Gene targeting mutagenesi casuale per selezionare eterocromatina-destabilizzare Proteasome mutanti in lievito di fissione

Genetica in avanti è un metodo classico, in cui i ricercatori cercano mutanti naturali che visualizzano un fenotipo particolare ed eseguire analisi genetiche. In genetica inversa, mutazioni vengono introdotti in un gene di interesse ed il fenotipo è esaminato. In quest'ultimo caso, mutagenesi casuale di un gene target viene spesso utilizzata per generare un pool di mutanti che sono successivamente selezionato per desiderata fenotipi, come sensibilità di temperatura o alterati di attività enzimatica. Possono essere utilizzati vari metodi per raggiungere mutagenesi casuale, tra cui errori PCR¹; Di irradiazione UV²; mutageni chimici, ad esempio methanesulfonate etilico (EMS) o acido nitroso³; l'uso di ceppi di mutator temporanei, come quelli che sovraesprimono mutD5 ⁴; e DNA shuffling⁵.

Qui, descriviamo una strategia inversa-genetica in cui utilizziamo errori PCR per generare mutanti piscine per un gene dell'obiettivo del lievito di fissione. Come si potrebbe intuire dal suo nome, questo metodo genera mutazioni introducendo deliberatamente errori durante la PCR. A differenza di altri metodi di mutagenesi, errori PCR permette all'utente di definire la regione a essere mutagenizzato. Questo rende particolarmente utile negli sforzi per studiare la funzione di una proteina/dominio di interesse.

Per illustrare questa procedura di mutagenesi casuale, qui usiamo rpt4 +, che codifica per la subunità del proteasoma 19S, come un esempio. Rpt4 ha dimostrato di avere funzioni di proteolisi-indipendente negli organismi diversi da fissione lievito^6,7,8,9, e un difetto nella proteolisi potrebbe causare effetti indiretti alterando proteine livelli. Abbiamo, quindi, sottoposti a screening per mutanti che ha attivato la proteolisi-indipendente modifiche, con l'obiettivo di indagare la funzione del proteasoma su eterocromatina.

Errori PCR può essere applicato a qualsiasi regione del gene regolando la posizione a cui associare il primer. Mutanti che presentano la variazione fenotipica desiderata possono essere identificati con i giornalisti appropriati. Qui, abbiamo utilizzato un reporter ade6 + inserito al centromero 1 esterno ripetere (otr) regione¹⁰. Eterocromatina costitutiva è formata a questa regione¹¹, così il ade6 + reporter viene messo a tacere nella condizione di selvaggio-tipo; Questo è indicato da colonie rosse¹⁰. Una mutazione che destabilizza l'eterocromatina costitutiva al centromero porterà all'espressione del ade6 + reporter, che è visualizzato come colonie bianchi.

1. preparazione dei Media

1. Preparare Estratto di lievito con integratori (Sì), sì senza adenina (Sì basso Ade), Pombe Glutamate media (PMG¹²) e PMG senza adenina (PMG-Ade) mescolando i componenti come descritto nella tabella 1. Sì-Ade (bassa Ade) e piastre PMG-Ade hanno tutti gli stessi componenti, ma l'adenina è omesso da quest'ultimo.
   1. Utilizzare il seguente stock di sale (50x): 52,5 g/L MgCl₂·6H₂O, 2 g/L CaCl₂·2H₂O, 50g/L KCl, 2G/L Na₂modo₄ in acqua distillata. Filtro sterilizzare usando un filtro di dimensioni dei pori di 0.22-µm e conservare a 4 ° C.
   2. Utilizzare il seguente vitamina (1, 000 x) magazzino: pantotenato di 1 g/L, 10 g/L di acido nicotinico, inositolo 10 g/L, biotina 10 mg/L in acqua distillata. Filtro sterilizzare usando un filtro di dimensioni dei pori di 0.22-µm e conservare a 4 ° C.
   3. Utilizzare il seguente minerale (10, 000 x) stock: 5 g/L di acido borico, 4G/L MnSO₄, 4G/L ZnSO₄·7H₂O, 2 g/L FeCl₂·4H₂O, 0,4 g/L MoO₃, 1G/L KI, 0,4 g/L CuSO₄·5H₂O , 10 g/L di acido citrico in acqua distillata. Filtro sterilizzare usando un filtro di dimensioni dei pori di 0.22-µm e conservare a 4 ° C.
      Nota: Sì liquido può essere fatto omettendo l'agar.
2. Il mezzo di autoclave e raffreddarlo di sotto di 60 ° C continuando a mescolare con un ancoretta, al ritmo di 200 giri/min.
3. Per piastre sì + G418 (geneticin), è necessario aggiungere soluzione di riserva di 1 mL/L G418 al mezzo Sì.
   1. Utilizzare il seguente G418 (1, 000 x) magazzino: G418 100 mg/mL in acqua distillata. Filtro sterilizzare usando un filtro di dimensioni dei pori di 0.22-µm, aliquota per provette da 1,5 mL centrifuga e store a-20 ° C.
4. Mescolare per un altro 5-10 min e aliquota media nei piatti di Petri di 90 mm (1 L di aliquote medie di circa 40 capsule di Petri. Conservare le piastre a 4 ° C.

