Presentiamo un metodo che può fornire ulteriori approfondimenti i primi eventi sottostante neurodegenerazione e basato sulla tecnica del cervello stabilito ex vivo , unendo i vantaggi degli esperimenti in vivo e in vitro . Inoltre, rappresenta un'opportunità unica per un confronto diretto del gruppo trattata e non trattata sullo stesso piano anatomico.
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Articolo metodologico
Un approccio alternativo per studiare eventi primari nella neurodegenerazione utilizzando fettine di cervello di ratto Ex Vivo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nonostante i numerosi studi che tentano di sviluppare modelli animali affidabile che riflettendo il primario i processi di neurodegenerazione sottostante, molto pochi sono stati ampiamente accettati. Qui, vi proponiamo una nuova procedura adattata dal ben noto ex vivo fetta tecnica del cervello, che offre una più stretta in vivo-come scenario di in vitro i preparativi, per indagare gli eventi precoci innescando la degenerazione delle cellule, come osservato nel morbo di Alzheimer (annuncio). Questa variante è costituita da passi semplici e facilmente riproducibili, che consentono la conservazione della citoarchitettura anatomica della regione del cervello selezionato e la sua funzionalità locali in un ambiente fisiologico. Diverse aree anatomiche possono essere ottenuti dal cervello stesso, offrendo la possibilità di eseguire esperimenti multipli con i trattamenti in questione in un sito - dose- e tempo-dipendente. Limitazioni potenziali che potrebbero influenzare i risultati relazionati a questa metodologia sono legate alla conservazione del tessuto, vale a dire, il mantenimento della sua integrità anatomica durante le operazioni di affettamento e incubazione e lo spessore di sezione, che possono influenzare l'analisi biochimica e immunohistochemical. Questo metodo può essere impiegato per scopi diversi, come esplorare i meccanismi molecolari coinvolti in condizioni fisiologiche o patologiche, screening di farmaci o dosaggi di dose-risposta. Infine, questo protocollo potrebbe anche ridurre il numero di animali impiegati in studi comportamentali. L'applicazione segnalata qui recentemente descritto e testato per la prima volta su ex vivo il fettine di cervello di ratto contenenti proencefalo basale (BF), che è una delle regioni cerebrali colpite principalmente in annuncio. In particolare, è stato dimostrato che la somministrazione di un peptide tossico derivato dal C-terminale dell'acetilcolinesterasi (AChE) potrebbe richiedere un profilo AD-come, innescando, lungo l'asse antero-posteriore del BF, un'espressione differenziale di proteine alterate in annuncio, ad esempio il recettore nicotinico alfa7 (α7-nAChR), fosforilato Tau (p-Tau) e beta amiloide (Aβ).
Introduzione
Annuncio è che una patologia cronica caratterizzata da danno progressivo neurodegenerative che interessano aree differenti del cervello, come la corteccia di entorhinal (CE), BF, ippocampo (HC) e bulbo olfattivo (OB)1,2,3, 4,5. La fine delle fasi di sviluppo AD portare ad un declino conoscitivo progressivo, rendendo questa malattia la più comune forma di demenza, pari circa al 70% di tutti i casi6. Malgrado vasto tentativo di comprendere le fasi iniziali che causano AD, non esiste attualmente una definita indicazione sperimentale delucidamento li. Inoltre, la teoria più popolare - del "ipotesi amiloide" - è sempre più messa in discussione dal momento che non fornisce un profilo completo nello spiegare pathobiology annuncio, né una destinazione farmaceutica che si è rivelata efficace7,8 ,9.
Una teoria alternativa che sta ricevendo crescente attenzione suggerisce che i meccanismi iniziali che si verificano durante la neurodegenerazione sono correlati a un cluster di un neurone principalmente suscettibile AD3,10,11 , 12 , 13 , 14. questo hub cellulare eterogeneo rientra all'interno i progetti di BF, mesencefalo e del tronco cerebrale, più aree, quali la CE, HC e OB15,16. Nonostante la sua diversità nella morfologia neuronale e sintesi del neurotrasmettitore, questo nucleo di cellule condivide una caratteristica comune nell'esprimere il dolore, che può anche avere una funzione non-enzimatica17,18. Questo ruolo non-classica come un romanzo di segnalazione molecola media il flusso di calcio (Ca2 +) in neuroni che possono subire gli eventi trofici o tossici in relazione di Ca2 + dose, disponibilità e un neurone età17,18 , 19.
