clinici alla terapia di precisione di unità indipendentemente dal genotipo CFTR sottostante del paziente.

Cellule epiteliali bronchiali umane (HBE) ottenute da espianto dei tessuti al momento del trapianto di polmone stabilito la possibilità di un tale modello per CF13,14. HBEs cresciuta a un'interfaccia aria-liquido (ALI) permettono per la quantificazione di CFTR funzionale direttamente attraverso la prova electrophysiologic o indirettamente attraverso misure di ASL omeostasi13,15. Questo modello è stato fondamentale per comprendere la biologia CFTR e fu un fattore chiave nello sviluppo di CFTR modulatori16. Purtroppo, i modelli HBE non sono tenable come un modello personalizzato a causa della invasività di acquisizione (trapianto di polmone o spazzolatura bronchiale) e la mancanza di campioni per quelli con mutazioni rare o malattia delicata. Viceversa, tessuto intestinale, ottenuto da campioni di biopsia rettale o duodenale, possa essere utilizzato per la misura di corrente intestinale (ICM) o un'analisi basata su gonfiore organoid allo studio individualizzato CFTR funzione17,18, 19. Organoid saggi, in particolare, sono molto sensibili modelli del CFTR attività20,21,22. Entrambi i modelli sono limitati dalla fonte di tessuto (tessuto intestinale, mentre la maggior parte delle patologia di malattia respiratoria) e il metodo semi-invasivo di acquisizione. In alternativa, parecchi ricercatori hanno studiato nasale cellule epiteliali umane di (HNE) al modello CFTR restauro23,24,25. HNEs possono essere raccolte in modo sicuro a pennello o il curettage in soggetti di qualsiasi età e, quando coltivate in ALI, ricapitolare molte caratteristiche del HBEs25,26,27,28. Colture monostrato HNE tradizionalmente sono stati limitati da trasformazione squamose e molto tempo a maturità29. Inoltre, riferito di cortocircuito misure di corrente in HNEs sono più piccole di quelle in HBEs, suggerendo una finestra più piccola per rilevare l'efficacia terapeutica25.

Data la necessità di un modello di coltura del tessuto personalizzato, non invadente, respiratorio della funzione CFTR, abbiamo cercato di unire la sensibilità di un dosaggio di organoid gonfiore-base, con la natura non invasiva e respiratoria di HNEs. Qui, descriviamo il nostro metodo di generazione di culture 3-dimensionale "sferoide" di HNEs per lo studio individualizzato di CFTR in un' analisi basata a gonfiore30. Sferoidi HNE polarizzano attendibilmente con l'apice epiteliale verso il centro della sfera, o lumen. Questo modello ricapitola le caratteristiche numerose di un epitelio respiratorio inferiore e fa maturare più velocemente di culture di ALI. Come un'analisi funzionale, sferoidi HNE quantificano in modo affidabile una funzione gamma di CFTR, come pure la modulazione in gruppi ben studiata mutazione (ad es., CFTR F508del). Questo test basati su gonfiore capitalizza le proprietà di trasporto di ioni/sale di CFTR, indirettamente di misurazione fluido afflusso nella sferoide come acqua segue efflusso sale apicale. In questo modo, stimolati sferoidi con CFTR completamente funzionale si gonfiano robustamente, mentre quelli con CFTR disfunzionale si gonfiano meno o ridursi. Questo viene quantificato attraverso analisi d'immagine di pre- e sferoidi di post-stimolazione 1h, misurazione area luminal e determinare la percentuale di cambiamento. Questa misura può essere confrontata attraverso gruppi sperimentali a schermo per bioattività di droga in modo specifico per ogni paziente.

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Protocollo

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Campioni HNE sono stati acquistati da soggetti reclutati attraverso Hospital Medical Center CF Research Center di Cincinnati Children. Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati da istituzionale Review Board (IRB) di Cincinnati Children ' s Hospital Medical Center. Consenso scritto è stato ottenuto da tutti i soggetti prima della prova.