2. clonazione di rpt4 + e suo 5' / 3' UTR

1. Eseguire PCR con primer p1 e p2 (Figura 1A) mediante fissione lievito DNA genomico (gDNA) come il modello in un volume totale di 50 µ l (~ 1 µ g del DNA, enzima U 20, 1x tampone di reazione), e applicando i cicli di reazione descritti nella tabella 2 per amplificare una 3.315-base frammento di coppia (bp) composto da rpt4 + e suo 5' / 3' UTR. Purificare il prodotto PCR usando un kit di purificazione¹³ come indicato dal produttore (Figura 1A).
2. Digerire il pBlueScript KS(-) vettoriale¹⁴ e il frammento di DNA amplificato contenente rpt4 + con suo 5' / 3' UTR con BamH1 e Xho1 in un volume totale di 20 µ l (~ 1 µ g di DNA, 20 U enzima, tampone digestione 1x) a 37 ° C in un bagno d'acqua per 16-18 h (Figura 1B).
3. Gel di purificare il vettore digerito (1,2% gel di agarosio) e inserimento di DNA mediante esecuzione di elettroforesi del gel dell'agarosi basati su TAE (100 V, 1h), asportando le bande di DNA della misura desiderata e isolare il DNA con un kit di estrazione gel¹⁵.
4. Legare il vettore e l'inserimento di DNA usando T4 DNA ligasi eseguendo una reazione di legatura 20-µ l contenente 50-100 ng di DNA, di vettore un ~ 3 volte eccesso molare del DNA dell'inserto, 400 U T4 DNA ligasi e 1x buffer di legatura. Incubare la miscela a 18 ° C per 16-18 h.
5. Trasformare il DNA legato in 100 µ l di e. coli DH5α applicando shock termico per 70 s a 42 ° C. Aggiungere 1 mL di LB e incubare per 1h a 37 ° C per il recupero. Eseguire la centrifugazione (13.800 x g), scartare il surnatante, piastra tutti del trasformato Escherichia coli cellule su piastre LB-ampicillina (LA) e incubare a 37 ° C per 16 h.
6. Pick 4-8 colonie con degli stuzzicadenti e crescere durante la notte a 37 ° C in media 3 mL LA.
7. Isolare i plasmidi con un plasmide purificazione kit¹⁶ usato secondo il protocollo del produttore ed eseguire le digestioni analitiche degli enzimi di limitazione con 5 µ l del plasmide isolato, 5 U di ciascun enzima di restrizione (BamH1 e Xho1) e 1x buffer di restrizione. Incubare a 37 ° C in un bagno d'acqua per 3 h. conferma la clonazione mediante sequenziamento plasmidi candidato la miscela di reazione.

3. introduzione della mutazione silenziosa (Xho1 sito di restrizione)

1. Progettare un paio degli iniettori 33-bp (p3 e p4) che contengono la mutazione desiderata nella sequenza altrimenti complementare.
2. Eseguire PCR con alta fedeltà della polimerasi¹⁷ (Figura 1) in un volume totale di 25 µ l (10 ng di plasmide clonato, 2 µ l di 10 pmol mix di primer, 2 U enzima, tampone di reazione 1x) utilizzando i parametri ciclismo riportati nella tabella 3.
3. Digerire il plasmide modello con Dpnio in un volume totale di 20 µ l (20 U enzima, 1x buffer di digestione) a 37 ° C in un'acqua del bagno per 1 h.
4. Trasformare, propagare, isolare e sequenza il plasmide contenente la mutazione silenziosa, come descritto nei passaggi 2.5-2.7.
   Nota: La mutazione silenziosa può anche essere introdotto utilizzando un metodo di clonazione che permette per la giunzione dei frammenti di DNA multipli in una singola reazione¹⁸.