Durante la neurodegenerazione, la perdita cellulare osservata potrebbe essere quindi associata a questa funzione non enzimatici17,18,20, che è attribuibile ad un peptide 30mer (T30) spaccato da mal di C-terminale 20. in linea con i risultati precedenti, riportati su coltura cellulare e optical imaging preparazioni di18,21 , abbiamo dimostrato, attraverso un approccio innovativo basato su ex vivo il fettine di cervello di ratto contenente strutture BF, che ha indotto T30 un annuncio-come il profilo22. In particolare, questa nuova metodologia offre uno scenario più fisiologico di coltura cellulare, poiché mantiene molte delle caratteristiche di un tessuto intatto, che vanno da anatomica alla conservazione di circuiti, seppur per una finestra di tempo di ore. Abbiamo applicato questo protocollo per esplorare gli eventi che si svolgono durante le fasi iniziali della neurodegenerazione, monitoraggio della risposta acuta all'atto dell'applicazione T30.
Nonostante il grande corpo di letteratura sull'uso di cervello fette di indagare i meccanismi molecolari implicati nel danno neuronale o neurogenesi23,24, questo protocollo fornisce per la prima volta un più immediato e sensibile leggere rispetto per l'uso comune di organotipiche fette. Tuttavia, come è il caso per organotipiche sezioni del cervello, questa procedura di fetta acuta può essere adottata per diversi scopi, come ad esempio la valutazione di neuroprotective o molecole neurotossiche, scoperta di primarie cambiamenti molecolari che si verificano in un processo specifico, patologie correlate: analisi immunohistochemical e dosaggi farmacologici per il sistema nervoso centrale.
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Protocollo
Tutti gli studi sugli animali sono stati effettuati nell'ambito di protocolli approvati.
Nota: In questa sezione, la sequenza delle fasi principali eseguite durante la procedura sperimentale e l'intervallo di tempo consigliato è fornito (Figura 1). Inoltre, una descrizione dettagliata del protocollo è completata da un pannello illustrativo, mostrando azioni critiche che vanno dalla rimozione del cervello per omogeneizzazione del tessuto dopo il periodo di incubazione (Figura 2). I dettagli per quanto riguarda i materiali e le istruzioni per costruire l'apparato e la successiva fase per l'analisi di WB sono descritti in precedenza22.
1. chirurgici strumenti, impostazioni Vibratome e preparazione di trattamento
Nota: Eseguire le seguenti operazioni prima di avviare la procedura sperimentale:
- Preparare due diversi artificiali liquidi cerebrospinali (aCSFs), uno usato per il taglio del cervello e l'altro per la fase di incubazione come precedentemente descritto29. Brevemente, le concentrazioni di lavoro (in mmol) dei due aCSFs sono per la aCSF "slicing": 120 NaCl, 5 KCl, 20 NaHCO3, 2,4 CaCl2, 2 MgSO4, 1,2 KH2PO4e 10 glucosio; 6.7 HEPES sale e 3,3 HEPES acido; pH: 7.1. Mentre per la "registrazione" aCSF: 124 NaCl, 3,7 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1,3 KH2PO4e 10 glucosio; pH: 7.1.
- Mescolare bene le soluzioni e poi mettere il ghiaccio e ossigenare il aCSF affettare al fine di avere freddo durante la rimozione del cervello e il sezionamento successive. Tenere a temperatura ambiente (TA) e fornitura di ossigeno per la registrazione aCSF.
- Posizionare gli strumenti sotto il cofano di dissezione per la rimozione di decapitazione e cervello, vale a dire, ghigliottina, kit di dissezione chirurgica (forbici, pinze, lame) e spatola.
- Consente di impostare i parametri del vibratome selezionando lo spessore di taglio (300 µm in questa preparazione) e la frequenza alle 7 e la velocità a 6. Inserire la camera vibratome in suo spazio adeguato e circondano con ghiaccio.
- Aprire la valvola di carbogen (95% O2, 5% CO2) per ossigenare il "taglio" (aCSF) durante il sezionamento del cervello. Selezionare la portata minima, circa 2 mL/min.
- Prendere due tubi di 15 mL per preparare le condizioni per testare. Aggiungere in una provetta 10 mL della "registrazione" aCSF da solo (gruppo di controllo) e in altro, 10 mL della "registrazione" aCSF arricchita con T30 ad una concentrazione di 2 µM (gruppo trattato). Vortice sia tubi e tenerli sul ghiaccio fino al loro utilizzo nella fase di preparazione di installazione (sezione 3).
