Rapido e specifico immunomagnetica isolamento degli oligodendrociti primario del Mouse

Summary

Descriviamo l'isolamento immunomagnetica degli oligodendrociti primario del mouse, che permette l'isolamento rapido e specifico delle cellule per coltura in vitro .

Abstract

L'efficiente e robusto isolamento e coltura dei oligodendrocytes primario (OLs) è uno strumento prezioso per lo Studio in vitro di sviluppo di oligodendroglia, nonché la biologia di demyelinating malattie come la sclerosi multipla e Malattia di Pelizaeus-Merzbacher-simile (PMLD). Qui, presentiamo un semplice e metodo di selezione efficace per l'isolamento di immunomagnetica di fase tre O4⁺ cellule preoligodendrocytes da cuccioli di topi neonatali. Poiché immaturo OL costituiscono più dell'80% della materia bianca roditore-cervello postnatale giorno 7 (P7) questo metodo di isolamento non solo assicura un alto rendimento cellulare, ma anche l'isolamento specifico di OLs già commesso alla stirpe oligodendroglial, diminuendo il possibilità di isolare cellule contaminanti quali gli astrociti e altre cellule del cervello del mouse. Questo metodo è una modifica delle tecniche segnalato precedentemente e fornisce del oligodendrocyte preparazione purezza superiore al 80% in circa 4 h.

Introduction

Oligodendrociti (OLs) sono le cellule di mielinizzazione del sistema nervoso centrale (SNC)¹. L'isolamento e la coltura degli oligodendrociti primari in un ambiente strettamente regolamentato è uno strumento prezioso per lo Studio in vitro di sviluppo di oligodendroglia, nonché la biologia di demyelinating malattie come la sclerosi multipla² . Ciò richiede un'efficiente e robusto del oligodendrocyte isolamento e coltura metodo³. In questo studio, abbiamo approfittato dell'espressione di un indicatore della superficie delle cellule del oligodendrocyte distintivo per implementare una tecnica di isolamento modificate che è rapido e specifico.

Sono state identificate quattro distinte fasi di maturazione del oligodendrocyte, ognuna caratterizzata dall'espressione di marcatori di superficie cellulare distintivo per ogni stadio di sviluppo (Figura 1). Questi indicatori di superficie delle cellule possono essere riconosciuti da anticorpi specifici^4,5e possono essere utilizzati per isolare OLs alle fasi specifiche. Nella prima fase, le cellule del precursore del oligodendrocyte (OPCs) hanno la capacità di proliferare, migrare e rapidi in particolare fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF-Rα) recettore⁶, ganglioside A2B5, proteoglicano NG2^7,8 , neuro-acido polisialico delle cellule adesione molecola⁹ e grassi-acido-legante proteina 7 (FABP7)¹⁰. Gli OPC hanno morfologia bipolare con alcuni processi brevi che emana dai poli opposti del corpo cellulare, che è caratteristico di cellule precursori neurali¹¹.

Figura 1: espressione di marcatori di superficie delle cellule durante lo sviluppo del oligodendrocyte mouse. OLs cella marcatori di superficie come A2B5, GalC (O1), NG2, O4 e PDGF-Rα può essere utilizzato per isolare specificamente oligodendrociti in fase inerente allo sviluppo specifica utilizzando anticorpi specifici.   Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nella seconda fase, OPCs danno luogo a preoligodendrocytes e rapidi alla membrana delle cellule non solo gli indicatori OPC, ma anche il sulfatide (un galattolipide solfonata) riconosciuto dal O4 anticorpo^12,13e la proteina GPR17¹⁴, che persiste fino alla fase di oligodendrociti immaturi (OL). In questa fase, preoligodendrocytes estendere multipolari processi brevi. Preoligodendrocytes sono la grande fase OL al giorno postnatale 2 (P2) nella materia bianca cerebrale di ratto e topo con una popolazione secondaria di immaturi OLs¹⁵.

Durante la terza tappa, immaturi OLs continuano a esprimere O4, perdere espressione degli indicatori A2B5 e NG2 e cominciano ad esprimere Galattocerebrosidi C¹⁶. In questa fase, OLs sono impegnati alla stirpe oligodendroglial e diventare cellule post-mitotiche con rami lunghi ramificate^17,18. Immaturo OL costituiscono più dell'80% della materia bianca del roditore in P7 e in questo momento si osservano le prime cellule MBP^{+ 15,19,20,21}. Di conseguenza, isolamento di OLs presso P7 potrebbe garantire alto rendimento cellulare.

