Integrare la citometria a flusso di Imaging e trascrittomica profilatura per valutare alterata CD1d endocitico traffico

Manju Sharma; Xiang Zhang; Shouxiong Huang

doi:10.3791/57528

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Articolo metodologico

Integrare la citometria a flusso di Imaging e trascrittomica profilatura per valutare alterata CD1d endocitico traffico

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DOI:

10.3791/57528

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29 ottobre 2018

Manju Sharma¹ , Xiang Zhang¹ , Shouxiong Huang¹

¹Department of Environmental Health, University of Cincinnati College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Citometria a flusso di imaging fornisce un approccio ideale per rilevare l'alterazione morfologica e funzionale delle cellule a livello individuale e popolazionale. Funzione endocitico interrotte per la presentazione dell'antigene del lipido in cellule dendritiche umane esposti a inquinanti è stata dimostrata con un' Transcrittomica combinato del profilo di espressione genica e morfologiche dimostrazione di traffico della proteina.

Abstract

Popolazionale analisi dell'alterazione morfologica e funzionale delle proteine endocitiche sono difficili a causa della richiesta di acquisizione di immagini ad un'analisi di livello e Statistiche immagine singola cella a livello popolazionale. Per superare questa difficoltà, abbiamo usato imaging citometria a flusso e trascrittomica profilatura (RNA-seq) per determinare alterata localizzazione subcellulare del cluster di differenziazione 1d proteina (CD1d) connessa con l'espressione di gene endocitico compromessa in umani le cellule dendritiche (DCs), che sono stati esposti al comune lipofilico aria inquinante benzo pirene [a]. La colocalizzazione di CD1d e proteine endocitiche marker Lamp1 da migliaia di cellule immagini catturate con imaging citometria a flusso è stata analizzata utilizzando idee e ImageJ-Fiji programmi. Numerose immagini cellulare con co-macchiato CD1d e Lamp1 proteine sono state visualizzate dopo gating su CD1d⁺Lamp1⁺ DCs utilizzando idee. La colocalizzazione di CD1d e Lamp1 avanzata su BaP esposizione è stata ulteriormente dimostrata utilizzando con soglia scatterplot, testato con coefficienti di Mander per intensità co-localizzati e tracciati basato sulla percentuale di aree co-localizzate utilizzando ImageJ-Fiji. I nostri dati forniscono un approccio strumentale e bioinformatica vantaggioso per misurare la colocalizzazione di proteina a livello cellulare sia singolo che popolazionale, sostenendo un risultato funzionale alterato di trascrittomica alterazione in umani esposti a inquinanti Controller di dominio.

Introduzione

Presentazione dell'antigene coinvolge tipicamente la proteina intracellulare di traffico, che è stato spesso studiata mediante caratterizzazione morfologica e profilatura fenotipica dell'antigene che presenta le cellule¹^,²^,³. Per integrare i vantaggi dell'imaging e metodi phenotyping, descriviamo una imaging piattaforma di analisi a livello di popolazione per dimostrare una colocalizzazione di proteina alterata in cellule dendritiche (DCs) e singola cella. Nella presentazione dell'antigene del peptide, complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I molecole legare un peptide breve (8-10 residui) nel reticolo endoplasmatico per attivare CD8 convenzionale⁺ T cellule, mentre le molecole di MHC classe II legano una relativamente più lungo peptide (~ 20 residui) in compartimenti endocitosi per attivare convenzionale CD4 cellule⁺ T¹^,⁴. Al contrario, le cellule T del lipido-specifiche vengono attivate dalle proteine CD1 con antigeni lipidici caricati principalmente in compartimenti endocitico⁵^,⁶. Presentazione dell'antigene del lipido richiede la fornitura dei metaboliti lipidici prodotti nel metabolismo dei lipidi⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰ e il caricamento dei metaboliti lipidici funzionale alle proteine CD1 in compartimenti endocitico⁵^,⁶. In questo contesto, vari fattori cellulari modulando la presentazione dell'antigene del lipido, specialmente in esposizione ambientale delle sostanze inquinanti lipofilici e disturbi del sistema immunitario, sono fondamentali per essere definito. In questo studio, abbiamo usato analisi trascrittomica, immagine di profilatura e analisi di imaging cellulare e popolazionali di DCs monocito-derivato umano per determinare il traffico di proteine endocitiche contribuendo alla presentazione dell'antigene del lipido in esposizione della sostanza inquinante. Certamente, questa piattaforma combinata può essere applicata a studiare traffico sottocellulare della proteina e la colocalizzazione in diversi processi biologici.