2. anestesia, estrazione di cervello e affettare
Nota: In questo studio, 9 P14 tipo selvaggio ratti maschii di Wistar sono stati usati. Estrazione di cervello e affettare successive costituiscono una parte fondamentale del protocollo poiché deve essere eseguite rapidamente (entro 10 min) al fine di prevenire o almeno rallentare i processi di degenerazione del tessuto.
- Aggiungere 1,5 mL 100% w/w di isoflurane su uno strato di cotone nella camera di induzione, metti l'animale all'interno e chiudere il coperchio. Attendere fino a quando l'animale è anestetizzato, confermando l'assenza del riflesso del pedale e quindi decapitare l'animale utilizzando la ghigliottina.
- Mantenere la testa dell'animale all'interno di una pentola contenente ghiacciata affettare aCSF durante la fase di rimozione del cervello (Figura 2A -C).
- Incidere la pelle sopra il cranio con una lama chirurgica, poi tagliare il cranio con le forbici seguendo la linea mediana, dalla parte posteriore e procedere anteriormente fino a raggiungere l'osso sopra gli OB (Figura 2A).
- Tirare lateralmente i due lati del cranio usando un paio di pinze per avere accesso al cervello (Figura 2B). Inserire una spatola ventralmente al cervello, delicatamente scoop fuori e tenere che idratata in aCSF ghiacciata "slicing" per circa 5 min (Figura 2).
- Smaltire il cervello su carta da filtro e tagliare fuori il cervelletto usando una lama (Figura 2D). Incollare il cervello verticalmente sul disco vibratome e inserirlo all'interno della camera di taglio, riempirlo con gelida aCSF "affettare" e fornire ossigeno (Figura 2E).
- Regolare l'intervallo di taglio e procedere con il cervello di sezionamento (Figura 2F). Raccogliere le sezioni che contengono la regione di interesse, come il setto mediale (MS), banda diagonale di Broca (DBB) e substantia innominata (SI), come descritto in precedenza22. Dall'alto verso il basso, le tre fette contengono rostrale (R), intermedio (I) e caudale (C) parte del BF (Figura 2).
- Dividere lungo la linea mediana ogni sezione con piccole forbici, ottenendo due speculari hemislices (Figura 2 H), utilizzati singolarmente come il controllo e la condizione trattata presso sullo stesso piano anatomico.
- Mantenere la hemisections nella camera vibratome per 5-10 minuti, quindi trasferirli con una pipetta di vetro in una pentola di bubbling con registrazione aCSF. Conservare a temperatura ambiente per circa 30 minuti per recuperare.
- Riempire, nel frattempo, tre fiale di vetro con 3 mL di registrazione aCSF da solo (precedentemente preparata al punto 1.6 per il gruppo di controllo) e tre fiale con 3 mL di aCSF arricchito con T30 (precedentemente preparata al punto 1.6) per il gruppo trattato.
3. preparazione di setup
- Trasferire la hemisections nei loro corrispondenti flaconi di vetro (Figura 2I) al fine di avere tre hemislices consecutivi (compresa la regione BF rostrale, intermedia e caudale) per il gruppo di controllo (cornice verde, Figura 2J) e loro controparti per il gruppo trattato (cornice rossa, Figura 2J) di corrispondenza.
- Trasferire il tessuto cerebrale con due pennelli diversi, uno per il hemislices di controllo e un altro per le controparti trattate, al fine di evitare qualsiasi contaminazione tra condizioni.
- Ogni flaconcino di vetro con il coperchio corrispondente, che presenta l'ago ossigenante (21G) (Figura 2J) della guarnizione. Collegare il tubo principale dell'apparato all'origine di carbogen (Figura 2 K). Fornire ossigeno ai hemislices per tutto il periodo di incubazione con una portata minima di 2 mL/min per evitare qualsiasi movimento del tessuto cerebrale e possibili danni meccanici durante l'esperimento. Iniziare l'incubazione di 5 h. Eseguire i passaggi 3.1-3.3 entro 5 min.
Nota: Controllare frequentemente (ogni 15-20 minuti) se l'ossigeno è fornito in tutte le fiale e che il flusso non si muove il tessuto dal basso.