4. random mutagenesi di rpt4 + di Error-prone PCR

1. Eseguire errori PCR, utilizzando il plasmide con la mutazione silenziosa (sitoXho1 ) come il modello, primer p5 e p6, un volume totale di 50 µ l (l'importo del modello definito al punto 4.1.1, 2 µ l di miscela di primer 10 pmol, 2,5 U enzima, 1 tampone di reazione di x) , e una polimerasi speciale che è progettata per generare un errore elevato tasso¹⁹ (Figura 1). Eseguire la PCR come descritto nella tabella 2.
   1. Utilizzare 4-5 µ g di plasmide modello per controllare la frequenza di mutazione a 1KB bp (kilobase).
      Nota: Un'alta concentrazione (> 500 ng / µ l) del plasmide, che può essere ottenuto utilizzando un mini-prep kit²⁰, è necessario.
2. Utilizzare l'elettroforesi del gel per confermare un prodotto PCR di 2670 bp (1,2% gel di agarosio). Gel di purificare questo prodotto PCR come descritto al punto 2.5.

5. preparazione di frammenti di PCR di Fusion (KAN, 3' UTR)

1. Eseguire PCR utilizzando pFA6a-KANMX6²¹ come modello, primer p7 e p8 e le condizioni elencate in tabella 4 per ottenere il frammento di marcatore (KAN). Gel di purificare il frammento di 1.480-bp risultante come descritto al punto 2.5 (Figura 1E).
   1. Verifica se il codone di arresto del gene mirato per mutazione e la regione di codificazione del suo gene adiacenti sono separati da più di 500 bp. Il terminatore endogeno non può essere utilizzato quando questa regione è inferiore a 500 bp; piuttosto, il terminatore di ADH dovrebbe essere usato anziché il terminatore endogeno. I cambiamenti di protocollo necessari per utilizzare il terminatore di ADH sono presentati nella tabella 5.
      Nota: Queste modifiche si applicano solo quando il terminatore di ADH , che è disponibile nel plasmide pFA6a-3HA-KANMX6, viene utilizzato invece il terminatore endogeno.
2. Eseguire PCR con clonato rpt4 +-contenente vettoriale come il modello e primer p9 e p10 in un volume totale di 50 µ l (20 ng di plasmide clonato, 2 µ l di 10 pmol mix di primer, 2 U enzima, 1x tampone di reazione), utilizzando le condizioni presentate nella tabella 6. Gel di purificare il frammento UTR ottenuti 506-bp 3' (Figura 1E).

6. generazione del costrutto trasformazione da fusione PCR (Figura 1E)

1. Preparare i 3 frammenti (mutagenized rpt4 +, KAN e il 3' UTR) a 50 ng / µ l.
2. Eseguire la fusione che PCR dei tre frammenti utilizzando primer p11 e p12, come descritto nella tabella 7. (Il protocollo per la fusione PCR è una modifica del protocollo originale²²). Purificare il prodotto di PCR di 4.398-bp principale.
   1. Utilizzare rpt4 +: KAN:3'UTR frammenti con un rapporto di 1:3:1 per ottenere risultati ottimali.
      Nota: L'importo totale del DNA inserto non deve superare 500 ng. La quantità consigliata di rpt4 +: KAN:3'UTR è 50 ng:150 ng:50 ng. La regione mutagenized è di circa 1,6 kb, quindi il numero minimo delle colonie del lievito che potesse spiegare tutte le possibili combinazioni di ciascuna base essendo mutato agli altri tre è 1.600 x 3 = 4.800 colonie. Perché una reazione di trasformazione in genere produce colonie di 400-500, è necessario almeno 10 reazioni vale la pena di fusione PCR costruire. Questa necessità possa essere soddisfatte semplicemente aumentando la quantità di reazione (cioè, il numero di provette per PCR) di un fattore dieci.

