Integrare la citometria a flusso di Imaging e trascrittomica profilatura per valutare alterata CD1d endocitico traffico

Summary

Citometria a flusso di imaging fornisce un approccio ideale per rilevare l'alterazione morfologica e funzionale delle cellule a livello individuale e popolazionale. Funzione endocitico interrotte per la presentazione dell'antigene del lipido in cellule dendritiche umane esposti a inquinanti è stata dimostrata con un' Transcrittomica combinato del profilo di espressione genica e morfologiche dimostrazione di traffico della proteina.

Abstract

Popolazionale analisi dell'alterazione morfologica e funzionale delle proteine endocitiche sono difficili a causa della richiesta di acquisizione di immagini ad un'analisi di livello e Statistiche immagine singola cella a livello popolazionale. Per superare questa difficoltà, abbiamo usato imaging citometria a flusso e trascrittomica profilatura (RNA-seq) per determinare alterata localizzazione subcellulare del cluster di differenziazione 1d proteina (CD1d) connessa con l'espressione di gene endocitico compromessa in umani le cellule dendritiche (DCs), che sono stati esposti al comune lipofilico aria inquinante benzo pirene [a]. La colocalizzazione di CD1d e proteine endocitiche marker Lamp1 da migliaia di cellule immagini catturate con imaging citometria a flusso è stata analizzata utilizzando idee e ImageJ-Fiji programmi. Numerose immagini cellulare con co-macchiato CD1d e Lamp1 proteine sono state visualizzate dopo gating su CD1d⁺Lamp1⁺ DCs utilizzando idee. La colocalizzazione di CD1d e Lamp1 avanzata su BaP esposizione è stata ulteriormente dimostrata utilizzando con soglia scatterplot, testato con coefficienti di Mander per intensità co-localizzati e tracciati basato sulla percentuale di aree co-localizzate utilizzando ImageJ-Fiji. I nostri dati forniscono un approccio strumentale e bioinformatica vantaggioso per misurare la colocalizzazione di proteina a livello cellulare sia singolo che popolazionale, sostenendo un risultato funzionale alterato di trascrittomica alterazione in umani esposti a inquinanti Controller di dominio.

Introduction

Presentazione dell'antigene coinvolge tipicamente la proteina intracellulare di traffico, che è stato spesso studiata mediante caratterizzazione morfologica e profilatura fenotipica dell'antigene che presenta le cellule^1,2,3 . Per integrare i vantaggi dell'imaging e metodi phenotyping, descriviamo una imaging piattaforma di analisi a livello di popolazione per dimostrare una colocalizzazione di proteina alterata in cellule dendritiche (DCs) e singola cella. Nella presentazione dell'antigene del peptide, complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I molecole legare....

Protocol

Protocolli di umani in questo studio sono stati approvati dalla Institutional Review Board dell'Università di Cincinnati e tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le direttive e i regolamenti. I campioni di sangue da donatori sani sono stati ottenuti dal centro di sangue Hoxworth presso l'Università di Cincinnati Medical Center.

1. Transcrittomica profilatura di esposti a inquinanti umano DCs monocito-derivato

1. Estrazione di RNA totale dei DCs BaP-esposti
   1. Differenziare umano DCs tramite citochine GM-CSF e IL-4 ed esporre DCs per BaP per 4 giorni¹³.
   2. Ordinare DCs BaP-esposti med....

Results

L'inquinante lipofilico BaP altera cluster genici endocitosi in umano DCs. Human monocito-derivate DCs da ciascun donatore (n = 3) sono stati incubati con BaP e ordinati per DCs convenzionali, che più ulteriormente sono stati utilizzati per l'analisi di estrazione e trascrittomica RNA come descritto . Al momento la normalizzazione dell'espressione genica, geni alterati tra gruppi BaP-esposti e non esposti sono stati raggruppati secondo la correlazione funzionale dei geni differenzialmente.......

Discussion

Conferma funzionale di una via di gene alterato è impegnativo, a causa di espressione genica ampiamente incastrato che coinvolgono le vie multiple e la difficoltà di integrare attività cellulari individuali e popolazionale. Abbiamo impiegato imaging flusso cytometry in particolare prova CD1d traffico endocitico scomparti. Citometria a flusso di imaging integra la misura popolazionale delle cellule e la dimostrazione individuo di colocalizzazione subcellulare delle proteine multiple. Microscopia confocale ha fornito prece.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trascrittomica	Illumina	HiSeq 2500 v4	Sistema Illumina HiSeq
ImagingStream X	Millipore	100220	Citometria a flusso
di imaging mirVana miRNA Kit di isolamento	Thermo Fisher		Estrazione dell'RNA totale
Agilent RNA 6000 Pico Kit	Agilent		del controllo qualità dell'RNA totale
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler	Thermo		PCR, reazione enzimatica
NEBNext Poly(A) mRNA Modulo di isolamento magnetico	Purificazione dell'RNA PolyA	New England Biolab
Sistema automatizzato SMARTer Apollo Purificazione	dell'RNA	Takara
NEBNext Kit di preparazione della libreria Ultra RNA per Illumina	New England Biolab		Preparazione della libreria
Perle magnetiche Agencourt AMPure XP	Purificazione del DNA di Beckman Coulter
Bioanalizzatore 2100	Agilent		Library QC, analisi della distribuzione dimensionale
Kit DNA ad alta sensibilità Agilent			Library QC, analisi della distribuzione dimensionale
Sistema PCR in tempo reale QuantStudio 5 (Thermo Fisher)	Quantificazione della libreria	Thermo Fisher
NEBNext Library Quant Kit	New England Biolab		Quantificazione
della libreriacBot	Illumina		Library generazione di cluster
TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – Generazione	di cluster	Illumina
HiSeq 1000	Illumina		Sequencing
TruSeq SBS Kit v3 - HS (50 cicli)	Illumina		Sequencing
Ficoeritrin/Cianina 7 (PE/Cy7)	Bio Legend	L243
Ficoeritrina/Cianina 5 (PE/Cy5)	Bio Legend	3.9
Viola brillante 421	Bio Legend	L161
PE-anti-topo IgG2b	Bio Legend	51.1
Alexa Fluor 647 (AF647)	Bio Legend	CD107a(H4A3)