Qui, presentiamo omogeneo tempo risolto FRET (HTRF) come un metodo efficace per la rilevazione rapida di insulina secernuta dalle cellule.
Articolo metodologico
Qui, presentiamo omogeneo tempo risolto FRET (HTRF) come un metodo efficace per la rilevazione rapida di insulina secernuta dalle cellule.
La rilevazione della secrezione dell'insulina è fondamentale per illuminante meccanismi di secrezione regolata anche negli studi di metabolismo. Anche se numerosi saggi di insulina sono esistite per decenni, il recente avvento di tecnologia tempo-risolta omogenea del Förster Resonance Energy Transfer (HTRF) ha notevolmente semplificato queste misurazioni. Questo è un saggio di ottico rapido, conveniente, riproducibile e robusto affidamento anticorpi coniugati a fluorofori luminose con emissione di lunga durata che facilita risolta in tempo Förster Resonance Energy Transfer. Inoltre, rilevamento di insulina HTRF è favorevole per lo sviluppo di saggi di screening ad alta resa. Qui usiamo HTRF per rilevare la secrezione dell'insulina in cellule INS-1E, una linea cellulare derivata da insulinoma del ratto. Questo ci permette di stimare i livelli basali di loro cambiamenti in risposta a stimolazione del glucosio e dell'insulina. Inoltre, utilizziamo questo sistema di rilevazione di insulina per confermare il ruolo della dopamina come un regolatore negativo della secrezione insulinica glucosio-mediata (GSIS). In modo simile, altri di dopamina D2-come agonisti del recettore, quinpirole e Bromocriptina, ridurre GSIS in un modo dipendente dalla concentrazione. I nostri risultati evidenziano l'utilità del formato di dosaggio di insulina HTRF nel determinare il ruolo dei numerosi farmaci in GSIS e loro profili farmacologici.
La regolazione del metabolismo energetico è messo a punto da un importante ormone anabolizzante, insulina. L'insulina viene sintetizzata e rilasciato da cellule beta pancreatiche in risposta ai livelli aumentati del glucosio extracellulare. L'insulina rilasciata innesca l'assorbimento di glucosio da tessuti insulino sensibili1,2. Fisiologicamente, questo è legato all'elevazione della concentrazione di glucosio dopo un pasto, seguita dalla secrezione di insulina per regolare l'assorbimento del glucosio. Perturbazioni nell'omeostasi del glucosio conducono ai danni metabolici che culmina nell'insulino-resistenza ....
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1. INS-1E cellule: manutenzione e placcatura
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Abbiamo validato la nostra analisi HTRF insulina generando una curva standard di insulina utilizzando standard di insulina umana purificata delle concentrazioni predefiniti (Figura 2). Generazione della curva standard ha permesso di estrapolare le letture di fluorescenza raziometrici e quindi a determinare i livelli di insulina secreta in risposta ai trattamenti farmaco (Figura 2). Variazione di intraplacca per adattamento della .......
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Il dosaggio di insulina HTRF descritto qui offre un sistema rapido, efficiente per misurare la secrezione di insulina da un sistema basato su cellule coltivata. Tra i suoi più importanti vantaggi, questo saggio offre un segnale basso fondo dovuto l'alto rapporto segnale-rumore. Inoltre, abbiamo confermato che il segnale HTRF è stabile per lunghi periodi di tempo (> 24 h)7. Tuttavia, poiché gli anticorpi monoclonali di insulina-associazione raggiungere velocemente la saturazione di associazione dop.......
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Ringraziamo Nicolas Pierre (Cisbio analisi biologiche) per consigli utili e Dr. Pierre Maechler (Università di Ginevra) per fornire generosamente alle cellule INS-1E. Questo lavoro è stato sostenuto dal finanziamento dal dipartimento della difesa (grant PR141292 a Z.F.), John F. e Nancy A. Emmerling Fund della Fondazione Pittsburgh (a Z.F.).
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra a mezza area bianca a 96 pozzetti | Greiner Bio-One | 82050-042 | |
| Piastra bianca a 384 pozzetti a basso volume, fondo rotondo | Corning | 15100157 | |
| Insulin High Range Kit | Cisbio Bioassays | 62IN1PEH | Kit per il dosaggio dell'insulina basato su HTRF da 10.000 test |
| PHERAstar FSX Lettore di piastre | BMG Labtech | FSX | Lettore di piastre adattato per letture di saggi basate su HTRF |
| Sigillanti per piastre | Fisher Scientific | DY992 | Per sigillare la piastra mentre gli anticorpi incubano |
| Emocitometro | Hausser Scientific | 3100 | |
| RPMI Medium 1640 (1x) | Gibco | 11875-093 | [+] L-glutammina |
| tripsina 0,05% | Corning | 25-052-CI | 0,53 mM EDTA, (-) bicarbonato di sodio |
| DPBS (soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco) | Corning | 21-031-CV | Senza calcio e magnesio |
| Siero fetale bovino | Corning | 35-010-CV | |
| HEPES | Gibco | 156-30-080 | |
| Sodio piruvato | Gibco | ||
| Soluzione di penicillina/streptomicina 100x | Corning | 30-002 CT | |
| 2-mercaptoetanolo | Sigma | M1348 | |
| Trypan Blue Stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Dopamina cloridrato | Sigma | 8502 | |
| Bromocriptina mesilato | Tocris | 427 | |
| (-)-Quinpirolo cloridrato | Tocris | 1061 | |
| Siero bovino Albumina | Calbiochem | 12659 | |
| Poli-L-lisina | Sigma | P4832 | |
| Glucosio | Sigma | G7021 | |
| DMSO (Dimetilsolfossido) | Sigma | 276855 |
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