1. preparare espansione Media e Media Antibiotico

  1. Raccogliere i componenti multimediali elencati nella tabella 1. Scongelare i surgelati materiali a temperatura ambiente e rendono necessarie soluzioni di riserva, come indicato nella tabella 1 sotto "Espansione Media".
    Nota: Prestare attenzione quando si maneggia la tossina del colera, che è tossico se ingerito ed è una pelle, occhi e irritante delle vie respiratorie. Rendere e combinare tutte le soluzioni e media in condizioni pulite nella cappa di biosicurezza.
  2. Utilizzando una pipetta sierologica 50ml, rimuovere ed eliminare 50 mL di terreno base (Dulbecco per volta Eagle Medium/F12) da un contenitore per compensare l'aggiunta di altri materiali. Versare tutti i supporti di base a mano in un flacone di vetro 1 L in autoclave.
  3. Utilizzando una pipetta sierologica 50ml o pipetta da 1 mL a seconda dei casi, trasferire tutti i componenti rimanenti dalla sezione "Espansione Media" della tabella 1 nella bottiglia di vetro sterilizzati nell'autoclave contenente il supporto. Agitare delicatamente la bottiglia a mano per mescolare.
  4. Materiali filtranti in un fresco, sterile 1 L, 0,22 µm beuta per filtrazione in polietersulfone (PES) utilizzando le istruzioni del produttore e annotare con "Espansione Media" e la data.
  5. Preparare i supporti antibiotici. Rendono necessarie soluzioni stock antibiotici come indicato nella tabella 1 sotto "Antibiotico Media."
    1. Utilizzando una pipetta sierologica 50ml, trasferimento 150ml di espansione Media a una bottiglia di vetro sterilizzati nell'autoclave fresca 250 mL.
    2. Utilizzando una pipetta da 1 mL, aggiungere tutti i componenti dalla sezione "Antibiotico Media" della tabella 1 al flacone di vetro sterilizzati nell'autoclave contenente i media. Ricciolo a mano per mescolare fino a quando il supporto è uniforme in apparenza.
    3. Materiali filtranti in un fresco, sterile 250 mL, beuta per filtrazione a PES 0,22 µm utilizzando le istruzioni del produttore e annotare con "Antibiotico Media" e la data.
  6. Conservare i supporti a 4 ° C fino ad un mese, scartando se nuvoloso, suggerendo la contaminazione.

2. preparare i supporti di differenziazione

  1. Raccogliere i componenti multimediali elencati nella tabella 2. Scongelare i surgelati materiali a temperatura ambiente e rendono necessarie soluzioni di riserva, come indicato nella tabella 2.
    Nota: Prestare attenzione quando si maneggia l'acido retinoico, che è una tossina riproduttiva, può essere tossica se ingerito e provoca irritazione cutanea. Rendere, aliquotare e combinare tutte le soluzioni e media in condizioni pulite nella cappa di biosicurezza.
  2. Rimuovere e scartare 52 mL di terreno base da un contenitore per compensare l'aggiunta di altri materiali. Versare tutti i supporti di base in un flacone di vetro 1 L in autoclave.
  3. Utilizzando una pipetta sierologica 25 mL o pipetta 1 mL a seconda dei casi, trasferire tutti i componenti rimanenti dalla tabella 2 per la bottiglia di vetro sterilizzati nell'autoclave contenente il supporto e agitare delicatamente a mano per mescolare.
  4. Materiali filtranti in un fresco, sterile 1 L, 0,22 µm beuta per filtrazione in polietersulfone (PES) utilizzando le istruzioni del produttore e annotare con "Differenziazione Media" e la data.
  5. Conservare i supporti a 4 ° C fino ad un mese, scartando se nuvoloso, suggerendo la contaminazione.

3. cappotto cultura piatti e piastra alimentatore fibroblasti

Nota: Eseguire tutti i passaggi sotto condizioni di pulizia nella cappa di biosicurezza.

  1. Mescolare 0,5 mL di brodo di collagene e 37,5 mL di acqua sterile in una provetta conica da 50 mL.
  2. Pipettare 4-5 mL di soluzione di collagene in ogni piatto pulito di cultura P100, assicurando che l'intera superficie è coperta.
  3. Coprire i piatti con i coperchi e incubare per una notte a 37 ° C e 5% CO2.
  4. Nella cappa di biosicurezza, rimuovere tutti i coperchi di piatto. Agitare la soluzione per coprire il piatto, poi aspirare.
  5. Sterilizzare l'esposizione ai raggi ultravioletti (UV) luce per 1 h. posto coperchi torna sui piatti, piatti dello stack e coprire con carta stagnola.
  6. Piatti di archivio rivestito a 4 ° C per 3-6 mesi, ri-sterilizzazione UV luce 15-30 minuti prima dell'uso della coltura delle cellule.
  7. 24 h prima di ottenere un campione HNE, sterilizzare un piatto prepatinato ed etichetta come dei fibroblasti embrionali del Mouse (MEF) e la data.
  8. Aggiungere il supporto di espansione per coprire la piastra (circa 5 mL) con una pipetta sierologica.
  9. Scongelare una fiala di MEFs di 2 x 106 irradiati in un bagnomaria a 37 ° C. Non appena il MEFs vengono scongelati, aggiungere metà del flaconcino (circa 106 cellule) al piatto con una pipetta 1 mL, agitando a mano per disperdere.
  10. Incubare a 37 ° C e 5% di CO2 durante la notte in preparazione per la cultura HNE.
    Nota: Se necessario, passaggi 3,7-3.10 possono essere eseguita in ritardo quanto 60 min prima celle di placcatura, però durante la notte è l'ideale.