Nella fase finale e la quarta di sviluppo OL, OLs matura esprimono proteine myelinating (proteina basica della mielina (MBP), proteolipide (PLP), glicoproteina mielina associata (MAG) e myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)^{22,23 ,24,25,26}. In questa fase, OLs matura estendere membrane quello compatto di forma economale guaine intorno gli assoni e sono in grado di mielinare. Questo coincide con l'osservazione che nel cervello di ratto e topo, cellule MBP⁺ diventano sempre più abbondanti a P14^19,20,21.

Poiché il primo isolamento del oligodendrocyte Fewster e colleghi nel 1967²⁷, sono stati implementati diversi metodi per l'isolamento di OLs da roditore SNC compreso immunopanning^28,29,30, fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) sfruttando delle cellule degli antigeni di superficie-specific^28,31, differenziale mediante centrifugazione in gradiente^32,33,34,35 e agitazione metodo basato sull'adesione differenziale di diverse CNS glia^36,37. Tuttavia, i metodi di coltura esistenti hanno limitazioni, soprattutto in termini di purezza, rendimento e tempo necessario per eseguire la procedure³⁸. Pertanto, i metodi più efficienti di isolamento per gli oligodendrociti sono necessari.

In questa carta, presentiamo un semplice e metodo di selezione efficace per l'isolamento di immunomagnetica di fase tre O4⁺ cellule preoligodendrocytes da cuccioli di topi neonatali. Questo metodo è una modificazione delle tecniche riportate da Emery et al. ³⁹ e Dincman et al. ⁴⁰ e fornisce una purezza di preparazione del oligodendrocyte superiore all'80% in circa 4 h.

Protocol

I topi utilizzati in questo studio sono stati curati per secondo le indicazioni del numero di protocollo di SUNY Downstate Medical Center divisione del laboratorio animale risorse (DLAR) 15-10492.

Nota: Oligodendrocytes primario sono stati isolati da neonatale (P5-P7 selvaggio-tipo C57Bl/6N) topi. In questa fase, immaturi OLs costituiscono più dell'80% della materia bianca del roditore garantire alto rendimento cellulare. Tutti i buffer e composizioni di reagente sono disponibili alla fine della Tabella materiali.

1. preparazione vetrini coprioggetti

Nota: Poli-D-lisina (PDL) / vetrini coprioggetti laminin rivestito devono essere preparati prima dell'isolamento di OL.

1. Posto n. 1 tedesco vetrini coprioggetto in vetro in una provetta conica da 50 mL e aggiungere 35 mL di 70% EtOH per pulirli.
2. Tappare la provetta, metterlo in un mixer nutante e incubare a temperatura ambiente per almeno 30 min mentre delicatamente a dondolo. Le lamelle possono essere incubate durante la notte.
3. Scartare il 70% EtOH.
4. Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte con acqua deionizzata, rimuovere l'acqua ogni volta con aspirazione a vuoto.
5. Aggiungere 30-35 mL di PDL 50 µ g/mL a lamelle nel tubo da 50 mL, abbastanza per coprire i coprioggetti.
6. Posizionare il tubo da 50 mL contenente lamelle su un mixer nutante e incubare a temperatura ambiente per almeno 30 min mentre a dondolo delicatamente.
7. Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte con acqua deionizzata, rimuovendo l'acqua ogni volta con aspirazione a vuoto.
8. Trasferire i coprioggetti in 60 mm di Petri contenente acqua deionizzata.
9. Utilizzare una punta di pipetta P200 per disporre i vetrini coprioggetti come uno strato che copre l'intera superficie del piatto Petri.
10. Con attenzione, rimuovere l'acqua dai piatti con aspirazione a vuoto.
11. Rimuovere l'eccesso di acqua intorno a lamelle e lasciarli asciugare durante la notte con il coperchio aperto e sotto UV luce nella cappa.
    Nota: PDL rivestito vetrini coprioggetti memorizzabili a 4 ° C in Petri sterili fino a tre mesi.
12. Inserire i vetrini coprioggetti in piastre da 24 pozzetti, uno per bene, utilizzando una pinzetta.
13. Spostare i coprioggetti al centro il Bene assicurandosi che i bordi non tocchino la parete del pozzo.
14. Aggiungere 100 µ l di 10 µ g/mL laminin, diluito in B27NBMA (Vedi la Tabella materiali) iniziando al centro di ogni vetrino coprioggetto e lo spostamento in modo circolare verso i bordi per coprire tutta l'area.
    Nota: Poiché la laminina è coinvolto nella manutenzione di OL e promuove la differenziazione in OLs matura, è un importante fattore di sopravvivenza della OL per in vitro cultura^41,42,43,44.
15. Incubare la piastra in un incubatore a 37 ° C 5% CO₂ per almeno 1 h o fino a quando la OLs sono pronti per la placcatura.

