Articolo metodologico

Valutazione dell'inclusione dell'esone indotta da impiombare commutazione oligonucleotidi antisenso in fibroblasti del paziente di SMA

DOI:

10.3791/57530

⸱

11 maggio 2018

 ,  , 
1Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, 2Muscular Dystrophy Canada Research Chair, Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry

In questo articolo

Sommario

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Vari oligonucleotidi antisenso (AON) sono stati indicati per indurre l'inclusione dell'esone (modulazione della giuntura) e salvataggio espressione SMN per l'atrofia muscolare spinale (SMA). Qui, descriviamo un protocollo per AON presenti per indurre l'inclusione dell'esone del gene SMN2 e i metodi di valutazione per determinare l'efficacia in fibroblasti di pazienti SMA.

Abstract

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Atrofia muscolare spinale (SMA), una letale malattia neurologica causata dalla perdita di SMN1, presenta un caso unico nel campo del oligonucleotide antisenso (AON)-mediata di terapia. Mentre mutazioni SMN1 sono responsabili della malattia, AONs targeting siti di silenziatore (ISS) di giuntura intronic in SMN2, compreso nusinersen approvato dalla FDA, sono stati indicati per ripristinare espressione SMN e migliorare i sintomi. Attualmente, molti studi che coinvolgono la terapia AON per SMA concentrano sullo studio di nuovi prodotti chimici per AON targeting SMN2 che possono essere più efficaci e meno tossici rispetto nusinersen. Qui, descriviamo un protocollo per la valutazione in vitro dell'inclusione dell'esone utilizzando presenti di AONs seguita da reazione a catena della polimerasi d'inversione della trascrizione (RT-PCR), reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) e Western blotting. Questo metodo può essere impiegato per vari tipi di prodotti chimici per AON. Utilizzando questo metodo, dimostriamo che AONs composto da bloccato alternati degli acidi nucleici (LNA) e nucleotidi del DNA (LNA/DNA mixmers) conducono alla efficiente l'inclusione dell'esone di SMN2 e ripristino della proteina SMN a una concentrazione molto bassa e di conseguenza, LNA / Oligonucleotidi antisenso di DNA basata su mixmer possono essere una strategia terapeutica attraente per trattare d'impionbatura difetti causati da malattie genetiche. Il metodo in vitro valutazione qui descritto è veloce, facile e abbastanza sensibile per la sperimentazione di vari AONs romanzo.

Introduzione

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Atrofia muscolare spinale (SMA) è un disordine neuromuscolare mortale trasmessa come carattere autosomico recessivo. È caratterizzato dalla degradazione dei motoneuroni e progressiva tronco e degli arti muscolo paralisi1,2. La maggior parte delle occorrenze di SMA è dovuta a una mutazione omozigotica del gene di sopravvivenza del neurone del motore 1 (SMN1)3. Il gene di sopravvivenza del neurone del motore 2 (SMN2) è un duplicato inverso di SMN1ed ha una sequenza quasi identica che differiscono da soltanto cinque basi4,5. Una transizione di C-a-T in SMN2 situato in essone 7 rende il gene quasi impraticabile perché la mutazione conduce ad essenziale essone 7 essendo escluso in quasi il 90% delle trascrizioni di SMN2 (Figura 1a). SMN2 mRNA mancante dell'esone 7 non può compensare la funzione di SMN1 perché suo prodotto proteico è instabile e viene rapidamente degradato.

Terapia antisenso recentemente emerso come una strategia molto promettente per il trattamento di SMA6. La recente approvazione della nusinersen da l'US Food and Drug Administration (FDA) ha reso il primo farmaco disponibile per il trattamento di SMA7. Nusinersen è un oligonucleotide antisenso 18-mer (AON) con una modifica di 2 '-O-metossietile (MOE) e una spina dorsale fosforotioato. Il farmaco è destinato il silenziatore d'impionbatura intronic N1 (ISS-N1) situato nell'introne 7 del gene SMN2 . Associazione di nusinersen a ISS-N1 promuove il recupero del full-length espressione di proteina SMN funzionale dal gene SMN2 endogeno inducendo essone 7 inclusione (Figura 1a)8,9,10 . Attualmente, molti studi che coinvolgono la terapia AON per SMA concentrano sullo studio di nuovi processi chimici AON che possono essere più efficaci e meno tossici rispetto nusinersen. È stato dimostrato che AONs con altri prodotti chimici per indurre anche in modo efficiente l'inclusione dell'esone in SMN2 essone 7 sia in vitro che in vivo11,12,13.