4. ottenere ed elaborare HNE campione

  1. Assicurarsi di consenso/assenso approvato IRB è ottenuto per tutti i soggetti.
  2. Avere naso paziente colpo per eliminare il muco sciolto.
  3. Visualizzare utilizzando un rhinoscope turbinate inferiore. Garantire lesioni o polipi non sono presenti che possono precludere la raccolta del campione.
  4. Raccogliere le cellule nasale dalla narice prima dal curettage o spazzolatura.
    1. Il curettage: Curette di piegare al suo punto medio per creare un lieve, ~ 135° angolo con l'apice dalla Coppa del curette. Inserire la curette nella narice e avanzare la Coppa curette sotto il turbinato inferiore. Premere la Coppa curette contro il inferior turbinate delicatamente e raschiare il turbinato tirando la curette avanti, ripetuta 3 - 4 volte totale.
    2. Pennello: Pass la citologia della spazzola sotto il inferior turbinate, quindi ruotare e spostare il pennello e out leggermente 4 - 5 volte, senza chiudere la narice.
  5. Posto curette/pennello in un 15 mL conica riempiti di antibiotici Media. Ripetere i passaggi da 4.3-4.4 per l'altra narice, ponendo il curette/spazzola nella stessa provetta conica.
  6. Archivio conico su ghiaccio fino al momento per l'elaborazione. Garantire che il trattamento si verifica all'interno di 4 h di acquisizione del campione, ma può verificarsi più tardi 24 ore dopo l'acquisizione, se necessario.

5. elaborare ed espandere cellule HNE in piatti

Nota: Eseguire tutti i passaggi sotto condizioni di pulizia nella cappa di biosicurezza.

  1. Utilizzando una pipetta 1 mL e media dal campione conico, lavare tutte le celle al largo di Curette/spazzoline nella stessa provetta conica. Una volta pulito, scartare Curette / brushes.
  2. Centrifugare conica a 360 x g e a 4 ° C per 5 min.
  3. Aspirare il surnatante, facendo attenzione a non per disturbare il pellet cellulare.
  4. Risospendere il pellet cellulare in 3 mL di soluzione di distacco delle cellule, pipettaggio con una mancia di 1 mL per omogeneizzare la miscela.
  5. Centrifugare conica a 360 x g e a 4 ° C per 5 min.
  6. Ripetere i passaggi da 5.3-5.5 una volta.
  7. Aspirare il supernatante rimanenti, avendo cura di non per disturbare il pellet cellulare.
  8. Risospendere il pellet in 1 mL di antibiotico Media e numero di celle con un emocitometro.
  9. Utilizzando una pipetta 1 mL, piastra cellule goccia a goccia sul piatto rivestito, testa di serie del fibroblasto preparata al punto 3.10. Aggiungere Media antibiotico per completamente coprire il piatto e disperdere le cellule su tutta la superficie. Etichettare la piastra con il contenuto e la data e incubare a 37 ° C e 5% CO2.
  10. Dopo 48 h, assicurarsi che le celle siano collegate alla piastra di coltura. Aspirare i media e sostituire con abbastanza fresca Media antibiotico per coprire la piastra.
  11. Cambiare supporto 3 x settimana, aspirando vecchi media con una linea del vuoto e la pipetta Pasteur e sostituendo con abbastanza fresca media per coprire la piastra. Dopo 5 giorni sui Media Antibiotico, cambiare il supporto a Media espansione, continuando a sostituire tre volte a settimana.
    Nota: Il rischio di contaminazione è alta nella prima settimana della cultura. Mantenere i campioni freschi in un incubatore separato per minimizzare il rischio di contaminazione incrociata.
  12. Controllare la crescita delle cellule diverse volte alla settimana. Una volta che le cellule sono circa 70-80% confluenti, procedere alle cellule di passaggio.