7. trasformazione del lievito di fissione mediante elettroporazione (Figura 1F)

1. Inoculare il lievito a 10 mL di mezzo di sì alla saturazione incubando esso per più di 16 h.
2. Diluire le cellule a densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) di 0,2 in 200 mL di terreno di sì e incubare a 30 ° C con agitazione per 5-6 h, a OD₆₀₀ = 0.6 - 0.8.
3. Concentrare le cellule a OD₆₀₀ = 30, erogare in quattro provette coniche da 50 mL e chill sul ghiaccio per 10 min.
4. Raccogliere le celle eseguendo centrifugazione a 1.050 x g per 3 min a 4 ° C. Posizionare i tubi e 10 electro-cuvette sul ghiaccio. Eseguire la procedura 7.3-7,8 sul ghiaccio.
5. Scartare il surnatante e aggiungere 15 mL di sorbitolo 1,2 M. Agitare delicatamente le provette per risospendere le cellule.
6. Centrifugare le cellule a 1050 x g per 3 min a 4 ° C.
7. Ripetere i passaggi da 7.4 e 7.5. Scartare il surnatante. Aggiungere 500 µ l di 1,2 M sorbitolo in ogni provetta, risospendere le cellule e raccogliere tutte le celle in una provetta conica da 15 ml.
8. Aggiungere 1,2 M sorbitolo fino a 2,4 mL (OD₆₀₀ = 10 / 0,2 mL). Tenere il tubo sul ghiaccio.
9. Aggiungere 200 µ l di cellule sorbitolo-sospesa (assicurarsi che essi sono completamente sospesi) in una provetta di EP contenente la fusione PCR costruire, mescolare bene e trasferire il campione di un electro-cuvetta.
10. Electroporate le cellule con le seguenti opzioni: funghi, ShS (2.00kV, 1 impulso).
11. Aggiungere 600 µ l di 1,2 M sorbitolo ogni electro-cuvette per un volume totale di 800 µ l e poi diffuso le cellule su quattro piatti Sì (200 µ l/piastra). Dieci electro-cuvette erogherà a 40 sì piastre.
12. Incubare le piastre a 30 ° C per 24 h.
13. Eseguire piastratura delle repliche a Sì + G418 e incubare le piastre a 30 ° C per 3 giorni.

8. selezione di mutanti eterocromatina-destabilizzante e la verifica di falsi positivi

1. Per ogni piastra sì + G418, eseguire piastratura delle repliche di sì-Ade (bassa Ade) e piastre PMG-Ade (No Ade). Incubare le piastre di replica per 1-2 giorni a 30 ° C, fino a quando alcune delle colonie sulle piastre sì-Ade mostrano una colorazione rossa (Figura 1).
2. Confronta le piastre sì-Ade e PMG-Ade e selezionare le celle che mostrano rosa o bianco sulla piastra sì-Ade e anche crescono sulla piastra PMG-Ade. Non selezionare colonie senza crescita il PMG-Ade, in quanto essi sono falsi positivi (ad es., riflettendo che la cassetta di KAN è stata integrata in un sito non-bersaglio altrove nel genoma).
3. Prendere circa 1 x 10⁵ celle da ogni Colonia e incubare a 10 µ l di soluzione SPZ contenente 2,5 mg/mL zymolyase 100 T a 37 ° C per almeno 30 min. uso 1 µ l di questa soluzione per eseguire come il modello di partenza per la Colonia PCR (Figura 1 H).
   1. Fare SPZ (50 mL) mescolando 30 mL di sorbitolo 2m, 4,05 mL di 1 M Na₂HPO₄, 0,95 mL NaH₂PO₄ e 15 mL di acqua distillata (pH finale, 7.5). Campioni (5 mL) possono essere completati con zymolyase e memorizzati in aliquote di 500-µ l a-20 ° C fino all'utilizzo.
4. Eseguire l'elettroforesi del gel (gel di agarosio 1.2%, 180V, 20 min) per visualizzare i risultati di + la PCR della Colonia. Selezionare le reazioni che esibiscono bande PCR delle dimensioni corrette e digeriscono 5 µ l di ciascun prodotto di reazione con Xhoio (4 U enzima, tampone digestione 1x, bagno di acqua di 37 ° C, 1h) per identificare i falsi positivi (Figura 1 H).
5. Eseguire l'elettroforesi del gel per visualizzare le raccolte di XhoI (1,2% gel di agarosio, 180 V, 20 min). Contrassegnare le colonie in cui prodotti PCR sono tagliati da XhoIe loro patch a piastre sì + G418 (Figura 1I).
6. Isolare gDNA da cellule di lievito di fissione ed eseguire l'ordinamento dei prodotti PCR²³. Confronta la sequenza ottenuta con la sequenza wild-type per identificare mutazioni (Figura 1I).
7. Direttamente re-introdurre la mutazione di cellule wild-type trasformandoli con costrutti di fusione amplificati dalla PCR da cellule mutanti²³. Utilizza individuazione per confermare il fenotipo in cellule mutanti appena effettuate (Figura 1J).
   1. Costrutto di trasformazione di fusione può essere facilmente amplificato mediante PCR con primer p1 e p10 utilizzando il DNA genomic di mutanti come il modello in un volume totale di 50 µ l (~ 1 µ g del DNA, enzima U 20, 1x tampone di reazione) e applicando i cicli di reazione descritti in tabella 2 . Trasformazione del costrutto può essere fatto seguendo i passaggi 7.1-7.13.