4. campione omogeneizzazione
- Interrompere il flusso di ossigeno dopo l'incubazione e rimuovere tutti i coperchi dai flaconcini. Trasferire la hemislices, utilizzando i pennelli corretta, in provette da 1,5 mL contenente 250 µ l di tampone di Lisi, mantenere i tubi sul ghiaccio (Figura 2 L). Per rendere il lysis buffer, mescolare PBS 1 x con un cocktail di inibitori di proteasi e fosfatasi sia diluito a 1: 100 e omogeneizzare il tessuto con diversi pestelli per prevenire la contaminazione tra i campioni. Completare queste azioni entro 10-15 min.
- Centrifugare il cervello lisato a 1.000 x g per 5 min a 4 ° C. Trasferire il surnatante in nuovi tubi e mantenere i campioni a-80 ° C.
5. la lettura della concentrazione nella proteina e analisi Western Blot
- Determinare la concentrazione di proteina di ogni campione e successivamente preparare le aliquote per l'analisi Western blot come descritto in precedenza22.
- Effettuare analisi statistiche per valutare gli effetti del trattamento sull'espressione della proteina.
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Risultati
Il protocollo presentato qui indica che la somministrazione di un peptide tossico, T30, modula in modo sito-dipendente l'espressione di α7-nAChR, p-Tau e Aβ in sezioni contenenti BF (Figura 3A). Il recettore nicotinico Mostra un aumento significativo nella hemislice rostrale-trattati rispetto alla sua controparte di controllo (fetta 1, p = 0.0310) (Figura 3B), mentre la fetta intermedia non rivela alcun cambiamento tra l...
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Discussione
L'aspetto principale di questo protocollo, basato sulla tecnica del cervello ben consolidata ex vivo , permette di testare in modo sincrono due hemislices speculare, ottenuti sullo stesso piano anatomico, controllo della loro risposta dopo l'applicazione di uno specifico condizione (controllare o trattati); Questo offre quindi un paradigma sperimentale sotto stretto controllato quanto possibile. La possibilità di valutare in un tempo - dose- e site-specific modo diverse sostanze neurochimiche legate al deficit n...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano concorrenti interessi finanziari. Susan A. Greenfield è il fondatore e Presidente di Neuro-Bio Limited, un'azienda privatamente posseduta e detiene azioni della società. Emanuele Brai e Antonella Cogoni sono dipendenti di Neuro-Bio Ltd.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla Neuro-Bio Ltd. Vorremmo ringraziare il Dr. Giovanni Ferrati e Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) per i loro commenti e consigli sul manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cloruro di sodio (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germania | S7653 | Reagente per la preparazione di aCSF |
| Cloruro di potassio (KCl) | Sigma-Aldrich, Germania | P9333 | Reagente per la preparazione di aCSF |
| Bicarbonato di sodio (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germania | S5761 | Reagente per la preparazione di aCSF |
| Solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germania | 63138 | Reagente per preparazione di aCSF |
| Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germania | P5655 | Reagente per preparazione di aCSF |
| Sale di Hepes | Sigma-Aldrich, Germania | H7006 | Reagente per preparazione di aCSF |
| Acido di Hepes | Sigma-Aldrich, Germania | H3375 | Reagente per preparazione di aCSF |
| Glucosio | Sigma-Aldrich, Germania | G7528 | Reagente per la preparazione di aCSF |
| Cloruro di calcio disidratato | Sigma-Aldrich, Germania | 223506 | Reagente per la preparazione di aCSF |
| Peptide T30 | Genosphere Biotechnologies, Francia | Peptide derivato da AChE testato | |
| Kit di dissezione chirurgica | World Precision Instruments, USA | Articolo #: MOUSEKIT | Fase di rimozione del cervello |
| Lame | chirurgicheSwann-Morton, Regno Unito | BS 2982 | Fase di rimozione del cervello |
| da filtro | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Preparazione del cervello per l'affettatura |
| Colla | Preparazione del cervello per l'affettatura | ||
| Vibratomo | Leica, Germania | VT1000 S | Spazzole |
| Manipolazione dei tessuti | |||
| Bombola | di ossigenoFase di sezionamento e incubazione | ||
| 1x Soluzione salina tampone fosfato (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Fase di omogeneizzazione |
| Inibitori della fosfatasi | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Fase di omogeneizzazione |
| Inibitori della proteasi | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Fase di omogeneizzazione |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Fase di omogeneizzazione |
| Microcentrifuga | |||
| Pierce 660 nm Saggio delle proteine | Thermo Scientific, USA | 22660 | Concentrazione delle proteine |
Riferimenti
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