Un modello di ciclo intestinale legati nei polli gratis anestetizzati patogeno specifico per studiare la virulenza di Clostridium Perfringens

Summary

Qui presentiamo un protocollo per creare chirurgicamente 'anse intestinali legati' in intestini di pollo. Questa procedura consente il confronto di virulenza in situ in un singolo host di più ceppi Clostridium perfringens . Questo metodo notevolmente riduce il numero di polli solitamente necessari per simili esperimenti in vivo .

Abstract

Enterite necrotica è stata studiata in polli utilizzando vari modelli in vivo di infezione. La maggior parte di questi utilizzano una combinazione di fattori predisponenti, quali la coccidiosi e dieta, con sonda gastrica o amministrazione tramite il feed utilizzando Clostridium perfringens. In questi modelli, il confronto di più ceppi di c. perfringens per studi di virulenza richiede un numero elevato di host per ottenere risultati significativi. Mortalità durante il corso dello studio può essere elevato a seconda del modello sperimentale, quindi sollevare preoccupazioni di ordine etico per quanto riguarda il benessere degli animali nella ricerca. Lo sviluppo di nuovi modelli di infezione che richiedono meno animali per studiare la patogenesi, ancora fornire risultati statisticamente significativi e validi, è importante nella riduzione dell'uso di animali nella ricerca. Ciclo intestinale dei modelli sono stati utilizzati per studiare le infezioni clostridiali in varie specie come topi, conigli e vitelli. A seguito di interventi chirurgici per creare loop dei segmenti, ceppi di c. perfringens vengono iniettati direttamente i loop per stabilire uno stretto contatto tra i batteri e la mucosa intestinale. Al termine delle procedure dopo poche ore vengono prelevati campioni dell'intestino tenue e del contenuto luminale. Ceppi batterici multipli possono essere inoculati in ogni animale, quindi riducendo il numero di materie richieste negli esperimenti. Inoltre, le procedure vengono eseguite in anestesia generale per ridurre il dolore animale. Nei polli, questo modello sarebbe più appropriato che la somministrazione orale di confrontare la patogenicità del ceppo di c. perfringens perché meno animali sono necessari, fattori predisponenti non sono necessaria per indurre la malattia e dolore è controllato da analgesici . Il modello di ciclo intestinale legato è descritto male nei polli e standardizzazione è essenziale per il suo utilizzo ottima. Questo manoscritto fornisce tutti i passaggi necessari per creare numerose anse intestinali legati nei polli e porta informazioni sui punti critici per ottenere risultati validi.

Introduction

L'uso di modelli animali per studiare le malattie infettive che colpiscono gli esseri umani e animali è uno strumento centrale nella valutazione di fattori di virulenza che regolano la patogenesi di una condizione specifica anche quanto a elaborare strategie per prevenire o curare malattie¹. Nonostante i numerosi vantaggi dell'utilizzo di modelli animali per lo studio di varie malattie, stanno sorgendo preoccupazioni etiche per quanto riguarda questa pratica. I ricercatori hanno bisogno per ridurre al minimo l'uso di animali mentre ottenendo risultati significativi e validi. Il concetto dei 3 principi Rs (sostituire, ridurre e raffinare) è stato elaborato per assicurare che a tali prove sono state affrontate questioni di benessere. Negli studi di enterite necrotica del pollo, in vivo modelli di pollo sono utilizzati per indagare l'eziologia, prevenzione e trattamenti di questa condizione^2,3,4,5. Ceppi patogeni di c. perfringens che trasportano fattori di virulenza specifici, ad esempio la tossina ReteB⁶, sono somministrati per causare enterite necrotica in polli⁷. Il principio di sostituzione è, pertanto, difficile da raggiungere in tal caso come questi fattori di virulenza non possono essere come critici in altre specie animali. Maggior parte dei modelli per l'enterite necrotica nei polli utilizzare una combinazione di fattori di rischio, quali la coccidiosi e alterato dieta per indurre l'enterite necrotica seguita mediante sonda gastrica del brodo di coltura contenenti un elevato numero di c. perfringens². Questi modelli potranno indurre la malattia in un gran numero di polli, e la mortalità può essere importante in tali prove⁸, così sollevando preoccupazioni circa i principi di riduzione e raffinatezza nella ricerca animale.