6. passaggio HNE cellule

  1. Preparare la soluzione di tripsina 0.1% in acido etilendiamminotetraacetico (EDTA).
    Nota: Prestare attenzione movimentazione tripsina, che è una pelle, respiratoria e irritante dell'occhio.
    1. Pesare 15 mg di tripsina dal pancreas suino in una provetta conica.
    2. Pesare 56 mg di EDTA in un tubo conico separato.
    3. Nel gabinetto di biosicurezza, trasferire tripsina ed EDTA in una bottiglia di vetro sterilizzati nell'autoclave 250 mL. Utilizzare una piccola aliquota di soluzione fisiologica sterile di tampone fosfato (PBS) per sciacquare le provette di tripsina/EDTA per assicurare il completo trasferimento.
    4. Aggiungere PBS sterile per portare la soluzione totale a 150 mL. Chiudere ermeticamente il coperchio.
    5. Incubare la soluzione di tripsina in un bagnomaria di 37 ° C fino a quando completamente sciolto. Controllare ogni 15 min e rimuovere prontamente una volta sciolto.
      Nota: Non lasciare deselezionata per periodi prolungati di tempo (ad es., durante la notte), come tripsina in soluzione sarà denaturare se riscaldato troppo a lungo.
    6. Pulire la bottiglia con 2-3 spruzzi di etanolo al 70% e tornare la biosicurezza armadietto.
    7. Filtrare la soluzione di tripsina-EDTA 0,1% in un fresco, sterile 250 mL, beuta per filtrazione a PES 0,22 µm utilizzando le istruzioni del produttore e annotare con contenuto e la data.
    8. Conservare la soluzione di tripsina-EDTA a 4 ° C fino ad un mese, scartando se nuvoloso.
  2. Portare mezzi di differenziazione, soluzione di tripsina-EDTA 0,1% e PBS sterile a temperatura ambiente oltre 30 min pulite con etanolo al 70% e il trasferimento di una pulito di biosicurezza.
  3. Nella cappa di biosicurezza, utilizzare una linea del vuoto e la pipetta Pasteur per aspirare ed eliminare i supporti dalla piastra di coltura del tessuto. Lavare il piatto aggiungendo, vorticoso e aspirare 5 mL di PBS utilizzando una pipetta pulita sierologica.
  4. Utilizzando una pipetta sierologica di 5 mL, aggiungere 5 mL di soluzione di tripsina-EDTA 0,1% per il piatto di coltura del tessuto e tornare in incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per 5 min.
  5. Visualizzare le cellule su un microscopio invertito a 4-10 X. Verifica che le cellule scollegare dal piatto, diventano rotonde e galleggiano. Picchiettare delicatamente il lato della piastra di coltura per sloggiare le cellule, e/o ri-Incubare per altri 5 minuti fino a quando la maggior parte delle cellule sono staccata.
    Nota: Fare attenzione a rimuovere rapidamente le cellule una volta staccate dalla piastra di coltura; l'esposizione prolungata a 0.1% tripsina-EDTA altererà vitalità cellulare.
  6. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, aggiungere 5 mL di espansione Media al piatto e raccogliere tutto il liquido contenuto (10 mL totale) in una provetta conica sterile, con etichetta 50 mL.
  7. Se le cellule rimangono aderenti alla piastra di coltura, ripetere i passaggi 6,4 6.6 attraverso a due volte, raccolta contenuto nello stesso tubo conico.
    1. Se le cellule rimangono aderenti alla piastra di coltura dopo tre turni di esposizione di soluzione di tripsina, utilizzare un raschietto di cella sterile rimuovere delicatamente il resto. Dopo la raschiatura il piatto, lavate il raschietto e piatto con 5 mL di Media espansione e raccogliere nello stesso tubo conico con etichettato.
      Nota: Se il passaggio di sferoidi, modificare questa procedura per eseguire un trypsinization differenziale. Dopo l'aggiunta di tripsina soluzione (punto 6.4), controllare il piatto frequentemente fino a fibroblasti staccato (in genere 1-2 min), lasciando le cellule epiteliali poligonali solo attaccato al piatto. Raccogliere e mettere da parte questo surnatante, che possono essere attraversate in avanti per l'espansione. Ripetere i passaggi 6.4-6.6 utilizzando la stessa soluzione di tripsina e raccogliere solo le restanti cellule epiteliali per la cultura della sferoide.
  8. Centrifugare conica a 360 x g per 5 min e 4 ° C. Aspirare la media da conico.
  9. Risospendere le cellule in 1 mL di Media espansione e conteggio celle utilizzando un emocitometro.
  10. Una volta quantificate, cellule possono essere diviso se necessario e attraversate in avanti su una nuova piastra di coltura (compresa la preparazione di co-coltura del fibroblasto, passo 3 e placcatura cellule per espansione, passaggi 5.9-5.12) o coltivate come sferoidi (passaggio 7).
    Nota: Se passaggio a una nuova piastra di coltura per l'espansione, una densità di semina di 0,5-1 × 106 cellule in un piatto di P100 è raccomandato.

7. cellule di semina per HNE sferoide culture

Nota: Eseguire tutte le procedure in questo passaggio, diverso da centrifugazione, in una cappa di biosicurezza pulito.

