Vari oligonucleotidi antisenso (AON) sono stati indicati per indurre l'inclusione dell'esone (modulazione della giuntura) e salvataggio espressione SMN per l'atrofia muscolare spinale (SMA). Qui, descriviamo un protocollo per AON presenti per indurre l'inclusione dell'esone del gene SMN2 e i metodi di valutazione per determinare l'efficacia in fibroblasti di pazienti SMA.
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Articolo metodologico
Valutazione dell'inclusione dell'esone indotta da impiombare commutazione oligonucleotidi antisenso in fibroblasti del paziente di SMA
In questo articolo
Sommario
Abstract
Atrofia muscolare spinale (SMA), una letale malattia neurologica causata dalla perdita di SMN1, presenta un caso unico nel campo del oligonucleotide antisenso (AON)-mediata di terapia. Mentre mutazioni SMN1 sono responsabili della malattia, AONs targeting siti di silenziatore (ISS) di giuntura intronic in SMN2, compreso nusinersen approvato dalla FDA, sono stati indicati per ripristinare espressione SMN e migliorare i sintomi. Attualmente, molti studi che coinvolgono la terapia AON per SMA concentrano sullo studio di nuovi prodotti chimici per AON targeting SMN2 che possono essere più efficaci e meno tossici rispetto nusinersen. Qui, descriviamo un protocollo per la valutazione in vitro dell'inclusione dell'esone utilizzando presenti di AONs seguita da reazione a catena della polimerasi d'inversione della trascrizione (RT-PCR), reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) e Western blotting. Questo metodo può essere impiegato per vari tipi di prodotti chimici per AON. Utilizzando questo metodo, dimostriamo che AONs composto da bloccato alternati degli acidi nucleici (LNA) e nucleotidi del DNA (LNA/DNA mixmers) conducono alla efficiente l'inclusione dell'esone di SMN2 e ripristino della proteina SMN a una concentrazione molto bassa e di conseguenza, LNA / Oligonucleotidi antisenso di DNA basata su mixmer possono essere una strategia terapeutica attraente per trattare d'impionbatura difetti causati da malattie genetiche. Il metodo in vitro valutazione qui descritto è veloce, facile e abbastanza sensibile per la sperimentazione di vari AONs romanzo.
Introduzione
Atrofia muscolare spinale (SMA) è un disordine neuromuscolare mortale trasmessa come carattere autosomico recessivo. È caratterizzato dalla degradazione dei motoneuroni e progressiva tronco e degli arti muscolo paralisi1,2. La maggior parte delle occorrenze di SMA è dovuta a una mutazione omozigotica del gene di sopravvivenza del neurone del motore 1 (SMN1)3. Il gene di sopravvivenza del neurone del motore 2 (SMN2) è un duplicato inverso di SMN1ed ha una sequenza quasi identica che differiscono da soltanto cinque basi4....
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Protocollo
1. coltura cellulare
- Nei fibroblasti del paziente di cultura SMA nel mezzo di crescita (Dulbecco modified Eagle medium 1:1-12 (Ham) con 10% siero bovino fetale (FBS) e 0,5% di penicillina/streptomicina) in incubatore a CO2 a 37 ° C.
- Determinare la concentrazione cellulare mediante un contatore di cellule automatizzato e diluire le cellule a 1 x 105 cellule/mL nel terreno di coltura, quindi seme sulla piastra appropriata. Utilizzare 12 pozzetti (1 mL per pozzetto) per RT-PCR o qPCR.
- Incubare le piastre per 24 h in un incubatore a CO2 a 37 ° C.
2. transfezione di mixmer LNA/DN....
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Risultati
Utilizzo di SMA nei fibroblasti del paziente, abbiamo mirato della regione di silenziatore ISS-N1 nell'introne 7 del gene SMN2 con otto diverse mixmers LNA/DNA antisenso che transfected ad una concentrazione di 5 nM (Figura 3). Ognuna del mixmers conteneva un backbone modificate phosphorothioated che ha permesso loro di resistere alla degradazione della nucleasi. Per valutare l'efficacia di mixmers, il tasso di SMN2 essone 7 inclusione è sta.......
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Discussione
Il metodo in vitro valutazione qui descritto è veloce, facile e abbastanza sensibile per la sperimentazione di vari neuritica. Questo protocollo è ampiamente applicabile al salto dell'essone e l'inclusione di altri geni e vari tipi di cellule. Inoltre, la maggior parte delle composizioni chimiche AON (tranne PMOs) possono essere transfected utilizzando questo metodo. Aon può regolare splicing del pre-mRNA da geni endogeni sia artificialmente introdotti e può essere co-trasfettate con vettori del plasmide che tra.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Nicole McRorie per aiuto con gli esperimenti. Questo lavoro è stato supportato dalla facoltà di medicina e odontoiatria, Slipchuk SMA Research Foundation Research Grant, il canadese istituti di salute Research (CIHR), gli amici di Garrett Cumming ricerca fondi, HM Toupin neurologico Università di Alberta Fondi di ricerca di scienza, il Canada di distrofia muscolare, la Fondazione canadese per innovazione, Alberta Enterprise, formazione avanzata e le donne e di bambini Health Research Institute (WCHRI).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fibroblasti SMA | Archivio di cellule genetiche umane Coriell NIGMS | GM03813 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Siero fetale bovino | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), rosso | fenoloThermo Fisher | 25300062 | |
| Reagente di trasfezione | Thermo Fisher | 15338100 | |
| tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinio (TRIzol) | Thermo Fisher | 15596-018 | |
| RT-PCR Primers | Sequenza da 5' a 3'SMN2 | ||
| in avanti: | CTGCCTCCATTTCCTTCTG | ||
| SMN2 inverso: | TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC | ||
| GAPDH avanti: | TCCCTGAGCTGAACGGGAAG | ||
| GAPDH inverso: | GGAGGAGTTTGGTCGCTGT | ||
| qPCR Primer | |||
| lunghezza intera SMN2 avanti: | GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | ||
| a lunghezza intera SMN2 indietro: | CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT | ||
| GAPDH avanti: | GCAAATTCCATGGCACCGT | ||
| GAPDH inverso: | AGGGATCTCGCTCCTGGAA | ||
| Cloroformio | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Glicogeno, RNA grado | Thermo Fisher | R0551 | |
| ImageJ Software | |||
| Inibitore del cocktail di proteasi | Roche | 11836153001 | |
| Tampone | 0,025 M base Tris + 40 mM Acido 6-amminocaproico + 20% | ||
| tampone | 0,03 M Tris base + 20% metanolo | ||
| tampone | 0,3 M Tris base + 20% metanolo | ||
| beta mercaptoetanolo | Membrana Millipore | ES-007-E | |
| PVDF | GE | 10600021 | |
| Tampone di caricamento/campionamento per Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
| Kit RT-PCR One-Step | Qiagen | 210210 | |
| dNTP | Clontech | 3040 |
Riferimenti
- Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies. F1000Prime Rep. 7, 4(2015).
- Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. New developments in exon skipping and splice modulati....
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Ristampe e permessi