2. Mouse Brain Cortex dissociazione

1. Sacrificare postnatali cuccioli di topo C57Bl/6N vecchi di 5-7 giorni per decapitazione veloce con forbici precedentemente pulite in etanolo al 70%.
   Nota: cortecce cerebrali da 5-6 cuccioli di topi neonatali sono stati utilizzati per ogni preparazione. In media, un cervello di topo produce 1-1.5 x 10⁶ OLs.
2. Tagliare la pelle del cuoio capelluto lungo la linea mediana con piccole forbici per dissezione e ritrarre per esporre il cranio.
3. Tagliare il cranio con cura lungo la linea mediana a partire dall'apertura nella parte posteriore del cranio verso l'area frontale, sollevando con le forbici per evitare di danneggiare il cervello. Quindi, utilizzando l'apertura nella parte posteriore del cranio tagliare verso ogni zoccolo dell'occhio lungo la base del cranio.
4. Utilizzare una pinzetta per delicatamente prendere in giro le cortecce dal mesencefalo e trasferirli su un piatto di coltura del tessuto 60 mm contenente 7 mL di B27NBMA. Ripetere i passaggi da 2.2 attraverso 2.4 per ogni cervello, pool le cortecce dissecate.
5. Le cortecce di trasferimento a un nuovo piatto di coltura del tessuto 60 mm contenente 5 mL di tampone di dissociazione (B27NBMA, 20-30 U/mL papaina e 2.500 U dnasi io).
6. Tagliare a dadini le cortecce in pezzetti di circa 1 mm³ utilizzando una lama per bisturi #15 e incubare per 20 minuti in un 37 ° C, 5% CO₂ incubator.
7. Aggiungere 1 mL di siero della crescita bovina (BGS) per fermare la reazione enzimatica.
8. Trasferire le cortecce insieme con il supporto di dissociazione di un tubo conico di 15 mL utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL.
9. Delicatamente comincia a dissociare il tessuto cerebrale pipettando lentamente su e giù 6 - 8 volte utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, facendo attenzione a ridurre al minimo le bolle.
10. Consentire i pezzi di tessuto di stabilirsi per 2-3 min e trasferire il surnatante in una nuova provetta.
11. Aggiungere 3 mL di B27NBMA contenente 10% BGS/2500 U dnasi I per il tessuto a pellet.
12. Utilizzare una pipetta sierologica di 5ml per dissociare delicatamente il tessuto cerebrale durante il pipettaggio su e giù 6 - 8 volte. Fare attenzione a ridurre al minimo le bolle.
13. Consentire i pezzi di tessuto a stabilirsi per 2-3 min.
14. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Aggiungere 3 mL di B27NBMA contenente 10% BGS/dnasi I per il tessuto a pellet.
15. Delicatamente dissociare il tessuto cerebrale utilizzando una punta di pipetta P1000, mentre pipettaggio il mix dei media e del tessuto del cervello su e giù. Ripetere passaggi 2.13 e 2.14 fino a quando non rimangono grossi pezzi di tessuto o fino a quando B27NBMA contenente 10% BGS/dnasi I è esausto, si verifichi per primo. Fare attenzione a ridurre al minimo le bolle.
16. Sospensione di cellule di piscina con surnatanti precedenti.
17. Colino di cella posto 70 µm in un tubo da 50 mL. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, passare la sospensione cellulare in pool delicatamente sopra il filtro di cella di 70 µm.
18. Lavare il filtro cella aggiungendo 1 mL di B27NBMA contenente 10% BGS/dnasi I.
19. Gettare il filtro cella. Portare il volume a 30 mL con B27NBMA contenente 10% BGS/dnasi I.
20. Trasferire la sospensione cellulare a due provette coniche da 15 mL. Centrifugare la sospensione cellulare per 10 min a 200 x g.
21. Rimuovere il surnatante senza lasciare le cellule esposte all'aria. Il surnatante sarà nuvoloso a causa di detriti cellulari. Aggiungere 3 mL di B27NBMA contenente 10% BGS al pellet.
22. Attentamente e dissociare il pellet cellulare utilizzando una pipetta da P1000. Portare il volume a 15 mL con B27NBMA contenente 10% BGS.
23. Passare la sospensione cellulare sopra un fresco filtro di cella 40 µm.
24. Lavare il filtro cella aggiungendo 1mL di B27NBMA contenente 10% BGS. Gettare il filtro cella.
25. Portare il volume a 30 mL con B27NBMA contenente 10% BGS.
26. Trasferire la sospensione cellulare per provette coniche da 2 x 15 mL. Centrifugare la sospensione cellulare per 10 min a 200 x g.
27. Rimuovere la maggior parte del surnatante senza lasciare le cellule esposte all'aria. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di ghiaccio freddo magnetico cella ordinamento buffer (MCS).