  1. Scongelare la matrice della membrana basale su ghiaccio le istruzioni del produttore (sferoide ben 100 µ l).
    Nota: Considerare sterile aliquote di 500 µ l della matrice della membrana dello scantinato al ricevimento; tale importo sarà seme una singola piastra a 4 pozzetti.
  2. Separare un numero adeguato di cellule differenzialmente tripsinizzate, secondarie (dal punto 6.9) per una concentrazione finale di 500.000 cellule per mL di matrix. Per una piastra a 4 pozzetti, utilizzare 200.000 cellule. Raccogliere in una provetta da 1,5 mL.
  3. Centrifugare la miscela delle cellule e dei media a 360 x g per 5 min a 4 ° C. Completamente, ma attentamente aspirare ed eliminare elementi multimediali utilizzando una pipetta da 1 mL, facendo attenzione a non per disturbare il pellet cellulare.
  4. Utilizzando una pipetta da 1 mL, aggiungere 100 µ l per pianificato bene della matrice della membrana dello scantinato della provetta da 1,5 mL contenente le celle. Tenere il tubo sul ghiaccio.
  5. Pipettare su e giù per attentamente e accuratamente risospendere le cellule nella matrice della membrana dello scantinato. Muoversi rapidamente per evitare la solidificazione della matrice. Evitare di svuotare completamente il puntale della pipetta per garantire le bolle d'aria non vengono introdotti nel mix/cella della matrice.
  6. Seme aliquote di matrice 100 µ l in ogni pozzetto di una piastra di coltura IVF 4 pozzetti.
    1. Con un paio di forbici pulite, tagliate il distale 3-4mm di punta di una pipetta 200 µ l.
    2. Usando la punta tagliata, attentamente Pipettare 100 µ l della miscela cellula/matrice in al centro di ciascun pozzetto. Pipettare lentamente, con l'obiettivo di fare un'unica matrice "goccia" al centro di ciascun pozzetto. La goccia dovrebbe rimanere sferica e non dovrebbe toccare i lati del pozzo. Quando si sposta il piatto, fare così con attenzione per evitare di disturbare queste gocce.
    3. Incubare le gocce di matrice della membrana basale a 37 ° C e 5% di CO2 per 30 min, fino al solido.
    4. Attentamente e Pipettare 500 µ l di differenziazione Media in ciascun pozzetto, facendo attenzione a non per disturbare la goccia di matrice. Assicurarsi che il coperchio solo media la matrice eliminare e aggiungere di più se necessario.

8. differenziare e maturo HNE sferoidi

  1. Usando una pipetta da 1 mL, delicatamente aspirare tutti i media da pozzo; evitare di aspirare la matrice, che distruggerà sferoidi in quella porzione della matrice, anche se qualsiasi sferoidi lasciati alle spalle possono rimanere vitali.
  2. Utilizzando una punta di Pipetta 1ml fresco, delicatamente aggiungere 500 µ l di media di differenziazione nel pozzo intorno la matrice. Non toccare la matrice con la pipetta ed evitare di disturbare la goccia di matrice.
  3. Tornare sferoidi incubatore a 37 oC e 5% CO2 per la crescita in corso. Ripetere i passaggi da 8,1 8,3 attraverso tre volte a settimana.
  4. Valutare la morfologia della sferoide ogni giorno sotto un microscopio invertito a 20x. Sferoidi dovrebbero formare entro 3-5 giorni di placcatura e raggiungono la maturità entro circa 10 giorni.

