Qui, descriviamo un protocollo per la visualizzazione di proiezione del neurone di motore e arborization assone in embrioni di topo transgenici Hb9::GFP . Dopo immunostaining per motoneuroni, abbiamo usato Microscopia di fluorescenza del foglio leggero agli embrioni di immagine per la successiva analisi quantitativa. Questo protocollo è applicabile ad altri processi di navigazione di neuroni nel sistema nervoso centrale.
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Articolo metodologico
Visualizzazione di navigazione motore Axon e quantificazione di Axon Arborization negli embrioni del Mouse utilizzando la microscopia a fluorescenza foglio leggero
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Motoneuroni spinali (MNs) estendere loro assoni di comunicare con i loro obiettivi innervating, controllando quindi il movimento e compiti complessi nei vertebrati. Quindi, è fondamentale per scoprire i meccanismi molecolari di quanto destinato a motore assoni spostarsi, Alzaia e innervano i muscoli periferici durante lo sviluppo e la degenerazione. Anche se linee transgeniche di mouse Hb9::GFP hanno servito a lungo per visualizzare traiettorie assone motore durante lo sviluppo embrionale, descrizioni dettagliate dello spettro completo di arborization terminale dell'assone rimangono incomplete a causa della complessità del modello e limitazioni di microscopia ottica attuale. Qui, descriviamo un protocollo migliorato che combina microscopia di fluorescenza foglio leggero (LSFM) e analisi di immagine robusta qualitativamente e quantitativamente visualizzare lo sviluppo di motore assoni. Questo sistema può essere facilmente adottato per attraversare mutanti genetici o modelli di malattia MN con linee Hb9::GFP , rivelando nuovi meccanismi molecolari che portano a difetti nella navigazione dell'assone motore e arborization.
Introduzione
MNs spinale sono la parte del sistema nervoso centrale ma innervano i muscoli periferici per controllare il movimento. Nel midollo spinale in via di sviluppo, progenitori MN (pMNs) sono stabiliti secondo i segnali provenienti dalla notocorda e metameri adiacenti. Tutto differenziato post-mitotici MNs sono poi generati da pMNs, alla fine dando vita a una serie di sottotipi di MN lungo l'asse rostrocaudal del midollo spinale1,2. MNs spinale sono topograficamente e anatomicamente ben organizzato. Loro disposizione morfologica correla con la posizione della loro rispettiva destinazione in periferia
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Protocollo
Tutti gli animali vivi sono stati mantenuti in un agente patogeno specifico gratuito (SPF) animale impianto, approvato e supervisionato da IACUC di Academia Sinica.
1. fissazione
- Raccogliere gli embrioni di giorno embrionale 12.5 (12.5) poi decapitare ed eviscerate li.
- Difficoltà gli embrioni individualmente in piastre da 24 pozzetti con 1 mL/bene di preparati paraformaldeide al 4% in soluzione salina tampone fosfato (PBS): 1x durante la notte. Incubare a 4 ° C in un agitatore.
- Lavare gli embrioni fissi almeno 3 x, ciascuno per 5-10 min, con 1 mL di PBS 1X e incubare per una notte a 4 ° C in un agitatore per ri....
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Risultati
LSFM fornisce la visualizzazione dettagliata 3D di arborization assone e traiettoria di MN nel topo embrioni. In campo chiaro, tessuti appaiono completamente trasparenti dopo essere stato immerso nel reagente commerciale schiarimento. Nessun ritiro e/o gonfiore del campione è stata notata dopo fino a una settimana di deposito in compensazione reagente prima di formazione immagine. In canale di fluorescenza, motoneuroni sono etichettati con GFP transgenically espressa (1 film
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Discussione
Diversi passaggi nel protocollo possono essere sottoposti a modifiche in determinate circostanze. Ad esempio, la durata della fissazione dipende dall'età degli embrioni, variabile da 2 h a 1 o più giorni utilizzando preparati paraformaldeide. Poiché la fissazione avviene prima dell'intero Monte immunostaining, per gli anticorpi che sono sensibili alla reticolazione della proteina, metanolo può essere usato come agente fissativo alternativo. Per un elevato rapporto segnale-rumore al momento di colorazione, è necessario ot.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
LSFM esperimenti e analisi dei dati sono stati effettuati in parte utilizzando i microscopi ottici avanzati dei divisione di servizio di strumento in Academia Sinica e con l'assistenza di MS. Shu-Chen Shen. Ringraziamo la sig. ra Sue-Ping Lee da impianto di IMB Imaging Core per una notevole assistenza tecnica con analisi dell'immagine Imaris. Nucleo di Editing inglese scientifico di IMB rivisto il manoscritto. Questo lavoro è finanziato dalla Academia Sinica Career Development Award (CDA-107-L05), più (104-2311-B-001-030-MY3) e vi (vi-EX106-10315NC).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Hb9::GFP | Il laboratorio di Jackson | 005029 | Raccogliere embrioni del giorno embrionale 12,5 (E12,5) |
| 4% Paraformaldeide (PFA) | Per 200ml: Aggiungere 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Regolare il pH a 7,4 con NaOH (10N). Filtrare, sterilizzare e conservare a -20 °C. | ||
| Soluzione salina tampone fosfato 10X (PBS 10X) | Per 1L: aggiungere 80 g di NaCl, 2 g di KCl, 14,4 g di Na2HPO4, 2,4 g di KH2PO4 e rabboccare con ddH2O. Autoclave e stoccaggio presso RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Siero fetale bovino | ThermoFisher | 26140079 | |
| Pecora policlonale anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 asino anti-pecora | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.49 reagente schiarente | SunJin Lab | RC149001 | |
| 1,5 ml micro tubo | Sarstedt | 72.690.001 | |
| piastra a 24 pozzetti | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Pinzetta | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Forbici striaght affilato/affilato | Aesculap | BC110R | |
| Bisturi per microchirurgia, monouso | Aesculap | BA365 | |
| Microscopio da dissezione | Nikon | SMZ800 | |
| Agitatore | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscopio | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 software di analisi delle immagini | Bitplane, Zurigo, Svizzera | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP topi) | The Jackson Laboratory | 005029 |
Riferimenti
- Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
- Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293(2014).
- Kania, A., Jessell, T. M.
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Ristampe e permessi