Anse intestinali dei modelli sono un'alternativa desiderabile per lo studio delle malattie indotte da patogeni intestinali per quanto riguarda la riduzione di principio e la raffinatezza. In questi modelli, vengono creati segmenti intestinali chiamati 'loop' inserendo le legature lungo il tratto intestinale per formare compartimenti indipendenti ed ermetici dove gli agenti patogeni possono essere iniettati solo⁹ o con altre molecole, quali vaccini candidati ^{10 , 11}. gli agenti patogeni di interesse si trovano a stretto contatto con le cellule intestinali e dopo poche ore di tempo di infezione, campioni intestinali possono essere recuperati per ulteriori analisi. Questo consente l'utilizzo di più gruppi di controllo e di trattamento dello stesso animale. Analisi statistica può essere eseguita con modelli di misure ripetute, che aumenta il potere di discriminazione tra gruppi e riduce il numero di polli necessarie rispetto alle prove di alimentazione mediante sonda gastrica orale. Inoltre, le procedure chirurgiche e tempi di infezione successiva vengono eseguite sotto anestesia generale continua e analgesia, quindi riducendo al minimo il dolore animale. Anello chiuso legature sono un modello ideale per ridurre il numero di host e creare un sistema più umano nella ricerca animale.

Anse intestinali dei modelli sono ben descritti in varie specie, come vitelli, conigli e topi^2,9, ma scarsamente descritto in polli⁷. Per un uso ottimale di questo modello chirurgico, l'esecuzione e la tecnica adeguata sono essenziali per la creazione delle anse intestinali legati per evitare danni all'integrità intestinale. L'obiettivo di questo manoscritto è di descrivere un metodo passo passo nella creazione delle anse intestinali multiple in un modello di pollo. Questa tecnica è limitata dalla abilità del chirurgo e dall'esperienza, come procedure esatte sono essenziali per il successo del progetto.

Protocol

Tutte le procedure con l'uso di animali dal vivo sono state autorizzate dal comitato etico della facoltà di medicina veterinaria, Université de Montréal (CÉUA, 'Comité d' éthique de l'utilisation des Animaux').

1. Considerazioni prima dell'intervento chirurgico

1. Selezionare polli gratis della (SPF) Livorno di 10 settimane vecchio agente patogeno specifico per la chirurgia.
   Nota: Il loro peso deve essere tra 1,0 e 1,2 kg.
2. Ritirare il feed 12 h prima le procedure di svuotare il tratto intestinale.
3. Prima dell'intervento chirurgico, posizionare i polli in anestesia generale, seguendo un protocollo verificato da un anestesista. Anestesista ogni pollo 15 min prima dell'intervento con un'iniezione intramuscolare (IM) di midazolam 1 mg/kg e butorfanolo 4 mg/kg. Ripeto, ogni 4 h, l'iniezione di butorfanolo 4 mg/kg IM o quando le modifiche del modello di respirazione e la frequenza aumenta durante l'anestesia. Per l'anestesia generale, durante tutte le procedure, amministrare isoflurano ad una concentrazione compresa tra 1,5 e 2,5% con un tubo endotracheale.
   Nota: L'uso di premedicazione per sedazione ed analgesia è consigliato come essi saranno significativamente migliorare la profondità dell'anestesia, ridurre la quantità di anestetici durante tutte le procedure necessarie, nonché consentire ai ricercatori di controllare i livelli di dolore.
4. Monitorare l'anestesia mediante la registrazione di temperatura corporea, frequenza cardiaca ed elettrocardiogramma (ECG), respiratorio frequenza e del ritmo, saturazione dell'ossigeno, scaduta anidride carbonica (CO₂) e riflessi neurologici.
   Nota: Una persona deve essere assegnata per monitorare questi parametri durante tutte le procedure.
5. Seguire i principi di sterilità durante le procedure chirurgiche. Assicurarsi che il chirurgo e il chirurgo assistente vestito con abiti sterili, guanti, maschera e occhiali protettivi secondo protocolli istituzionali preoperatoria. Assicurarsi che il chirurgo sfrega le mani con una spazzola sterile di clorexidina gluconato impregnato fino al gomito con enfasi sulle unghie e ogni superficie del dito.
6. Sterilizzare gli strumenti chirurgici con uno sterilizzatore.

2. preparazione del sito chirurgica

1. In primo luogo, rimuovere manualmente le piume dall'addome con una lieve trazione.
2. Strofinare il sito chirurgico con una clorexidina gluconato detergente spazzola sterile impregnato. Pulire delicatamente la pelle dal centro verso l'esterno per un tempo totale di contatto di 5 min senza tornare al centro.
3. Eseguire 3 passaggi alternativi sul sito chirurgico con una soluzione di clorexidina gluconato e alcool isopropilico utilizzando garze sterili.
   Nota: Il passaggio deve iniziare dalla metà del sito chirurgico ai bordi per evitare la contaminazione delle aree non disinfettati al sito chirurgico.
4. Posizionare il telo chirurgico sterile sul pollo.