3. determinazione del conteggio delle cellule e vitalità

1. Diluire 100 µ l di sospensione cellulare con 400 µ l di soluzione di blu di Trypan in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per ottenere una diluizione di 1:5 in 0,4% (p/v).
2. Centrare una copertura vetrata sopra un emocitometro camera e riempire le due camere con 10 µ l della diluizione delle cellule usando una pipetta P10 ed evitando di troppo-pieno. La soluzione passerà sotto il vetro di copertura per azione capillare.
3. Posizionare l'emocitometro sul tavolino del microscopio e regolare la messa a fuoco utilizzando ingrandimento 40x.
   Nota: I conteggi delle cellule vengono registrati utilizzando un contatore portatile in ognuna delle cinque piazze (quattro angoli e un centro). Solo le cellule non vitali assorbono il colorante e appaiono blue, mentre dal vivo e le cellule sane appaiono rotondi e rifrangente e non assorbono la tintura di colore blu, permettendo per la determinazione del numero di cellule vitali e totale per millilitro.

4. isolamento di O4⁺ oligodendrociti

1. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 10 min.
2. Attentamente e scartare il surnatante tramite aspirazione a vuoto, evitando l'esposizione delle cellule all'aria.
3. Risospendere il pellet in 90 µ l di tampone MCS per 1 x 10⁷ cellule totale seguita dall'aggiunta di 10 µ l di anti-O4 perline per 1 x 10⁷ cellule.
4. Mescolare la sospensione cellulare e le perle scorrendo delicatamente la provetta conica 15 mL con il dito 4 - 5 volte.
5. Incubare il mix per 15 min a 4 ° C, sfogliando la provetta conica 15 mL con il dito 4-5 timesevery 5 min.
6. Lavare il mix delicatamente aggiungere 2 mL di tampone MCS per 1 x 10⁷ cellule al tubo. Centrifugare il mix a 200 x g per 10 min.
7. Scartare il surnatante mediante accuratamente aspirazione a vuoto, evitando l'esposizione delle cellule all'aria. Risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di tampone MCS per ogni 1 x 10⁷ cellule.
8. Posizionare un separatore magnetico su un separatore magnetico. Associare una colonna di selezione per il separatore magnetico e posizionare un colino di cella di 40 µm in cima alla colonna. Posizionare due 15 mL o una provetta conica da 50 mL sotto la colonna di separazione per raccogliere il flusso attraverso.
9. Pre-risciacquo la colonna filtro e separazione della cella da 40 µm con 3 mL di tampone MCS e lasciare che il buffer attraversano la colonna senza lasciarlo asciugare.
10. Aggiungere il mix di sospensione cellulare e perline al filtro delle cellule e nella colonna di selezione.
11. Lavare il filtro di cella 40 µm con 1 mL di tampone MCS.
12. Eliminare il filtro cella e lasciare che il mix di cellule, perline e buffer attraversano la colonna senza lasciarlo asciugare.
13. Lavare la colonna di separazione 3 volte con 3 mL di tampone MCS e 1 volta con media di proliferazione di OL.
14. Rimuovere la colonna di separazione dal separatore magnetico, in modo di metterlo in una provetta conica da 15 mL e immediatamente aggiungere 5 mL di terreno di proliferazione di OL.
15. Posizionare uno stantuffo in cima alla colonna e saldamente push per scovare le cellule con etichettate nella provetta conica 15 mL.
16. Rimuovere 100 µ l di sospensione cellulare per determinare il conteggio delle cellule e attuabilità utilizzando Trypan Blue ed emocitometro come indicato nella sezione 3.
    Nota: La vitalità cellulare oltre l'80% è considerata accettabile per procedere con la cultura di OLs, ma redditività superiore al 90% è ottimale.