Acidi nucleici bloccati (LNA) sono analoghi di RNA chimicamente modificati contenenti un ponte di metilene eventualemnte ilcarbonio 4 ′ - 2 ′ -ossigeno entro le furanosico struttura (Figura 1b)14,15. Rispetto al DNA o RNA, LNA hanno un'affinità aumentata per l'associazione di sequenze di RNA complementari e hanno il vantaggio di essere altamente resistente alla nucleasi endogene. La chimica LNA è stata applicata per l'uso come sonde per ibridazione in situ di fluorescenza (pesce) e in qPCR16,17. Inoltre, è utilizzata per regolare l'espressione genica sia in vitro che in vivo. GapmeR AON sono una combinazione di molecole di DNA single-stranded affiancato da diversi LNA alle estremità 5 ' e 3 '. Essi abbattere l'espressione genica legandosi complementare al mRNA mirati, causando loro di essere degradata da attivato RNasi H18. LNA/DNA mixmers sono AONs che sono composte di nucleotidi del DNA integrati tra LNA. Presentato in questo orientamento si può legano miRNA per inibire la sua funzione (LNA-antimiR)19. Alcuni LNA-antimiRs hanno raggiunto lo sviluppo clinico. Per esempi, miravirsen (AntimiR-122) è un LNA-antimiR che inibisce miR-122 per trattare l'infezione di epatite C e diversi studi clinici di fase II sono attualmente in corso19,20. Recentemente, è stato dimostrato che LNA/DNA mixmers può anche modulare RNA splicing21. Può legare una specifica sequenza di mRNA e indurre esone che salta nell'inclusione di mRNA e nell'esone di distrofina in SMN2 mRNA in vitro13,22.

In questo articolo, descriviamo una metodologia per l'induzione dell'inclusione dell'esone utilizzando AONs e la valutazione dell'efficacia a livello di RNA e proteine. Per esemplificare questo metodo, abbiamo usato il mixmers LNA/DNA targeting ISS-N1 nell'introne 7 di SMN2. Neuritica transfettate nelle cellule di pazienti SMA di presenti ha indotto l'inclusione dell'esone 7 nella finale SMN2 trascrizione e upregulation di produzione della proteina SMN. Uno dei vantaggi dell'utilizzo di LNA/DNA mixmers per indurre l'inclusione dell'esone è che la concentrazione efficace per la transfezione è significativamente più bassa di altri prodotti chimici per13. Questo metodo può essere utilizzato per molti altri AONs tranne phosphorodiamidate morpholino oligomeri (OGP), che, a causa della loro carica neutra, hanno bisogno di entrare nelle cellule attraverso endocitosi indotta dal reagente di co-transfezione Endo-Porter.

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Protocollo

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1. coltura cellulare

  1. Nei fibroblasti del paziente di cultura SMA nel mezzo di crescita (Dulbecco modified Eagle medium 1:1-12 (Ham) con 10% siero bovino fetale (FBS) e 0,5% di penicillina/streptomicina) in incubatore a CO2 a 37 ° C.
  2. Determinare la concentrazione cellulare mediante un contatore di cellule automatizzato e diluire le cellule a 1 x 105 cellule/mL nel terreno di coltura, quindi seme sulla piastra appropriata. Utilizzare 12 pozzetti (1 mL per pozzetto) per RT-PCR o qPCR.
  3. Incubare le piastre per 24 h in un incubatore a CO2 a 37 ° C.