Tecnicamente, la localizzazione sottocellulare della proteina solitamente è stata dimostrata usando la microscopia confocal e analizzati statisticamente in un numero limitato di cellule rilevato¹^,²^,³^,¹¹. Inoltre, citometria a flusso è stato ampiamente applicato a popolazioni di cellule di cancello con segnali co-macchiati delle proteine multiple a un livello cellulare¹²; Tuttavia, questo non dispone di una visualizzazione dettagliata di colocalizzazione subcellulare della proteina. Per ottenere analisi complete e statistiche di colocalizzazione di proteina percentuale a livello cellulare e popolazione, incorporiamo approcci di profilatura e di analisi per determinare le caratteristiche di colocalizzazione di proteina con biologico di imaging rilevanza. In particolare, utilizziamo imaging citometria a flusso per rilevare la colocalizzazione di CD1d e proteine di membrana lisosomiale-collegata 1 (Lamp1) proteine in questo studio. Analisi quantitativa delle molecole colocalized era precedentemente difficile da eseguirsi alla scala popolazionale. In questo studio, abbiamo adattato il programma ImageJ-Fiji per esaminare la percentuale di colocalizzazione di proteine con un gran numero di cellule co-marcate a livello cellulare sia popolazionale e individuali. In particolare, abbiamo misurato zone co-localizzate, intensità e dimensione popolazionale a sostegno della conclusione che la proteina CD1d in gran parte è stata conservata in compartimenti tardi endocitosi di DCs umano nell'esposizione a un inquinante lipofilico benzo [a] pirene (BaP)¹³. Questa popolazione analisi di imaging e combinato cellulare fornito risultati altamente riproducibili, completi e statisticamente significative di CD1d-Lamp1 colocalizzazione pertinenti alla presentazione dell'antigene lipidica inibita.

Il trascrittoma di BaP-esposti umano DCs fortemente sostenuto l'ipotesi che il metabolismo lipidico endocitosi e CD1d endocitico traffico sono stati alterati in BaP esposizione. Per verificare questa ipotesi, abbiamo applicato imaging flusso cytometry per profilare le immagini della popolazione DC che co-sono state macchiate con più proteine tra cui CD1d, endocitosi marcatori e DC. Infine, le cellule co-macchiate sono state analizzate statisticamente per dimostrare la percentuale di intensità e aree di colocalizzazione CD1d e Lamp1.

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Protocollo

Protocolli di umani in questo studio sono stati approvati dalla Institutional Review Board dell'Università di Cincinnati e tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le direttive e i regolamenti. I campioni di sangue da donatori sani sono stati ottenuti dal centro di sangue Hoxworth presso l'Università di Cincinnati Medical Center.