5. placcatura di isolato O4⁺ oligodendrociti

1. Diluire la sospensione di eritrociti al desiderio placcatura densità (5 x 10⁵ cellule per vetrino coprioggetti) utilizzando OL proliferazione media.
   Nota: OL densità di semina è molto importante, quindi la densità di cella appropriata devono essere confermate usando un microscopio di coltura del tessuto prima di procedere. Semina di densità inferiore a 10.000 cellule/vetrini coprioggetti può portare a scarsa sopravvivenza. Placcatura di densità a 10.000 a 25.000, OL differenziazione morfologica è lento⁴⁵. Abbiamo piastra OLs ad una densità di semina di almeno 50.000 cellule/coprivetrini per garantire la sopravvivenza delle cellule.
2. Spostare le piastre 24 pozzetti contenenti lamelle rivestite con laminin da incubatore per la cappa di coltura del tessuto.
3. Rimuovere laminin da ciascun vetrino coprioggetto e sostituirlo con 100 µ l della sospensione OL.
4. Incubare OLs nell'incubatore 37 °C/5% CO₂ per un massimo di 45 min per promuovere l'adesione OL a lamelle.
5. Dopo l'incubazione, rimuovere le piastre a 24 pozzetti dall'incubatrice. Inondare ogni bene della piastra 24 pozzetti con 500 µ l di media di proliferazione di OL.
6. Rimettere la OLs nell'incubatore 37 °C/5% CO₂ per altre 24 h.
7. 24 h dopo il placcaggio di OLs, rimuovere i supporti di proliferazione e sostituire con media di differenziazione di OL per indurre la differenziazione.
8. Rimettere la OLs nell'incubatrice e non rimuovere fino a quando le cellule sono pronte per il fissaggio.
   Nota: Variazioni di pH sono dannosi per OLs e diminuiscono la vitalità cellulare, pertanto dovrebbe essere evitati inutili rimozione di OLs culture dall'incubatrice.

6. immunofluorescenza

1. Per la rilevazione della cellula marcatori di superficie (NG2, O1 e O4) rimuovere il supporto dai pozzi.
2. Aggiungere 250 µ l di surnatanti di ibridoma mouse contenente anticorpi primari contro O1 (non diluito)¹³ e O4 (non diluito)¹³ e coniglio policlonale contro NG2 (1: 150 diluito in B27NBMA).
   Nota: Se gli anticorpi anti-O1 e anti-O4 commercialmente disponibili devono essere utilizzati, si consiglia di utilizzare diluizioni suggeriti dal produttore.
3. Incubare le cellule con l'anticorpo primario per 45 min massimo in incubatore a 37 °C/5% CO₂ .
4. Lavare due volte con 0.05% Tween-20/1 X PBS. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% (4% PFA) per 10 min a temperatura ambiente.
5. Lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con 0.05% Tween-20/1 X PBS.
6. Diluire anti-topo di capra Alexa 488-coniugato IgM o anticorpo secondario (1: 400) di anti-coniglio IgG in B27NBMA.
7. Rimuovere il 0.05% Tween-20/1 X PBS da lamelle. Incubare le cellule con anticorpo secondario per 1 h a temperatura ambiente al buio.
8. Lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con 0.05% Tween-20/1 X PBS.
9. Per la doppia colorazione per l'individuazione di indicatori interni (GFAP), rimuovere il 0.05% Tween-20/1 X PBS e blocco/permeabilize cellule con un tampone di blocco/permeabilizzazione per 15 min a temperatura ambiente. In caso contrario, procedere al passaggio 6.17.
10. Rimuovere il tampone di blocco/permeabilizzazione e aggiungere 250 µ l pollo anti-GFAP (1: 100) diluito in un tampone di blocco/permeabilizzazione.
11. Incubare le cellule con anti-GFAP per 1 h a temperatura ambiente. Lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con 0.05% Tween-20/1 X PBS.
12. Diluire l'anticorpo secondario da Alexa 594-coniugati anti-pollo IgG (1: 400) in B27NBMA.
13. Rimuovere il 0.05% Tween-20/1 X PBS da lamelle. Incubare le cellule con anticorpo secondario per 1 h a temperatura ambiente al buio.
14. Lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con 0.05% Tween-20/1 X PBS.
15. Colorante di contrasto con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e montare le cellule con montaggio supporti contenenti DAPI antifade.
16. Lasciate che i coprioggetti curare una notte al buio a temperatura ambiente.
17. L'immagine di cellule marcate con un microscopio a epifluorescenza.
    Nota: Nel presente protocollo, le cellule erano imaged a 40 ingrandimenti utilizzando un tempo di esposizione uniforme.