2. transfezione di mixmer LNA/DNA

  1. Garantire confluency di cella di circa il 65-80% per l'efficienza di trasfezione ottimale.
  2. Scongelare 10 μM LNA/DNA mixmers lentamente sul ghiaccio.
  3. In una provetta da 1,5 mL, preparare una soluzione di x mixmer 20 aggiungendo il mixmers ai media di siero-sfavorite, in modo che il volume finale raggiunge 50 μL.
  4. Miscelare la soluzione di mixmer con 50 μL di siero-sfavorite supporti contenenti il reagente di transfezione di 3% (rapporto 1:1).
  5. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
  6. Aggiungere 900 μL di terreno a siero-sfavorite con 5% FBS in ogni provetta.
  7. Aspirare i vecchi media dalla piastra e sostituire con 1 mL di soluzione di mixmer LNA/DNA contenente il reagente di transfezione.
  8. Incubare le cellule per 24-48 h a 37 ° C in un incubatore a CO2 .

3. estrazione del RNA

  1. Rimuovere il mezzo e aggiungere 1 mL di reagente del tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinium alle celle. Lavare a fondo il ben più volte con guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio e raccoglierlo in provette da 1,5 mL.
  2. Vortice ad alta velocità per 30 s e conservare a-80 ° C per 1 h o durante la notte.
  3. Scongelare i campioni a temperatura ambiente e agitare bene.
  4. Aggiungere cloroformio di 200 µ l, agitare energicamente per 15 s e incubare a temperatura ambiente per 3 min.
  5. Centrifugare a 12.000 x g per 15 min a 4 ° C.
  6. Raccogliere la fase acquosa limpida superiore in un nuovo tubo. Assicurati di evitare di raccogliere qualsiasi l'interfase bianca che si forma tra le fasi superiore e inferiore.
  7. Aggiungere 500 µ l isopropanolo e 1 µ l 8 µ g / µ l glicogeno (grado di RNA). Vortexare per 10 s e incubare a temperatura ambiente per 10 min o a-20 ° C durante la notte.
  8. Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C e rimuovere tutti del surnatante. Una pallina bianca si forma nella parte inferiore del tubo.
  9. Aggiungere 1 mL di etanolo 75% freddo e centrifugare a 7.500 x g per 5 min a 4 ° C.
  10. Rimuovere tutto l'etanolo ed asciugare il pellet a temperatura ambiente fino a quando non etanolo è lasciato nel tubo.
  11. Dissolva la pallina in acqua libera di 30 µ l dnasi/RNAsi e incubare per 10 minuti a 60 ° C.
  12. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro (a 260 nm) e regolare la concentrazione di RNA a 50 ng / µ l.

4. one step RT-PCR per misurare il tasso di inclusione dell'esone di SMN2

  1. Mix 12,5 µ l di tampone di reazione di RT-PCR: 2x, mescolare 1,0 µ l di enzima di One-step RT-PCR, 0,5 µ l di ciascun primer (SMN2 avanti: 5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3', SMN2 inverso: 5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3', GAPDH avanti: 5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3', GAPDH inverso: 5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3', 2 µ l di RNA totale (50 ng / µ l), e acqua distillata 8,5 µ l di RNAsi/dnasi-free.
  2. Dopo il cDNA è sintetizzato a 50 ° C per 15 min, avviare la reazione di PCR. Amplificare l'esone SMN2 6-8 con 30 cicli di PCR (94 ° C per 15 s, 60 ° C per 30 s, 68 ° C per 25 s). Amplificare la GAPDH con 20 cicli di PCR (94 ° C per 15 s, 60 ° C per 30 s, 68 ° C per 20 s).
  3. Aggiungere 5 μL 6 x colorante per il prodotto di PCR, di carico e caricare 5 µ l della miscela in un gel di agarosio al 2% ed eseguire per 40 min a 100 V.
  4. Il gel di immagine e analizzarlo utilizzando software ImageJ.
  5. Misura l'intensità del full-length e bande di Δ7. Calcolare il tasso dell'inclusione dell'esone 7 per il valore di intensità di (Full-Length) / (Full-Length + Δ7 SMN2).