1. Transcrittomica profilatura di esposti a inquinanti umano DCs monocito-derivato

Estrazione di RNA totale dei DCs BaP-esposti
1. Differenziare umano DCs tramite citochine GM-CSF e IL-4 ed esporre DCs per BaP per 4 giorni¹³.
2. Ordinare DCs BaP-esposti mediante citometria a flusso basato sui marcatori di superficie espressi (lignaggio^–HLA-DR⁺), la maggioranza dei quali è costituito da DCs convenzionali (CD11c⁺CD1c⁺)¹³. In genere, ordinare 10.000 DCs in mezzo di coltura contenente 10% FBS, centrifugare DCs a 600 x g e a 4 ° C per 6 minuti e immediatamente eliminare il surnatante tramite aspirazione usando la punta di una pipetta da 1 mL.
3. Una volta che il surnatante viene rimosso mediante aspirazione, lisare il pellet cellulare aggiungendo 0,4 mL di tampone di lisi/associazione dal kit di isolamento del RNA per la conservazione a-80 ° C prima dell'estrazione di RNA.
4. Utilizzare il kit di isolamento del RNA con il protocollo di estrazione di RNA totale per estrarre l' RNA totale¹⁴. Misurare l'integrità di RNA usando un Bioanalyzer¹⁵.
Analisi trascrittomica di ordinato DCs (Figura 1A)
1. Preparare la libreria per RNA-seq utilizzando un kit di preparazione di RNA biblioteca. In breve, frammento isolato RNA poli-A (~ 200 bp), inversione trascrivere i frammenti al 1 ° filone del cDNA e seguire la seconda sintesi del cDNA filo etichettata con dUTP.
2. Lega i doppio filamento cDNA per l'adattatore con una struttura del gambo-ciclo dopo purificazione perlina, fine-riparazione e dA-tailing. Asportare i residui di uracile nel filo del 2 ° del ciclo del cDNA e adattatore con enzima utente (uracile-specifica l'asportazione reagente) per mantenere la specificità di strand e aprire l'anello adattatore per PCR.
  1. Eseguire 13 cicli di PCR utilizzando primers universali e indice specifico per arricchire la libreria indicizzata. Ripulire la libreria ed eseguire su un chip Bioanalyzer DNA ad alta sensibilità per controllare la qualità di raccolta e distribuzione dimensione.
3. Utilizzare un kit di quantificazione di libreria e un sistema PCR in tempo reale combinata con informazioni sulle dimensioni di libreria per calcolare concentrazione libreria tramite un metodo di curva standard.
4. Proporzionalmente piscina individualmente indicizzate librerie compatibili e regolare la concentrazione totale finale a 15 pM. Eseguire la generazione di cluster di biblioteca e la libreria in un'impostazione di lettura singola 1 x 50 bp per generare letture 25 milioni per campione di sequenza.
Sequenziamento
1. Caricare il sequenziamento e l'indicizzazione di reagenti per i rack di reagente SBS e PE, rispettivamente. Porre i reagenti in un bagno di acqua di laboratorio-grado per 1 h fino a quando tutto il ghiaccio si è sciolto e i reagenti in ogni bottiglia/tubo sono miscelati correttamente.
2. Preparare la miscela ICB aggiungendo l'enzima scongelato, colorante e -20 ° C alla bottiglia e mescolare. Preparare una soluzione di NaOH secondo le istruzioni di sequenziamento. Posizionare tutti i reagenti a 4 ° C fino all'uso.
3. Durante la 1 h potenza del sequenziatore di periodo, di attesa. Attendere che l'unità DONOTEJECT a comparire e collegare il computer a un'unità di rete.
4. Avviare il software di controllo di sequencer.
5. Preparare 2 L di soluzione di lavaggio di manutenzione che contiene 0,5% Tween 20 e 0,03% ProClin 300 in laboratorio-grado acqua.
6. Nel rack reagente SBS, aggiungere ~ 100 mL di soluzione di lavaggio di manutenzione per ciascuna delle 8 bottiglie e tappi a vite imbuto per le bottiglie. Nel rack PE reagente, aggiungere ~ 12 mL di soluzione di lavaggio di manutenzione a ciascuno dei dieci provette coniche da 15 mL e gettare i tappi.
7. Caricare due cesti con il soluzione riempito bottiglie/tubi per il sequencer.
8. Il software di controllo di sequencer, scegliere il lavaggio di manutenzione; seguire le istruzioni sullo schermo per pulire il sistema fluido di sequencer, fino a quando il processo è completato.
9. Avviare una nuova esecuzione nella scheda "Sequenza" dal software; dirigere l'output dei dati su un'unità di rete. Scegliere i parametri per la singola lettura 1 x 50 bp con unico indice multiplexata librerie.
10. Facoltativamente, accedere all'hub di sequenza di BaseSpace modo che lo stato di ordinamento può essere monitorato da remoto tramite un computer o smart phone.
11. Caricare un foglio di esempio per demiscelare e forniscono informazioni di reagente secondo il requisito del software.
12. Caricare i reagenti SBS e PE per il sequencer. Preparare il sistema con una cella di flusso utilizzati (~ 15 min).
13. Una volta completata la generazione di cluster (~4.5 h), togliere la cella di flusso, leggermente spruzzare la cella di flusso con acqua e pulire asciugare con carta per lenti. Leggermente spruzzare la cella di flusso con etanolo al 95% e asciugarlo. Verifica contro una luce per assicurarsi che la superficie sia pulita senza detriti o residui di sale.
14. Una volta completata la fase di primo, caricare la cella di flusso in cluster e avviare il sequenziamento. Verrà avviato automaticamente il software del Visualizzatore di analisi di sequenza.
15. Monitorare la qualità dei dati di sequenziamento tramite SAV compreso densità di cluster, filtro passa letture, cluster pass filtro %, ≥Q30%, % di fase/profase Legacy, QC, ecc. , che questo aiuta a capire la qualità dei dati e risolvere i problemi di indicizzazione.
16. Cambiare la guarnizione di cella di flusso ed eseguire un lavaggio di manutenzione dopo aver completato il sequenziamento. Il sequencer è pronto per la prossima corsa.
Analisi bioinformatica
1. Eseguire bioinformatica RNA-seq dati analisi¹³.

