Visualizzazione di navigazione motore Axon e quantificazione di Axon Arborization negli embrioni del Mouse utilizzando la microscopia a fluorescenza foglio leggero

Summary

Qui, descriviamo un protocollo per la visualizzazione di proiezione del neurone di motore e arborization assone in embrioni di topo transgenici Hb9::GFP . Dopo immunostaining per motoneuroni, abbiamo usato Microscopia di fluorescenza del foglio leggero agli embrioni di immagine per la successiva analisi quantitativa. Questo protocollo è applicabile ad altri processi di navigazione di neuroni nel sistema nervoso centrale.

Abstract

Motoneuroni spinali (MNs) estendere loro assoni di comunicare con i loro obiettivi innervating, controllando quindi il movimento e compiti complessi nei vertebrati. Quindi, è fondamentale per scoprire i meccanismi molecolari di quanto destinato a motore assoni spostarsi, Alzaia e innervano i muscoli periferici durante lo sviluppo e la degenerazione. Anche se linee transgeniche di mouse Hb9::GFP hanno servito a lungo per visualizzare traiettorie assone motore durante lo sviluppo embrionale, descrizioni dettagliate dello spettro completo di arborization terminale dell'assone rimangono incomplete a causa della complessità del modello e limitazioni di microscopia ottica attuale. Qui, descriviamo un protocollo migliorato che combina microscopia di fluorescenza foglio leggero (LSFM) e analisi di immagine robusta qualitativamente e quantitativamente visualizzare lo sviluppo di motore assoni. Questo sistema può essere facilmente adottato per attraversare mutanti genetici o modelli di malattia MN con linee Hb9::GFP , rivelando nuovi meccanismi molecolari che portano a difetti nella navigazione dell'assone motore e arborization.

Introduction

MNs spinale sono la parte del sistema nervoso centrale ma innervano i muscoli periferici per controllare il movimento. Nel midollo spinale in via di sviluppo, progenitori MN (pMNs) sono stabiliti secondo i segnali provenienti dalla notocorda e metameri adiacenti. Tutto differenziato post-mitotici MNs sono poi generati da pMNs, alla fine dando vita a una serie di sottotipi di MN lungo l'asse rostrocaudal del midollo spinale^1,2. MNs spinale sono topograficamente e anatomicamente ben organizzato. Loro disposizione morfologica correla con la posizione della loro rispettiva destinazione in periferia³. Dopo aver raggiunto i loro obiettivi di muscolo, assoni riceveranno fattori neurotrofici esogeni e cellulari che inducono ad estendere e ramo ulteriore nei muscoli. Innervazione e ramificazioni difetti possono contribuire al fallimento per formare giunzioni neuromuscolari (NMJ). Ad esempio, fattori di neurotrophic glial-derivato (GDNF)-Pea3 indotto è indispensabile per arborization assone in cutaneo maximus (CM) e dorsi di latissimus (LD) muscoli^4,5. Inoltre, embrioni di topo knockout DINE Visualizza arborization difettoso di nervi frenici nel diaframma, causando mortalità ed il guasto respiratorio subito dopo nascita^6,7. Pertanto, quest'ultimo passaggio di maturazione MN (cioè, proiezione assonale e ramificazione) è fondamentale per garantire la comunicazione tra neuroni e cellule bersaglio.

Per visualizzare i modelli di arborization, ricercatori conducono normalmente imaging confocale o microscopia di fluorescenza del due-fotone di campioni sezionati o intero-monta^8,9,10. Entrambe le tecniche di microscopia generare accettabile risoluzione e profondità di penetrazione. Microscopia di fluorescenza del due-fotone comporta eccitazione di fluorofori dall'assorbimento simultaneo di due fotoni di bassa energia¹¹. Poiché due-fotone eccitazione utilizza radiazioni del vicino infrarosso, la frequenza di eccitazione in diminuzione contribuisce alla dispersione ridotta e migliore penetrazione del tessuto fino a 1 mm di tessuto, permettendo così la formazione immagine con una profondità maggiore. Microscopia confocale rimuove dai filtri l'out-of-focus segnali e raccoglie solo luce all'interno del piano focale¹². Con questo approccio, immagini di campioni da diversi piani focali possono essere combinati per produrre un'immagine tridimensionale (3D) tramite una funzione di Z-stack. Tuttavia, l'intensità del segnale è ridotta come la maggior parte della luce viene bloccato e alte aperture numeriche oscurano la profondità di campo. Ancora più importante, entrambe le tecniche contribuiscono alla photodamage severo e fototossicità, dal momento che l'esemplare intero riceve illuminazione anche quando un solo aereo è immaginato in un dato momento.