5. quantitative PCR (qPCR) per misurare il tasso di inclusione dell'esone di SMN2

  1. Per la sintesi di cDNA, mescolare 1 µ l Oligo dT, 1 µ l 10 mM dNTPs e µ l 11 totale RNA (50 ng / µ l). Incubare a 65 ° C per 5 min.
  2. I campioni su ghiaccio e µ l 4 5 x buffer, 1 µ l 0,1 M DTT, inibitore di RNAsi 1 µ l e 1 della trascrittasi inversa di µ l di ciascun campione.
  3. Incubare a 50 ° C per 60 minuti e fino a 80 ° C per 10 min arrestare la reazione di calore. Il cDNA possa essere conservato a-20 ° C.
  4. Diluire i cDNA con acqua RNAsi-libera (diluizione 1:5). Miscelare 10 µ l 2 x mix di enzima di SYBR Green qPCR, 0,8 µ l 10 µM ogni primer (Full-Length SMN2 avanti: 5 ′-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3 ′, full-length inverso di SMN2 : 5 ′-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3 ′, Δ7 SMN2 avanti: 5 ′ - TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′, Δ7 SMN2 inverso: 5 ′-ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-3 ′, GAPDH avanti: 5 ′-GCAAATTCCATGGCACCGT-3 ′, GAPDH invertire: 5 ′-AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3 '), 3 µ l diluito cDNA e acqua RNAsi-libera di 5,4 µ l.
  5. Avviare la reazione di qPCR. Le condizioni di utilizzo: 95 ° C per 30 s, poi un ciclo di 40 ripetuta a 95 ° C per 5 s e 60 ° C per 20 s.
  6. Calcolare l'espressione relativa di Full-Length SMN2 di GAPDH o Δ7 SMN2e normalizzare alle cellule non trattate con l'algoritmo di ΔΔCt.

6. Western blotting

  1. Rimuovere il mezzo di transfezione dalle cellule e lavare con tampone fosfato salino (PBS) una volta.
  2. Aggiungere 100 µ l di tampone di lisi con un inibitore della proteasi.
  3. Staccare le cellule dal fondo di ciascun pozzetto usando una spatola sterile cella e raccogliere in provette da 1,5 mL. Incubare i campioni in ghiaccio per 30 min.
  4. Attraversare cella lysate ago 21G 10 volte per schiacciare le cellule.
  5. Centrifugare a 20.800 x g per 15 min a 4 ° C e raccogliere il surnatante in nuove provette da 1,5 mL. Il campione può essere conservato in un congelatore-80 ° C.
  6. Calcolare la concentrazione di proteina mediante un BCA Protein Assay Kit e regolare la concentrazione di 1,0 µ g / µ l.
  7. Mix 5 µ l campioni e 5 µ l 2 x tampone sodio dodecil solfato (SDS) (10% SDS; soluzione di 14% 0.5M Tris-HCl, pH 6,7; soluzione madre 1% 0,5 M 2Na EDTA, pH 8.0; 20% glicerolo; colorante blu di bromofenolo di 0,004%, 5% β-mercaptoetanolo) e calore a 70 ° C per 10 min.
  8. Caricare i campioni in un 4-12% Bis-Tris proteina gel ed eseguire per 1 h a 150 V.
  9. Immergere un filtro di carta spessa in ogni buffer: (tampone concentrato anodo: 0.3 M Tris-HCl, 20% metanolo; buffer di anodo: 0,03 M Tris-HCl, 20% metanolo; buffer di catodo: 25 mM Tris, 20% metanolo, acido 6-ammino-n-esanoico di 40mm, 0,01% SDS).
  10. Immergere una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) in metanolo per 20 s, poi trasferirlo nel buffer dell'anodo.
  11. Equilibrare il gel dopo SDS-PAGE con il buffer di catodo per 5-10 min sotto agitazione.
  12. Posizionare la carta da filtro, membrane di PVDF e il gel su una macchina macchiante semi-secca, come segue: concentrato di carta per anodo buffer carta/anodo buffer carta/PVDF/proteina di membrana gel/catodo buffer (Figura 2).
  13. Coprire lo stack e iniziare il trasferimento a 20 V per 30 min.
  14. Dopo il trasferimento, risciacquare la membrana PVDF con PBST (PBS con 0.05% Tween 20) una volta.
  15. Bloccare la membrana a temperatura ambiente per 30 min in 5% latte scremato in polvere sciolta in PBST o a 4 ° C per una notte.
  16. Diluire un anticorpo di anti-SMN murino purificato e un anticorpo di coniglio anti-cofilina a 1: 10.000 in 5% latte scremato in polvere in PBST. Incubare la membrana in esso per 1 h a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la notte.
  17. Lavare 3 volte con PBST per 10 min.
  18. Diluire anticorpi secondari (capra HRP-coniugato anti-mouse e anti-coniglio IgG (H + L)) a 1: 10.000 in 5% latte scremato in polvere in PBST. Incubare per 1 h a temperatura ambiente al buio.
  19. Lavare la membrana 3 volte con PBST per 10 min.
  20. Rilevare il segnale di banda utilizzando il Western blotting kit di rilevazione di chemiluminescenza.