2. percorso analisi dei profili di trascrittomica (Figura 1B)

Utilizzare un edgeR Bioconductor per confrontare risultante gene espressione intensità conteggi tra controller di dominio BaP-esposti e non esposti da tre donatori. Quindi, identificare geni differenzialmente espressi tra BaP-esposti e non esposti DCs basata sul cambiamento assoluto piega (> 2 pieghe) e la falsa scoperta valuta i valori (FDR) - regolato p-(< 0.05).
Per predire i gruppi funzionali di differenzialmente espressi geni, utilizzare il pacchetto di software ToppCluster per cercare i geni alterati contro diversi database compresi KEGG e REACTOME e generare dati di clustering. ToppCluster utilizza il test ipergeometrica per ottenere arricchimento funzionale tramite il gene elenco arricchimento analisi¹⁶.
Ulteriore contributo i risultati da questi ammassi di funzione a Cytoscape¹⁷^,¹⁸ versione 3.3.0, una piattaforma di software ampiamente usato open source per la visualizzazione di reti complesse. Così, i geni coinvolti in diversi cluster o vie, compreso i cluster di endocitosi e metabolismo dei lipidi, sono mostrati in una rete con annotazione di colore del cambiamento piega media del gene expression (Figura 1B)¹³.

3. flusso Cytometry di CD1d e Lamp1 colocalizzazione di imaging

Anticorpo di etichettatura di BaP-esposti DCs
1. Expose 0,5 x 10⁶ umano DCs a 5,94 mM BaP per 4 giorni a 37 ° C in 2 mL di Dulbecco completa Medium dell'Aquila per volta. Vendemmia DCs mediante centrifugazione a 400 x g per 10 min. blocco il DCs differenziato incubando le cellule con siero umano blocker e anticorpi del ricevitore di Fc anti-umani per 10 min in ghiaccio, tra cui anticorpi anti-umani CD16, CD32 e CD64.
2. Incubare viola brillante 421-anti-CD1c (L161), ficoeritrina/cianina tingere 7 (PE/Cy7) - anti - HLA-DR e PE/Cy5-anti-CD11c con DCs per 20 min in ghiaccio. La tabella 1 Mostra l'elenco degli anticorpi.
3. Difficoltà DCs con paraformaldeide al 4% in PBS e li permeabilize con tampone di lavaggio di permeabilizzazione. Eseguire la colorazione intracellulare con una miscela di PE-labeled purificato anti-umano CD1d (51,1) e Alexa Fluor 647-etichetta anti-Lamp1 (CD107a) (H4A3).
Misurazione di citometria a flusso (Figura 2) di imaging
1. Analizzare i campioni macchiati utilizzando un citometro a flusso imaging presso il nucleo di citometria a flusso dell'ospedale dei bambini di Cincinnati utilizzando un obiettivo 40x per produrre 300 pixel per una cella con circa 10 mm di diametro. Dimensione di un pixel è di circa 0,5 mm di 0.5 mm dell'oggetto.
2. Acquisizione di 10.000 immagini cellulare in modo imparziale secondo le istruzioni del fabbricante.