I mutanti di Rpt4 acquisiti seguendo le procedure descritte nella Figura 1 possono essere analizzati valutando i colori delle colonie. I colori delle colonie sono macchiati sulle piastre pertinenti nel fare diminuire il numero delle cellule nella Figura 2. Il reporter ade6 + inserito presso la regione di eterocromatina è messo a tacere nel selvaggio-tipo e Mostra colonie rosse in piastra sì-Ade. Una volta che l'eterocromatina è destabilizzato e il reporter ade6 + è espressa, colonie bianchi possono essere osservati nella piastra di sì-Ade come mutante clr4Δ . I mutanti di Rpt4 schermati sono come mostrato. RPT4-1 mutante dimostra la più grave destabilizzazione di eterocromatina.

Figura 1 : Rappresentazione schematica del protocollo. (A) rappresentazione schematica del prodotto della PCR ottenuti il primo giro di PCR, che viene eseguita con gli iniettori 1 e 2. (B) base di restrizione clonazione del frammento rpt4 + . (C) mutagenesi sito-diretta del vettore clonato viene utilizzata per introdurre una mutazione silenziosa che aggiunge un sito di restrizione XhoI . (D) mutagenesi Random del rpt4 + regione di codificazione è effettuata usando PCR soggetta a errori. (E) il frammento mutato rpt4 + , il frammento di KAN e il frammento di 3' UTR sono uniti da fusione PCR per generare una cassetta di trasformazione-ready. (F) le cellule di lievito di fissione si trasformano con la fusione costrutto PCR, che sostituisce la sequenza endogeno rpt4 + di ricombinazione omologa. (G) KAN-selezionato colonie sono replica placcato sì-Ade (bassa Ade) e piastre PMG-Ade (No Ade), e colonie positive sono selezionati. (H) successive XhoI restrizione del prodotto della PCR e PCR sono utilizzati per evitare falsi positivi. (I) la mutazione che causa il fenotipo è identificata con una patch delle colonie selezionate, propagazione di cellule, estrazione del DNA genomico (gDNA) e l'ordinamento della parte pertinente del rpt4 +. (J) mutazioni Causative sono confermate (e falsi positivi sono escluse) introducendo direttamente la mutazione di cellule wild-type. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Mutanti de-repressione eterocromatina di Rpt4. Diagramma schematico del reporter otr1::ade6 + (in alto). 5 volte diluizioni seriali di selezionare schermato Rpt4 mutanti sono stati avvistati sulle piastre indicate in ordine crescente livello di destabilizzazione dell'eterocromatina (in basso). Questa figura è stata modificata dall'articolo 'il proteasoma 19S è direttamente coinvolta nella regolazione dell'eterocromatina diffondendo nel lievito di fissione ' di Seo et al., 201724. La figura non coltivate possa essere trovata nell'articolo originale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Componenti di sì e piastre di PMG

Tabella 2. Programma consigliato di PCR per mutagenesi sito-diretta

Tabella 3. Programma consigliato di PCR per la PCR errori

Tabella 4. Programma PCR per ottenere il frammento di KAN consigliato

Tabella 5. Cambiamenti necessari quando il terminatore di ADH viene utilizzato invece il terminatore endogeno

Tabella 6. Consigliato programma PCR per ottenere il frammento di 3' UTR

Tabella 7. Programma consigliato di PCR per fusione PCR

Tabella S1: Ceppo utilizzato in questo studio

Tabella S2: Elenco dei primer utilizzati in questo studio

Gli autori non hanno nulla a rivelare.