9. pretrattare, stimolare e sferoidi HNE dell'immagine per l'analisi

  1. Pretrattare sferoidi come desiderato prima di formazione immagine come descritto in precedenza30.
    Nota: Per il pretrattamento di VX809, aggiungere 3 µM di VX809 ai media per 48-72 h prima di formazione immagine. Mescolare 1 µ l di 10 mM VX809 brodo (Vedi Materiali tavolo) in 3,3 mL di media per questa concentrazione.
  2. Modificare ogni bene di sferoidi a 1 mL di fresco Media di differenziazione, tra cui il pretrattamento (operazioni 8.1-8.3) prima dell'imaging di sferoidi.
  3. Preparare fresco stimolo farmaci soluzioni (Forskolin, 3-isobutyl-1-methylxanthine [IBMX], VX770 e CFTR inibitore 172 [Inh172]) dalle scorte (Vedi Materiali tavolo). Per forskolin/IBMX, aggiungere 1 µ l di ogni stock a 98 µ l di acqua sterile in una singola provetta da 1,5 mL con l'etichetta. Per VX770 e Inh172, è necessario aggiungere 1 µ l di ogni stock a 99 µ l di acqua sterile in provette da 1,5 mL con etichetta separata. Rendere un volume totale permettendo 50 µ l di soluzione per ogni pozzetto testato. Preparare soluzioni in condizioni sterili nella cappa di biosicurezza.
  4. Sferoide piano di trasferimento per una camera incubata a 37 ° C e 5% CO2, montato su un microscopio invertito dotato di software di acquisizione immagini elettroniche e una fase meccanica per regolazione XY. Accendere il microscopio e la fotocamera, come pure il computer imaging.
  5. Catturare le immagini della linea di base di sferoidi in un pozzetto.
    1. Aprire il software di acquisizione di immagine (Slidebook 5.5 per le indicazioni qui sotto). Una volta inizializzato, è possibile aprire un nuovo file facendo clic su "File", quindi "Nuovo". Di conseguenza il nome del file e fare clic su "Salva".
    2. Con attenzione rimuovere il coperchio di cultura e centrare una matrice goccia sopra l'obiettivo.
    3. A partire dall'inizio della goccia matrice, spostare in una griglia per trovare sferoidi 20 ingrandimenti con l'oculare del microscopio. Concentrarsi su e giù per catturare la sfera nel punto più largo. Annotare la posizione di ogni sferoide sulla mappa della goccia di matrice per identificare nuovamente dopo formazione immagine.
    4. Nel software, fare clic su "Acquisizione immagine". Per l'esposizione, selezionare "Manuale" e immettere 50 ms. assicurare altre impostazioni siano appropriati (fattore di Bin: 1x1, w: 512, h: 512, X e Y Offset: 0). Immettere un nome appropriato per ogni immagine nella casella "Nome" (ad es., sferoide 1 Baseline). Fare clic su "Start" per visualizzare un'immagine live e "Salva" per catturare un'immagine della linea di base.
    5. Ripetere passaggi 9.5.1-9.5.4 fino a gol numero è raggiunto, o goccia di intera matrice è imaged.
      Nota: Le differenze del gruppo possono essere rilevate con minor come sferoidi di 3-5 a condizione, tuttavia, è diventata la nostra pratica per 10 o più sferoidi a condizione per aumentare la potenza della battuta. Variabilità del dosaggio è illustrata nella Figura 2 della sezione "Rappresentante risultati", con campioni di sferoidi di 8-10 per l'oggetto come un esempio.
  6. Stimolare sferoidi.
    1. Utilizzando una pipetta 200 µ l, aggiungere 50 µ l della droga appropriata stimolazione in media all'interno del pozzo, facendo attenzione a non per disturbare la matrice.
      Nota: Dopo questa diluizione 10 volte (50 µ l in 500 µ l di media), la concentrazione di farmaco finale sarà: forskolin 10 µM, IBMX 100 µM, VX770 1 µM, Inh172 10 µM.
    2. Per il cAMP solo, aggiungere solo forskolin/IBMX.
    3. Per campo + VX770, aggiungere forskolin/IBMX prima, poi VX770 dopo 2 min.
    4. Per le condizioni inibite, aggiungere Inh172 prima, poi forskolin/IBMX dopo 2 min.
  7. Subito dopo stimolazione, monitorare sferoide gonfiore da formazione immagine della webcam per 1 h. Nel software, fare clic su "Acquisizione immagine". Fare clic su "Timelapse" e impostare l'intervallo di 30 s, con una durata di 60 min. invio un nome appropriato e fare clic su "Salva" per avviare timelapse.
    Nota: Timelapse Standard è quello di catturare immagini di uno sferoide singolo ogni 30 s per garantire un video di alta qualità. In alternativa, eseguire acquisizione inferiore-ingrandimento del pozzo intero (ad es., 4x), e un minor numero di immagini catturate se lo si desidera. Se viene utilizzata una fase automatizzata, eseguire timelapse di sferoidi tutti utilizzando le coordinate predefinite; in caso contrario, utilizzare timelapse di un sottoinsieme di sferoidi per fornire una revisione qualitativa del gonfiamento e garantire che problemi sistematici non derivano durante imaging (ad es., distacco di matrice dal pozzo).
  8. Immediatamente al completamento dell'immagine della webcam 1h, catturare immagini post-stimolazione di tutti gli sferoidi (per passaggio 9.5) utilizzando la mappa creata nel passaggio 9.5.3.
    1. Fare riferimento alle immagini pre-stimolazione per assicurare che sullo stesso piano di messa a fuoco è utilizzato per il follow-up immagini (la qualità focale delle circostanti cellule, sferoidi o detriti notevolmente facilitare questo processo).
    2. Salvare i file con un'annotazione accoppiata dal passaggio 9.5.4 (ad es., sferoide 1 post-stimolazione).
      Nota: completare questo passaggio immediatamente dopo il timelapse, come sferoidi possono continuare a gonfiarsi.
  9. Sostituire il supporto a software bene con fresco differenziazione Media.
  10. Ripetere i passaggi da 9,5 attraverso 9,9 per ogni pozzo/condizione, droghe di stimolazione di regolazione come indicato per condizioni sperimentali.
  11. Al termine di tutte le immagini, è possibile restituire sferoidi nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2.
    Nota: A seconda la sterilità della camera microscopio incubate, contaminazione post-stimolazione di sferoidi può essere abbastanza comune. Tieni imaged sferoidi in un incubatore separato, per minimizzare il rischio di contaminazione incrociata, o gettare sferoidi subito dopo formazione immagine.