Per ovviare a tali carenze, LSFM è diventata un'alternativa favorita, con il vantaggio di essere veloce, luce-efficiente e meno fototossico^13,14. Inoltre, LSFM permette imaging multi-view. Questo approccio è particolarmente adatto alla visualizzazione di motore assoni e loro dispersione terminali come si diffondono attraverso lo spazio 3D. LSFM supera le altre due opzioni, perché i campioni sono montati su un palco che permette la rotazione intorno a un asse verticale e movimenti lungo x, y e z assi. Questo set-up non solo permette una vista minimamente bloccata del campione, ma anche la scelta di un percorso di illuminazione desiderabile, una lacuna del due-fotone e confocale microscopia, entrambi i quali richiedono il montaggio di campioni su una slitta piana. Di conseguenza, LSFM è lo strumento più idoneo per l'imaging 3D di arborization assone e per la quantificazione dei terminali del nervo motore in embrioni di topo.

Protocol

Tutti gli animali vivi sono stati mantenuti in un agente patogeno specifico gratuito (SPF) animale impianto, approvato e supervisionato da IACUC di Academia Sinica.

1. fissazione

1. Raccogliere gli embrioni di giorno embrionale 12.5 (12.5) poi decapitare ed eviscerate li.
2. Difficoltà gli embrioni individualmente in piastre da 24 pozzetti con 1 mL/bene di preparati paraformaldeide al 4% in soluzione salina tampone fosfato (PBS): 1x durante la notte. Incubare a 4 ° C in un agitatore.
3. Lavare gli embrioni fissi almeno 3 x, ciascuno per 5-10 min, con 1 mL di PBS 1X e incubare per una notte a 4 ° C in un agitatore per rimuovere il residuo paraformaldeide.

2. intero-monta Immunostaining

1. Permeabilize ogni embrione in 1 mL di 0.5% PBS-Triton-X-100 (PBST) durante la notte a 4 ° C in un agitatore.
2. Bloccare ogni campione con 1 mL di 10% FBS preparato in PBS 1X durante la notte a 4 ° C in un agitatore.
3. Incubare l'embrione con 1 mL di anticorpo primario anti-GFP (1:1, 000 diluizione nel 10% FBS) a 4 ° C per 72 ore con agitazione costante per intensificare il segnale GFP dei nervi motori.
4. Dopo l'incubazione dell'anticorpo primario, lavare con 1 mL di 0.5% PBST nell'arco di 1-2 giorni a 4 ° C in un agitatore, cambiando il 0,5% PBST almeno tre volte.
5. Applicare 1 mL di anticorpo secondario (1:1, 000 diluizione nel 10% FBS) e incubare per una notte al buio a 4 ° C con agitazione costante.
6. Lavare 3 volte con 1 mL di 0.5% PBST a 4 ° C in un agitatore nel corso di 2-3 giorni. Conservare i campioni in 1X PBS a 4 ° C fino al giorno prima di formazione immagine.
   Nota: Gli embrioni possono essere sezionati in segmenti più piccoli prima di schiarimento, a seconda di quale parte degli embrioni sarà essere imaged. Gli arti anteriori sono conservati in questo approccio sperimentale (Figura 1A).
7. Incubare l'embrione in un reagente commerciale schiarimento con un indice di rifrazione di 1.49 nD in una provetta da 1,5 mL, al riparo dalla luce a temperatura ambiente durante la notte, per eseguire il rendering l'embrione trasparente per l'imaging.
   Nota: Il volume del reagente schiarimento è circa cinque volte che il volume del campione.