3. estrazione di piccoli intestini dalla cavità addominale

1. Incise il telo chirurgico con le forbici per esporre solo la pelle del sito chirurgico.
2. Incidere la pelle eseguendo un'incisione di basso-mediana forma ' L ' con una lama per bisturi #3.
   1. La prima incisione 1 cm caudale allo sterno di inizio e fine in a 1 cm cranica per la cloaca.
   2. Eseguire la seconda incisione perpendicolare alla prima incisione. A partire dall'estremità caudale della prima incisione e continuare 5 cm sul lato sinistro dell'addome seguendo la linea del bacino.
      Nota: Questa apertura creerà una falda che permetterà una più facile estrazione degli intestini.
3. Con la chirurgia del taglio delle forbici, il peritoneo e i muscoli addominali con lo stesso modello di forma di ' L ' per aprire la cavità addominale.
   Nota: Questo esporrà le sacche d'aria. Nell'intestino si trova sotto queste strutture. Sacche d'aria deve essere umidificata con garze saturate di sterile salina allo 0,85% per evitare l'essiccazione e la possibile rottura durante tutta la procedura.
4. Inserisci un Snook spay gancio nella cavità addominale seguendo la parete addominale di sinistra e lavorare il modo per aggirare le sacche di aria addominale.
5. Delicatamente esternare gli intestini e diffondere questi sul campo operatorio.
   Nota: Mantenere intestino umidificati spruzzando frequentemente sterile salina 0,9% durante tutta la procedura. Inoltre, garze umidificate con soluzione salina sterile possono essere posizionate su intestini per evitare il disseccamento.
6. Afferrare l'intestino utilizzando una garza sterile asciutta ed estrarre delicatamente l'intestino tenue di trazione manuale per esporre il digiuno.
   Nota: Vasi mesenterici sono fragili e una tensione eccessiva può rompersi loro che possono portare a lesioni ischemiche intestinali e notevolmente compromettere l'esito della procedura.

4. fabbricazione delle anse intestinali

1. Creazione di loop n ° 1.
   1. Posto una legatura semplice con un materiale assorbibile sintetico multifilamento di polyglactin nel digiuno prossimale evitando la legatura dei vasi mesenterici importanti.
   2. Posto una legatura distale 2 cm di distanza la legatura prossimale.
      Nota: Legature semplici realizzate con materiale di sutura multifilamento sono disposte lungo il tratto intestinale per creare segmenti di ermetici. Uno schema (Figura 1) descrive la posizione di tutte le legature. Il loop è costituito da una legatura prossimale e distale, separata da 2 centimetri.
2. Creazione di interloop n ° 1.
   1. Posto una legatura semplice 0,5 cm aborally alla legatura distale del ciclo n ° 1.
      Nota: Tra i cicli successivi, ci sono interloops di 1 cm, cioè segmenti facendo una separazione fisica tra i passanti. Per probabilmente ridurre il possibile rischio di contaminazione incrociata da un ciclo a altro, una legatura semplice è posto al centro del interloop (0,5 cm da legatura prossimale e distale di 2 spire adiacenti). Questo riduce il rischio di un possibile contaminante trapelato da un loop per raggiungere la legatura di un loop adiacente. Questi segmenti non sono obbligatori ma diminuiranno il rischio di contaminazione incrociata.
3. Creazione di cicli successivi e interloops.
   1. Ripetere i passaggi da 4.1 e 4.2 per ottenere il numero di loop desiderato.
      Nota: In questo esperimento, 9 loop e 8 interloops sono stati creati. Lunghezza totale ammontava a 26 cm. Il numero di cicli può essere regolato secondo lo studio.

5. iniezione di ceppi di Clostridium perfringens in the loop

1. Iniettare con una siringa sterile ed ago 26 G l'agente patogeno in ciclo n ° 1. Inserire delicatamente l'ago sul lato antimesenteric dell'intestino ad un angolo di 45°.
   Nota: In questo esperimento, 0,2 mL di infuso di cuore cervello (BHI) contenente 1 x 10⁶ CFU (unità formanti colonie) di c. perfringens in fase di crescita del Mid-log è stato iniettato in ogni ciclo. 5 diversi ceppi sono stati iniettati in 5 differenti loop e i 4 restanti loop sono stati iniettati con un controllo negativo non contenente nessun batterio (sterile BHI), agenti patogeni e sterile BHI cicli alternati.
2. Ripetere il passaggio 5.1 per iniettare tutti i cicli.
3. Delicatamente e sostituire il tratto intestinale nella zona dorsale della cavità addominale, sotto le sacche d'aria.