Results

Lo scopo di questo studio era di stabilire un metodo di isolamento migliorato per O4⁺ oligodendrociti primario del mouse che richiedono la manipolazione meno possibile delle cellule bersaglio. L'intera procedura dall'eutanasia dei cuccioli di placcatura delle celle di vetrini coprioggetti prende circa 4 h e i dati qui indicati rappresentano tre esperimenti indipendenti. Dopo dissociazione del tessuto, una media di 4,3 ± 0,46 x 10⁷ cellule sono state isolate per ogni ...

Discussion

In questa comunicazione, presentiamo un metodo per l'isolamento efficiente delle culture del oligodendrocyte altamente purificata del mouse immaturo. Rispetto ai protocolli precedentemente pubblicati^39,40, questo metodo ha reso una purezza più elevata con un livello molto più basso degli astrociti GFAP-positive e una percentuale molto bassa di altre cellule non caratterizzato. È importante sottolineare che questi sono immaturi OLs già commit alla stirpe oligodend...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipette sierologiche da 10 ml	Fisher Scientific	13-676-10J
Siringa da 10 ml Punta Luer-Loc	BD, Becton Dickinson	309604
Provette coniche da 15 ml	Falcon	352097
Piastre per coltura tissutale a 24 pozzetti	Falcon	353935
40µ filtro per cellule m	Fisher Scientific	22368547
provette coniche da 50 ml	Falcon	352098
pipette sierologiche da 5 ml	Fisher Scientific	13-676-10H
Piastre per colture tissutali da 60 mm	Falcon	353002
70&; colino per cellule	m Fisher Scientific	22363548
Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG (H+L) anticorpo secondario	Invitrogen	A11001
Alexa Fluor 488 capra anti-coniglio IgM (H+L) anticorpo secondario	Invitrogen	A21042
Alexa Fluor 488 capra anti-coniglio IgM (H+L) anticorpo secondario	Invitrogen	A11008
Alexa Fluor 594 capra anti-pollo IgG (H + L) anticorpo secondario	Invitrogen	A11042
Perline Anti-O4- Anti-O4MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-094-543
Apo-Transferrin umano	Sigma	T1147
Autofil gruppo filtro completo per flacone, filtro da 0,22 um, 250 ml	USA Scientific	6032-1101
Autofil filtro completo per flaconi assemblaggio, filtro da 0,22 um, 250 ml	USA Scientific	6032-1102
B27 Integratore	Invitrogen	17504-044
Acido borico	Sigma	B7660
Siero per la crescita bovina (BGS)	GE Healthcare Life Sciences	SH30541.03
BSA	Fisher Scientific	BP-1600-100
CNTF	Peprotech	450-50
d-Biotin	Sigma	B4639
Desossiribonucleasi I (DNAse I)	Worthington	LS002007
EDTA	Fisher Scientific	S311
Microscopio per epifluorescenza con fotocamera Olympus DP70	Olympus	Bx51
Bisturi monouso in piuma	Andwin Scientific	EF7281C
Forskolin	Sigma	F6886
vetrini coprioggetti tedeschi, spessore #1, diametro 12 mm	NeuVitro	GG-12-oz
GFAP anticorpo	Aves	GFAP
glucosio	Fisher Scientific	D16-1
GlutaMAX	Invitrogen	35050-61
insulina	Invitrogen	12585-014
Supporto separatore magnetico - MACS multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Separatore magnetico-Separatore MiniMACS	Miltenyi Biotec	130-042-302
Millex PES 0.22µ m unità filtrante	Millipore	SLG033RS
Mezzi di montaggio- Prolong Gold con DAPI	Thermo Fisher	P36930
N-acetil-cisteina (NAC)	Sigma	A8199
Lamina naturale di topo	Invitrogen	23017-015
Neurobasal Medium A	Invitrogen	10888-022
Neurotrophin-3 (NT-3)	Peprotech	450-03
Anticorpo NG2	Millipore	AB5320
Papaina	Worthington	LS003126
PBS senza Ca2+ e Mg2+	Sigma	D5652