3. LSFM (2 – 3 h)

1. Set-up del campione
   1. Impostare 5 X / 0.1 ottica di illuminazione e 5 X / 0.16 ottica di rilevazione. Assemblare il supporto del campione e campione capillare (1,5 mm diametro interno, verde) e inserirli nel microscopio.
      Nota: Fare riferimento al manuale d'uso del microscopio per le procedure dettagliate di set-up.
   2. Montare l'embrione come segue:
      1. Preparare la punta della pipetta P200 tagliando via la parte superiore in modo che si adatta al diametro del capillare e rimuovere la parte appuntita (~ 3 mm) per il fissaggio del campione.
      2. Sciogliere la fine smussata della punta della pipetta utilizzando una piccola fiamma.
      3. Spegnere la fiamma e allegare rapidamente l'embrione verticalmente sull'estremità fuso.
      4. Montare la parte superiore della punta della pipetta con il campione capillare.
   3. Permettere al tampone di camera di equilibrare con l'embrione per 1 min sgombrare i detriti o bolle.
   4. Utilizzando il software di imaging, selezionare individuare capillare sotto la scheda di individuare e regolare la x, y, asse z per posizionare il capillare del campione.
   5. Selezionare Locate campione e zoom a 0,6 X mettere a fuoco sull'embrione. Ruotare l'embrione per assicurare che l'asse lungo dell'arto imaged sia allineato con il percorso della luce delle due sorgenti luminose (Figura 1B).
2. Acquisizione di immagini
   1. Sotto la scheda di acquisizione , è necessario definire i parametri di percorso della luce come obiettivi di rilevamento, laser blocco filtro, divisore di fascio, telecamere e laser.
      Nota: Il canale GFP è utilizzato in questo esperimento (lunghezza d'onda di eccitazione: 488 nm; filtro di emissione: BP 505 a 545 nm, divisore di fascio: SPS LP 560).
   2. Seleziona la casella scansione pivot per riduzione di ombra.
   3. Definire le impostazioni di acquisizione: bit di profondità, a 16 bit; zoom, 0.36-0,7 X; illuminazione del singolo-lato (sinistra/destra) o dual side illuminazione.
   4. Fare clic su continua e impostare l'intensità del laser, tempo di esposizione, potenza laser e la posizione di foglio leggero per acquisire immagini più nitide.
      Nota: La potenza del laser è mantenuta più bassa possibile per ridurre al minimo photodamage.
   5. Premere STOP per acquisizione di immagini di fine.
3. Acquisizione multidimensionali
   1. Definire lo z-stack spostando la posizione Z per la prima e l'ultima immagine. Fare clic su Optimal per impostare il numero di slice.
   2. Fare clic su Avvia esperimento per acquisire z-pila selezionata.
   3. Quando è fatto, è possibile salvare l'immagine nel formato .czi.
4. Elaborazione di immagini (opzionale)
   1. Procedere con fusion Dual side sotto il canale di Lightsheet elaborazione se dual side illuminazione viene applicato. MultiView di elaborazione è necessario se Multi-viste vengono acquisiti per combinare immagini da diverse angolazioni.
   2. Creare un'immagine 2D utilizzando i dati dei pixel più alti intensità lungo l'asse di proiezione sotto il canale di Massima intensità di proiezione .
   3. In canale di copia , fare clic sul sottoinsieme per selezionare sottoinsiemi di immagini dal set originale.

4. quantificazione dell'assone Arborization (30 Min per ogni singolo nervo)