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Risultati

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Utilizzo di SMA nei fibroblasti del paziente, abbiamo mirato della regione di silenziatore ISS-N1 nell'introne 7 del gene SMN2 con otto diverse mixmers LNA/DNA antisenso che transfected ad una concentrazione di 5 nM (Figura 3). Ognuna del mixmers conteneva un backbone modificate phosphorothioated che ha permesso loro di resistere alla degradazione della nucleasi. Per valutare l'efficacia di mixmers, il tasso di SMN2 essone 7 inclusione è sta...

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Discussione

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Il metodo in vitro valutazione qui descritto è veloce, facile e abbastanza sensibile per la sperimentazione di vari neuritica. Questo protocollo è ampiamente applicabile al salto dell'essone e l'inclusione di altri geni e vari tipi di cellule. Inoltre, la maggior parte delle composizioni chimiche AON (tranne PMOs) possono essere transfected utilizzando questo metodo. Aon può regolare splicing del pre-mRNA da geni endogeni sia artificialmente introdotti e può essere co-trasfettate con vettori del plasmide che tra...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano Nicole McRorie per aiuto con gli esperimenti. Questo lavoro è stato supportato dalla facoltà di medicina e odontoiatria, Slipchuk SMA Research Foundation Research Grant, il canadese istituti di salute Research (CIHR), gli amici di Garrett Cumming ricerca fondi, HM Toupin neurologico Università di Alberta Fondi di ricerca di scienza, il Canada di distrofia muscolare, la Fondazione canadese per innovazione, Alberta Enterprise, formazione avanzata e le donne e di bambini Health Research Institute (WCHRI).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fibroblasti SMAArchivio di cellule genetiche umane Coriell NIGMSGM03813
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher11320033
Siero fetale bovinoSigma-AldrichF1051
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher15140122
Tripsina-EDTA (0,05%), rossofenoloThermo Fisher25300062
Reagente di trasfezioneThermo Fisher15338100
tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinio (TRIzol)Thermo Fisher15596-018
RT-PCR PrimersSequenza da 5' a 3'SMN2
in avanti: CTGCCTCCATTTCCTTCTG
SMN2 inverso: TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC
GAPDH avanti: TCCCTGAGCTGAACGGGAAG
GAPDH inverso: GGAGGAGTTTGGTCGCTGT
qPCR Primer
lunghezza intera SMN2 avanti:GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT
a lunghezza intera SMN2 indietro: CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT
GAPDH avanti: GCAAATTCCATGGCACCGT
GAPDH inverso:AGGGATCTCGCTCCTGGAA
CloroformioSigma-AldrichP3803
Glicogeno, RNA gradoThermo FisherR0551
ImageJ Software
Inibitore del cocktail di proteasi Roche11836153001
Tampone0,025 M base Tris + 40  mM Acido 6-amminocaproico + 20%
tampone0,03 M Tris base + 20% metanolo
tampone0,3 M Tris base + 20% metanolo
beta mercaptoetanolo Membrana MilliporeES-007-E
PVDF GE10600021
Tampone di caricamento/campionamento per Western blottingNuPage InvitrogenNP007
Kit RT-PCR One-Step Qiagen 210210
dNTPClontech3040
terreni privi di siero Thermo Fisher 31985070 a catodico anodico metanolo anodico concentrato

Riferimenti

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