PDGF	Peprotech	100-13A
Petri piastre	Falcon	351029
Poli-D-Lisina	Sigma	P6407
Primocin	Invivogen	ant-pm-2
Progesterone	Sigma	P8783
Putrescina	Sigma	P5780
Colonna di selezione-Colonne LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
Selenito di sodio	Sigma	S5261
Oligoelementi B	Corning	25-000-CI
Triiodotironina (T3)	Sigma	T6397
Triton-X	Sigma	T8787
Soluzione blu di tripano	Corning	25-900-CI
Tween 20	Sigma	P1379
B27NBMA			487,75 mL di terreno neurobasale A; 10 ml di integratore di B27; 1 ml di primocin; 1,25 ml di Glutamax; Filtrare, sterilizzare e conservare a 4 gradi; C fino all'uso.
B27NBMA + 10% BGS			27 mL B27NBMA; 3 mL Siero per la crescita bovina
CNTF in soluzione (10 µ g/ml; 1000X)			Ordina da Peprotech (450-50). Preparare da 0,1 a 1 mg/ml secondo il produttore s (può variare da lotto a lotto) in buffer (es. DPBS + 0,2% BSA). Conservare a -80 °C. Soluzione di lavoro (10 °C.; g/ml, 1000X) 1. Preparare lo 0,2% di BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in soluzione DPBS e filtrare sterilize. 2. Diluire l'aliquota master stock a 10µ g/ml in sterile, refrigerato 0,2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (20µ l/tubo) e congelare a scatto in azoto liquido. 4. Conservare le aliquote a -80 °C.
Soluzione madre di d-biotina (50 µ g/ml; 5000X)			Risospensione della d-biotina (Sigma-B4639) in H2O a doppia distillazione a 50 µ g/ml (ad es. 2,5 mg in 50 ml di ddH2O). La risospensione potrebbe richiedere una discreta quantità di agitazione/vortice o un leggero riscaldamento brevemente a 37°C. Se la d-biotina continua a non solubilizzare, va bene comporre un prodotto meno concentrato (es. 10µ g/ml) e di aggiungere un volume maggiore al B27NBMA (1/1000), invece di 1/5000). Conservare a 4 gradi.
DNase I soluzione			1. Sciogliere a 12.500 U desossiribonucleasi I / ml in HBSS raffreddato su ghiaccio. 2. Sterilizzare il filtro su ghiaccio 3. Aliquot a 200 µ l e congelare durante la notte a -20°C. 4. Conservare le aliquote a una temperatura compresa tra -20 e -30 °C.
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (senza Ca2+ e Mg2+)			Sciogliere la busta in 1 litro d'acqua per ottenere 1 litro di terreno a 9,6 grammi di polvere per litro di terreno. Conservare a 2-8 °C.
Forskolin soluzione madre (4,2 mg/ml; 1000X)			Aggiungere 1 ml di DMSO sterile a 50 mg di Forskolin in flacone (Sigma-F6886) e pipettare fino a risospensione. Trasferire in una provetta da centrifuga da 15 ml e aggiungere 11 ml di DMSO sterile per portare a 4,2 mg/ml. Aliquot (ad es. 20 µ l) e conservare a -20°C.
Hank' s sali bilanciati (HBSS) (Sigma			1. Misurare 900 ml di acqua (temperatura 15-20 ° C) in un cilindro e mescolare delicatamente. 2. Aggiungere la potenza e mescolare fino a quando non si sarà sciolto. 3. Sciacquare la confezione originale con una piccola quantità di acqua per rimuovere ogni traccia della polvere. 4. Aggiungere alla soluzione nel passaggio 2. 5. Aggiungere 0,35 gr di bicarbonato di sodio (7,5% p/v) per ogni litro di volume finale. 6. Continuate a mescolare fino a quando non si sarà sciolto. 7. Regolare il pH del tampone mescolando a 0,1-0,3 unità al di sotto di pH= 7,4 poiché potrebbe aumentare durante la filtrazione. Si consiglia l'uso di 1N HCl o 1N NaOH per regolare il pH. 8. Aggiungere altra acqua per portare il volume finale a 1L. 9. Sterilizzare per filtrazione utilizzando una membrana con una porosità di 0,22 micron. 10. Conservare a 2-8 °C.