1. Aprire il file di immagine nel software di analisi di imaging (per impostazione predefinita, l'immagine contenente i dati XYZ è aperto in modalità Surpass e come una vista 3D-rendering).
2. Regolare il colore dell'immagine, luminosità e il contrasto utilizzando la finestra di Regolazione del Display (Edit | Regolazione del Display Visualizza) per rilevare filamenti basati sul contrasto di intensità locale.
3. Fare clic sull'icona Aggiungi nuovi filamenti e seleziona l'algoritmo Autopath (nessun ciclo) nel menu a discesa.
4. Selezionare la regione di interesse (in questo caso, la segmentazione dell'assone di interesse). Fare clic su prossimo quando finito.
5. Definiscono i punti di partenza e sementi assegnando le misurazioni di diametro più grande e più sottile, che possono essere misurate utilizzando la modalità Slice .
6. Assegnare un punto di partenza al bordo della regione di interesse. Per ottenere il manuale aggiunta o la rimozione dei punti di partenza, prima modificare la modalità puntatore (Navigate | Selezionare) e quindi MAIUSC + pulsante destro del mouse presso i punti di interesse.
7. Selezionare manuale soglie per punti di seme garantire che tutto il visibile arborization è contrassegnato. Modificare la modalità puntatore (Navigate | Selezionare) e quindi MAIUSC + click-sinistro presso i punti di interesse manualmente aggiungere o rimuovere punti seme.
   Nota: È importante rimuovere manualmente i rumori di fondo e segnali dai nervi vicini.
8. La casella rimuovere punti seme intorno a punti di partenza.
9. Verifica Rimuovi disconnesso segmenti per consentire l'esclusione di punti che sono troppo lontano e che può rappresentare il rumore di fondo. Indicare la Lunghezza massima di Gap nel passaggio successivo per definire il limite superiore per l'esclusione.
10. Regolare la soglia per la sottrazione del fondo, che utilizza un filtro gaussiano per stimare l'intensità di sfondo di ogni voxel.
11. Impostare la soglia automatica per diametro dendrite utilizzando l'algoritmo di zona cross-section approssimativo .
12. Ignorare i passaggi per il calcolo della colonna vertebrale.
13. Terminare il processo e scegliere lo stile desiderato e il colore.
14. Deselezionare la casella di volume nelle Proprietà per visualizzare solo gli assoni ricostruiti.
15. Selezionare la scheda statistiche , Detailed. Utilizzare filamento No. Dendrite terminale punti per quantificare i terminali del nervo motore come indicatore di arborization assone motore.
    Nota: Annotazione statistica può essere aggiunta se lo si desidera.
16. Esportare l'immagine dell'assone ricostruito come un file con estensione TIF.

Results

LSFM fornisce la visualizzazione dettagliata 3D di arborization assone e traiettoria di MN nel topo embrioni. In campo chiaro, tessuti appaiono completamente trasparenti dopo essere stato immerso nel reagente commerciale schiarimento. Nessun ritiro e/o gonfiore del campione è stata notata dopo fino a una settimana di deposito in compensazione reagente prima di formazione immagine. In canale di fluorescenza, motoneuroni sono etichettati con GFP transgenically espressa (1 film

Discussion

Diversi passaggi nel protocollo possono essere sottoposti a modifiche in determinate circostanze. Ad esempio, la durata della fissazione dipende dall'età degli embrioni, variabile da 2 h a 1 o più giorni utilizzando preparati paraformaldeide. Poiché la fissazione avviene prima dell'intero Monte immunostaining, per gli anticorpi che sono sensibili alla reticolazione della proteina, metanolo può essere usato come agente fissativo alternativo. Per un elevato rapporto segnale-rumore al momento di colorazione, è necessario ot...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hb9::GFP	Il laboratorio di Jackson	005029	Raccogliere embrioni del giorno embrionale 12,5 (E12,5)
4% Paraformaldeide (PFA)			Per 200ml: Aggiungere 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Regolare il pH a 7,4 con NaOH (10N). Filtrare, sterilizzare e conservare a -20 °C.
Soluzione salina tampone fosfato 10X (PBS 10X)			Per 1L: aggiungere 80 g di NaCl, 2 g di KCl, 14,4 g di Na2HPO4, 2,4 g di KH2PO4 e rabboccare con ddH2O. Autoclave e stoccaggio presso RT.
Triton X-100	Sigma	X100-500ML
Siero fetale bovino	ThermoFisher	26140079
Pecora policlonale anti-GFP	AbD Serotec	4745-1051	1:1000
Alexa Fluor 488 asino anti-pecora	Invitrogen	A-11015	1:1000
RapiClear 1.49 reagente schiarente	SunJin Lab	RC149001
1,5 ml micro tubo	Sarstedt	72.690.001
piastra a 24 pozzetti	ThermoFisher	142475
5 SA Pinzetta	ideal-tek	3480641
Iris Forbici striaght affilato/affilato	Aesculap	BC110R
Bisturi per microchirurgia, monouso	Aesculap	BA365
Microscopio da dissezione	Nikon	SMZ800
Agitatore	TKS	RS-01
Lightsheet Z.1 microscopio	Carl Zeiss Microscopy
Imaris 8.4.0 software di analisi delle immagini	Bitplane, Zurigo, Svizzera
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP topi)	The Jackson Laboratory	005029