4. analisi di flusso Cytometry immagini di imaging

Analisi di colocalizzazione utilizzando idee software (Figura 2)
1. Eseguire la compensazione con singolo-macchiato contro campioni non macchiato impostando l'intensità della fluorescenza di campioni non tinto sotto la soglia, tra cui non macchiato di BaP-esposti DCs con BaP autofluorescenza, come dati di routine flusso cytometry analisi.
2. Cancello macchiato le cellule per ottenere i sottoinsiemi di HLA-DR⁺CD11c⁺CD1d⁺Lamp1⁺ cellule (Figura 2A) e visualizza immagini cellulare i sottoinsiemi gated (Figura 2B).
3. Salvare le immagini di cella in un formato png basato su due criteri di inclusione tecniche, la presenza visiva di forti segnali co-macchiati e localizzazione subcellulare delle proteine CD1d e Lamp1, per le analisi di colocalizzazione usando ImageJ-Fiji (Figura 2B).
Utilizzare software ImageJ-Fiji per eseguire analisi di colocalizzazione (Figura 3).
1. Preparare i file di immagine in ingresso unendo le 100 immagini di cella salvato per DCs umano non esposte e BaP-esposti, rispettivamente (Figura 3A).
2. Analizzare CD1d (rosso) e Lamp1 colocalizzazione (verde) utilizzando un scatterplot.
  1. Eseguire il programma di ImageJ-Fiji. Aprire il file. png con 100 immagini di cella (Figura 3B e Figura 4A): "File | Apri".
  2. Dividere l'immagine con canali rosso e verde Unite in due immagini con un rosso o un canale verde: "immagine | Colore | Dividere i canali".
  3. Disegnare un scatterplot utilizzando i comandi "Analyze | Colocalizzazione | Soglia di colocalizzazione". Salvare il scatterplot utilizzando il tasto "Stamp" .
3. Calcolare i coefficienti di colocalizzazione di Mander per ogni singola immagine cellulare (n = 100) (Figura 4B)
  1. Selezionare un'immagine singola cella sul file di immagine con canali di divisione utilizzando il "ovale" strumento di selezione.
  2. Utilizzare i comandi "Analyze | Colocalizzazione | Soglia di colocalizzazione". Selezionare "Canale 1" dalla finestra di dialogo della regione di interesse (ROI). Mantenere tutte le opzioni di calcolo, tra cui "Mander utilizzando soglie" per ogni immagine di cella.
  3. Ripetere questo calcolo per tutte le immagini di 100 cellule.
  4. Salvare e aprire i risultati utilizzando un foglio di calcolo.
  5. Tracciare i media e gli errori standard per "Coefficienti di Mander con soglia" (n = 100, 0 significa nessuna colocalizzazione e 1 significa colocalizzazione perfetto). Utilizzare test t di Student per calcolare il valore di p per il confronto tra gruppi di BaP-esposti e non esposti (Figura 4B).
4. Calcolare la percentuale di intensità di pixel con soglia co-localizzato tra CD1d e Lamp1 per immagini multiple delle cellule (n = 100) (Figura 4).
  1. Utilizzare lo stesso protocollo di analisi in 4.2.3 e inoltre selezionare l' opzione di risultato "% intensità sopra soglia colocalized".
  2. Eseguire questa analisi insieme ai coefficienti di colocalizzazione di Mander.
  3. Allo stesso modo di tracciare i media e gli errori standard per intensità % colocalized tra CD1d e Lamp1. Utilizzare test t di Student per calcolare il valore di p per il confronto tra gruppi di BaP-esposti e non esposti (Figura 4).