6. chiusura della cavità addominale

1. La sutura del peritoneo e i muscoli addominali.
   1. Con un modello di semplice sutura continua utilizzando un materiale assorbibile sintetico del multifilamento di polyglactin, suturare il peritoneo e i muscoli addominali lungo il bacino (fatta al punto 3.3).
   2. Suturare il peritoneo e i muscoli addominali dallo sterno alla cloaca (effettuata nel passaggio 3.3. con un modello di semplice sutura continua utilizzando un materiale assorbibile sintetico del multifilamento di polyglactin.
2. La sutura della pelle.
   1. Utilizzando un modello di semplice sutura continua e un materiale sintetico multifilamento di polyglactin, chiudere l'incisione della pelle lungo il bacino fatta al punto 3.2.
   2. Utilizzando un modello di semplice sutura continua e lo stesso materiale di legatura multifilamento, chiudere l'incisione della pelle dallo sterno alla cloaca fatta al punto 3.2.

7. conclusione

1. Dopo le procedure chirurgiche, tenere il pollo in anestesia generale con un corretto uso degli analgesici per ridurre al minimo dolore animale durante il periodo di infezione. Continuare il monitoraggio anestetico per garantire un livello di anestesia adeguata.
2. Dopo il tempo desiderato infezione, umanamente eutanasia il pollo di dislocazione cervicale in anestesia generale.
   Nota: Per queste procedure, il tempo necessario per indurre lesioni microscopiche con ceppi patogeni c. perfringens è stato 7 h.
3. Con una lama per bisturi #3, tagliare un 0,5 cm a sezione di 1 cm lungo ciclo e posizionarlo in formalina al 10% per l'analisi durante la notte e ulteriore istopatologico di fissazione.
4. Con la stessa lama per bisturi, tagliare la rimanente sezione loop e inserirlo in una microcentrifuga sterile per l'isolamento dei ceppi di c. perfringens in ogni analisi batteriologica ulteriore ciclo per la loro caratterizzazione genetica.
5. Ripetere i passaggi 7.2 e 7.3 per tutti i cicli di sostituzione della lama bisturi tra ogni ciclo.

Results

Uno schema delle anse intestinali 9 e 8 interloops è illustrato nella Figura 1. In questo modello, un totale di 9 cicli e 8 interloops vengono creati con semplici legature. Un ciclo è costituito da legature prossimale e distale, distanziate di 2 cm misurato dalla legatura prossimale. Due spire adiacenti sono separati da un interloop di 1 cm. Per diminuire il possibile rischio di contaminazione incrociata tra cicli di perdita da una legatura, una legatura inte...

Discussion

Modelli di anse intestinali sono stati descritti in numerose specie per studiare l'interazione ospite-patogeno e la patogenesi di malattie causate da vari agenti patogeni intestinali, quali Clostridium perfringens, Clostridium difficile e Salmonella enterica^7,9,13,14,15. È stato utilizzato anche per analizzare la risposta immunitaria...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EZ-Scrub 747	Becton Dickinson and Company		4% clorexidina gluconato detergente impregnato di pennello sterile. Nessun numero di catalogo disponibile. Sito web: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes
Alcool isopropilico 70% USP 4 L	Alcool isopropilico commerciale	P016IP70	Indirizzo web: http://www.comalc.com/products/
Cloexidina	Sigma-Aldrich	282227-1G	Soluzione di clorexidina gluconato, deve essere diluito al 4%. Indirizzo web: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE
Telo chirurgico piccolo (27 pollici x 24 pollici) con 3 x 6 pollici Fenestrazione	Prodotti speciali veterinari	32724	Indirizzo web: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog. detail&productgroup_id=15
Lame per bisturi #3	Swann-Morton	301	Indirizzo web: https://www.swann-morton.com/product/16.php
Soluzione salina sterile NaCl 0,9%	Sigma-Aldrich	S8776-100ML	Indirizzo web: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA
Vicryl 3-0	Ethicon	D9003	Materiale di sutura assorbibile multifilamento Polyglactina. Indirizzo web: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture
Siringa 1 ml con ago da 26G	Becton Dickinson and Company	329652	Indirizzo web: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes
Brain Heart Infusion	Sigma-Aldrich	1104930500	Indirizzo web: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr®ion=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
Eppendorf provetta	Sigma-Aldrich	T9661-500EA	Provetta per microcentrifuga. Indirizzo web: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh 30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
Soluzione di formalina, neutra tamponata, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	Rapporto tessuto: formalina di 1: 10 per un'adeguata fissazione. Sito web: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA
Clostridium perfringens ceppi	Université de Montré al, Chaire en recherche avicole	N/A	Specifico per ogni laboratorio, disponibile su richiesta all'autore corrispondente