10. analizzare HNE sferoide immagini

  1. Esportare immagini tutte catturate in un formato compatibile con software di analisi di immagine. Nel software, fare clic su "Visualizza", con il mouse su "Export" e selezionare "Default visualizzazioni di tutte le immagini come TIFF...". Salvare sul disco rigido o un'unità flash per l'analisi.
    Nota: un analisi commerciale software (Tabella materiali) e i file TIFF funzionano bene e sono descritti qui, anche se analisi possono essere eseguita anche utilizzando altre piattaforme. Denominazione file, personale analizzando immagini dovrebbe essere accecato alle condizioni sperimentali, ma consapevoli di quali immagini sono accoppiate (pre- e post-stimolazione) per garantire l'analisi equivalente.
  2. Utilizzando software di analisi, delineare l'area luminal di ogni immagine di sferoide ed esportare in un software di analisi dati.
    1. Software di analisi aperto. Fare clic su "File", poi "Apri" e passare alla cartella di file contenenti immagini di sferoide. Selezionare tutte le immagini per l'analisi e fare clic su "Apri".
    2. Fare clic su "Misura" e selezionare "Regione Measurements". All'interno della casella di dialogo regione misurazioni, selezionare la droptab "Configurazione" e verificare le caselle "Nome immagine" e "Area".
    3. Fare clic su "Accedi" e selezionare "Open Data Log". Cliccare "OK" sul file di registro di dati di dialogo, in scatola e il nome di conseguenza (per esempio, la condizione X, Data). Questo trasferirà tutte le misurazioni in un foglio di calcolo.
    4. Selezionare il pulsante dello strumento "Traccia regione" e accuratamente traccia il lume della sferoide nella prima immagine per analisi. Nella finestra di dialogo regione misura, fare clic su "Dati di Log" per registrare la misura in Excel.
    5. Ripetere passaggi 10.2.2-10.2.4 finché non vengono analizzati tutti gli sferoidi.
  3. Calcolare la variazione percentuale (100 * [Post-stim - Baseline] ÷ Baseline) nell'area luminal dal basale per ogni singola sferoide coppia di immagine e compilare i dati per l'analisi.