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Risultati

L'inquinante lipofilico BaP altera cluster genici endocitosi in umano DCs. Human monocito-derivate DCs da ciascun donatore (n = 3) sono stati incubati con BaP e ordinati per DCs convenzionali, che più ulteriormente sono stati utilizzati per l'analisi di estrazione e trascrittomica RNA come descritto . Al momento la normalizzazione dell'espressione genica, geni alterati tra gruppi BaP-esposti e non esposti sono stati raggruppati secondo la correlazione funzionale dei geni differenzialmente...

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Discussione

Conferma funzionale di una via di gene alterato è impegnativo, a causa di espressione genica ampiamente incastrato che coinvolgono le vie multiple e la difficoltà di integrare attività cellulari individuali e popolazionale. Abbiamo impiegato imaging flusso cytometry in particolare prova CD1d traffico endocitico scomparti. Citometria a flusso di imaging integra la misura popolazionale delle cellule e la dimostrazione individuo di colocalizzazione subcellulare delle proteine multiple. Microscopia confocale ha fornito prece...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Robert Giulitto (centro di sangue Hoxworth) per campioni di sangue umano e legge Dr. Liang Niu per la normalizzazione dell'espressione genica. Ringraziamo anche sovvenzioni dal National Institute of Environmental Health Sciences (ES006096), Center for progetto pilota ambientale genetica (CEG) (S.H.), Istituto nazionale di allergie e malattie infettive (AI115358) (S.H.), Università di Cincinnati University Research Council award (S.H.) e Università di Cincinnati College di medicina Enhancement finanziamento di base (X. Z.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Trascrittomica	Illumina	HiSeq 2500 v4	Sistema Illumina HiSeq
ImagingStream X	Millipore	100220	Citometria a flusso
di imaging mirVana miRNA Kit di isolamento	Thermo Fisher		Estrazione dell'RNA totale
Agilent RNA 6000 Pico Kit	Agilent		del controllo qualità dell'RNA totale
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler	Thermo		PCR, reazione enzimatica
NEBNext Poly(A) mRNA Modulo di isolamento magnetico	Purificazione dell'RNA PolyA	New England Biolab
Sistema automatizzato SMARTer Apollo Purificazione	dell'RNA	Takara
NEBNext Kit di preparazione della libreria Ultra RNA per Illumina	New England Biolab		Preparazione della libreria
Perle magnetiche Agencourt AMPure XP	Purificazione del DNA di Beckman Coulter
Bioanalizzatore 2100	Agilent		Library QC, analisi della distribuzione dimensionale
Kit DNA ad alta sensibilità Agilent			Library QC, analisi della distribuzione dimensionale
Sistema PCR in tempo reale QuantStudio 5 (Thermo Fisher)	Quantificazione della libreria	Thermo Fisher
NEBNext Library Quant Kit	New England Biolab		Quantificazione
della libreriacBot	Illumina		Library generazione di cluster
TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – Generazione	di cluster	Illumina
HiSeq 1000	Illumina		Sequencing
TruSeq SBS Kit v3 - HS (50 cicli)	Illumina		Sequencing
Ficoeritrin/Cianina 7 (PE/Cy7)	Bio Legend	L243
Ficoeritrina/Cianina 5 (PE/Cy5)	Bio Legend	3.9
Viola brillante 421	Bio Legend	L161
PE-anti-topo IgG2b	Bio Legend	51.1
Alexa Fluor 647 (AF647)	Bio Legend	CD107a(H4A3)

Analisi Fisher del PolyAHS Library

Riferimenti

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Colocalizzazione di proteine endocitiche esposizione al benzo[a]pirene cellule dendritiche umane analisi del coefficiente di Mander sequenziamento dell'RNA ImageJ Fiji software IDEAS

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