Soluzione madre di insulina (4000 µ g/ml)			Scongelare il flacone e aliquotare 25 µ l per provetta da microcentrifuga e conservare a -20°C.
		di laminina	Scongelare lentamente la laminina al freddo (2° C a 8° C) per evitare la formazione di gel. Quindi, aliquotare in tubi di polipropilene. Negozio a 5 gradi C a -20 gradi C in aliquote (es. 20 µ l) e non congelare/scongelare ripetutamente. La laminina può essere conservata a queste temperature per un massimo di sei mesi.
		di selezione cellulare magnetica (MCS)	Preparare la soluzione contenente soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,2 e albumina sierica bovina (BSA) allo 0,5%, EDTA 0,5 mM, 5µ g/ml di insulina, 1 g/l di glucosio. Sterilizzare e degassare per filtrazione il tampone facendolo passare attraverso un 0,22 µ m Filtro Millex. Conservare il buffer a 4 gradi C fino all'uso della
soluzione madre di N-acetil-L-cisteina (NAC) (5 mg/ml; 1000X)			Sciogliere la N-acetil-L-cisteina (Sigma-A8199) a 5 mg/ml in DMEM (ad es. 50 mg di NAC in 10 ml di B27NBMA). Sterilizzare e aliquotare il filtro (es. 20 µ l). Conservare a -20°C.
NT3 soluzione madre (1 µ g/ml; 1000X)			Master stock: Ordina da Peprotech (450-03). Preparare da 0,1 a 1 mg/ml secondo il produttore s istruzioni (può variare da lotto a lotto), in buffer (es. DPBS + 0,2% BSA). Conservare a -80°C. Scorte di lavoro (1µ g/ml; 1000X): 1. Preparare lo 0,2% di BSA in soluzione DPBS e filtrare sterilize. 2. Diluire l'aliquota del master stock a 1 µ g/ml in sterile, refrigerato 0,2% BSA/DPBS. 3. Aliquote (es. 20µ l/tubo) e congelare a scatto in azoto liquido. 4. Conservare le aliquote a -80 °C.
Soluzione madre di PDGF (10 µ g/ml; 1000X)			Magazzino principale: Ordina da Peprotech (100-13A). Preparare da 0,1 a 1 mg/ml secondo il produttore s istruzioni (può variare da lotto a lotto) in buffer (es. DPBS) + 0,2% BSA). Conservare a -80°C. Scorte di lavoro (1µ g/ml; 1000X): 1. Preparare lo 0,2% di BSA in soluzione DPBS e filtrare sterilize. 2. Diluire l'aliquota del master stock a 1µ g/ml in sterile, refrigerato 0,2% BSA/DPBS. 3. Aliquote (es. 20µ l/tubo) e congelare a scatto in azoto liquido. 4. Conservare le aliquote a -80 °C.
Poli-D-lisina (1mg/ml; 100X)			Risospensione poli-D-lisina, peso molecolare 70-150 kD (Sigma P6407) a 0,5 mg/ml in acido borico 0,15M pH 8,4 (ad es. 50 mg in 50 ml di tampone borato). Filtrare, sterilizzare e aliquotare (es. 100µ l/tubo). Conservare a -20°C. Prima dell'uso, diluire il brodo 100X (1mg/ml) a 50 µ g/ml in acqua sterile.
		proliferazione degli oligodendrociti	, vedere Tabella supplementare 1
Mezzi			vedere Tabella supplementare 1
Integratore Sato (100X)			vedi Tabella supplementare 1
Riferimenti: l'elenco dei reagenti e delle ricette è stato adottato dai protocolli precedentemente descritti da Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purificazione di cellule di lignaggio di oligodendrociti da cortecce di topo mediante immunopanning. Primavera fredda Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) e Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, SR Isolamento di cellule precursori di oligodendrociti corticali di topo. J Metodi Neurosci. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))