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Risultati

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HNEs dovrebbe fissare la piastra di coltura e formare piccole isole di cellule all'interno di 72 h di semina; esempi di buone e povere isola formazione presso una settimana sono mostrati in Figura 1A e 1B, rispettivamente. Queste isole dovrebbero espandersi per coprire il piatto nel corso di 15-30 giorni. Campioni piccoli o non ottimali possono richiedere più tempo e spesso non produrrà utili sferoidi. Contaminazione con agenti infettivi è te...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive la generazione di colture di sferoide paziente-derivato nasale cellulari in grado di produrre un modello individualizzato, specifico della funzione CFTR. Ci sono diversi passaggi chiave nel processo che dovrebbe essere frequentato molto attentamente per evitare difficoltà. In primo luogo è un'acquisizione di buon campione dal naso del paziente. Dovrebbe avere un buon campione > 50.000 cellule, limitato muco/detriti ed essere pronti per l'elaborazione all'interno di 4 h (anche se il successo è a...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato da Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, grant numero CLANCY14XX0 e attraverso la Fondazione fibrosi cistica, concedere il numero CLANCY15R0. Gli autori desiderano ringraziare Kristina Ray per la sua assistenza nel reclutamento dei pazienti e la vigilanza regolamentare. Gli autori desiderano anche ringraziare il gruppo di lavoro di HNE, sostenuto dalla Fondazione fibrosi cistica, che ha assistito nella generazione di funzionalità di HNE cultura: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, g. Marty Solomon e Katherine Tuggle.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1,5 mL di provetta Eppendorf USAScientific4036-3204
Pallone filtrante da 150 mLMidsciTP99150Per filtrare il terreno
15 mL Tubo conicoMidsci
Pallone filtrante da 1 lMidsciTP99950Per filtrare il terreno
Piatto con fondo in vetro da 35 mmMatTek CorporationP35G-0-20-C
3-Isobutil-1-Metilxantina opzionale (IBMX)Fisher Scientific AC228420010 Preparare una soluzione madre da 100 mM di 22,0 mg in 1 mL di DMSO
Provetta conica da 50 mLMidsci 
AccutaseInnovative Cell Technologies, Inc.AT-104Soluzione di distacco cellulare
AdeninaSigma-AldrichA2786-25GVedi Tabella 1
Amfotericina BSigma-AldrichA9528-100MGVedi Tabella 1
Estratto di cervello bovino (9mg/mL)Lonza CC-4098Vedi Tabella 2
Ceftazidima idratoSigma-AldrichC3809-1GVedi Tabella 1
Raschietti cellulari 20 cm Midsci
CFTR Inh172Tocris Bioscience3430Preparare una soluzione madre da 10 mM di 4,0 mg in 1 mL di DMSO
Tossina Colera B (da Vibrio cholerae)Sigma-AldrichC8052-.5MGVedere la Tabella 1
CYB-1Medical Packaging CorporationCYB-1Pennello citologico
Dimetil solfossido (DMSO)Sigma-AldrichD5879-500ML
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes Tecnologie per la vita 11330-057Base Media; Vedere le Tabelle 1 e 2
Fattore di crescita epidermico (proteina umana ricombinante, senza origine animale)Thermo Fisher ScientificPHG6045Vedere la Tabella 1
EpinefrinaSigma-AldrichE4250-1GVedere la Tabella 2
EtanoloFisher Scientific 2701
EtanolamminaSigma-AldrichE0135-500ML16,6 mM soluzione; Vedi Tabella 2
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)TCI America E0084
Siero fetale bovino (FBS ad alte prestazioni)Invitrogen 10082147Vedere la Tabella 1
ForskolinSigma-AldrichF6886-50Preparare una soluzione madre da 10 mM di 4,1 mg in 1 mL di DMSO
Growth Factor-Reduced MatrigelCorning, Inc.356231Corning Matrigel Matrice di membrana basale con fattore di crescita ridotto (GFR), senza rosso fenolo, senza LDEV, 10 mL.
EmacitometroHausser Scientific1483
Soluzione di collagene umano, Tipo I (VitroCol; 3 mg/mL)Advanced BioMatrix5007-ASoluzione di collagene
HyClone (aka FetalClone II) GE Healthcare SH30066.03HIVedi Tabella 2
IdrocortisoneStem Cell Technologies07904Vedi Tabelle 1 e 2
Insulina, ricombinante umano, soluzione di zincoLife Technologies 12585014soluzione da 4 mg/mL; vedere la Tabella 2
Piastra a 4 pozzetti IVF, NUNC non trattata(via Fisher Scientific)12566350piastra a 4 pozzetti per sferoidi; dimensione del pozzetto simile a una piastra a 24 pozzetti
MEF-CF1-IRRGlobalstemGSC-6001GFibroblasti embrionali murini irradiati
Metamorph 7.7Molecular DevicesSoftware di analisi; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software per un preventivo
Microscopio invertito Olympus IX51Olympus Corporationha interrotto la produzionemicroscopio per immagini. Sostituzione: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/  per un preventivo
Pen StrepLife Technologies 15140122Vedere la Tabella 2
PhsophorytheanolamineSigma-AldrichP0503-5GVedere la Tabella 2
Acido retinoicoSigma-AldrichR2625-50MGVedere la Tabella 2
RhinoprobeArlington Scientific, Inc.96-0905Curette nasale
Slidebook 5.53i, Intelligent Imaging InnovationsSoftware di imaging fuori produzione. Sostituzione: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook per un preventivo
Soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific20012050
Acqua sterileSigma-AldrichW3500-6X500ML
Piastra per coltura tissutale 100Techno Plastic Products93100Piastra per coltura tissutale per espansione
TobramicinaSigma-AldrichT4014-100MGVedere la Tabella 1
Transferrina (Transferrina Umana 0,5 mL)Lonza CC-4205Vedi Tabella 2
TriiodotrioninaSigma-AldrichT6397-1G3,3′,5-Triiodo-L-tironina sale sodico [T3]; Vedere la Tabella 2
Tripsina da pancreas suinoSigma-AldrichT4799-10G
Ultroser-GCrescent Chemical (via Fisher Scientific)NC039302420 ml di polvere liofilizzata; Vedere la Tabella 2
Vancomicicina cloridrato da Streptomyces orientalisSigma-AldrichV2002-5GVedere la Tabella 1
VX770Selleck ChemicalsS1144Preparare una soluzione madre da 1 mM di 0,4 mg in 1 mL di DMSO
VX809Selleck ChemicalsS1565Acquistare o preparare una soluzione madre da 10 mM da 4,5 mg in 1 mL di DMSO
Y-27632 Dicloridrato  Inibitore di ROCK Enzo LifeSciencesALX-270-333-M025 Vedi Tabella 1
TP91015TP91050TP99010 del

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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