Trapianto di isole pancreatiche è un modo per raggiungere normoglycemia in diabete di tipo 1. Questo articolo si concentra sulla tecnica di trapianto attraverso il percorso intraportal per mantenere i livelli normali del glucosio nei topi diabetici.
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Articolo metodologico
Intraportal trapianto di isole pancreatiche nel modello del topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Trapianto di isole pancreatiche per ridurre l'iperglicemia è altamente-riuscito nei roditori con diabete indotto chimicamente. Il sito più comune di trapianto trapianto di insule sperimentale è la capsula del rene. Tuttavia, come di meno è conosciuto circa l'interazione degli isolotti pancreatici con costituenti del sangue, ha anche senso di utilizzare l'approccio della vena portale nel trapianto di insule pancreatiche sperimentale.
Questo protocollo dimostra una tecnica di trapianto dell'isolotto intraportal in topi nudi NMRI. Streptozotocin (180 mg/kg) è iniettato intraperitonealmente per indurre l'iperglicemia nei topi di destinatario. Sono considerati come diabetico a un livello di glucosio nel sangue non a digiuno superiore a 20 mmol/L. Un giorno prima del trapianto, isolotti pancreatici del topo sono isolati dal pancreas donatore di digestione della collagenosi; un minimo di 350 isolotti sono utilizzata per ogni destinatario diabetica. A seconda del rendimento di isolamento dell'isolotto, due o più topi donatore sono utilizzati per ogni destinatario. Dopo coltura durante la notte a 37 ° C, isolotti sono amministrati nel destinatario fegato tramite la vena portale. Dopo la chirurgia, i topi sono protetti in case rosse Makrolon e osservati fino a sono svegli. Questo protocollo gestisce controllo glycemic per 120 giorni in topi syngeneic e 15 giorni in topi allogenici.
Introduzione
Trapianto dell'isolotto è un approccio promettente per il trattamento di tipo 1 diabete mellito1. Il primo tentativo di trasferire un frammento del pancreas di pecore in un paziente diabetico è stato effettuato da Watson Williams nel 1893. Tuttavia, un importante passo avanti nel trapianto di insule pancreatiche clinica è stato realizzato con il protocollo di Edmonton, e da allora in poi, una serie di programmi nazionali sono stati sviluppati2. In passato, diversi siti, quali il midollo osseo, borsa omentale, regione intramuscolare, superficie mucosa gastrica, milza e capsula del rene, sono stati esplorati in modelli preclinici, ma il sistema venoso portale è considerato come uno del sito adatto ed efficace per programmi clinici3,4,5,6.
Somministrazione esogena di insulina può essere sostituito dall'infusione dell'isolotto nella vena portale. Questo è considerato un sito preferito, perché l'apporto di ossigeno è paragonabile a quella del pancreas nativo a causa della posizione a valle della confluenza del portale dell'arteria e della vena. Inoltre, c'è una grande superficie, così che la struttura tridimensionale degli isolotti può essere conservata e vascolarizzazione potrebbe essere agevolato5. In un destinatario topo diabetico, 2.000 equivalenti di isolotto umana o suina o mouse 350 isolotti sono adeguati per invertire il stato iperglicemico7,8. Livelli di euglycemic sono stati segnalati per 15 giorni nel modello murino destinatario degli isolotti xenogeneic e nel modello di trapianto allogeneic del mouse-a-mouse e per più di 120 giorni nel trapianto syngeneic del mouse-a-mouse.
Fattori pertinenti per l'efficacia di trapianto dell'isolotto via vena portale sono appropriata anestesia, metodo di puntura e di emostasi9. L'anestesia può essere indotta da inalazione (5% isoflurano) o iniezione (ketamina, xilazina o pentobarbital), e le sostanze sono spesso combinate. Per il controllo della profondità e tempo di anestesia, si dovrebbe prestare attenzione allo stato del mouse, ad esempio il colore della membrana mucosa, palpebra, riflesso corneale, frequenza respiratoria e temperatura corporea. È importante garantire che l'animale non è in difficoltà e che sopravvive l'operazione. La temperatura può essere mantenuta dai dispositivi di riscaldamento differenti, quali termofori, rosso lampadine, ecc A caldo piastra termica è stato utilizzato per mantenere una temperatura di 25-30 ° C tra il mouse e la tabella di funzionamento, che impedisce il verificarsi di ipotermia. I dosaggi degli anestetici sono importanti in quanto tutti loro sono metabolizzati dal fegato, e funzione epatica può essere transitoriamente disordinati dall'infusione della sospensione dell'isolotto. Il punto di puntura ideale per vena portale è la posizione tra la prima e la seconda vena tributaria.
Il numero di isolotti e il volume di iniezione prevista anche influenza l'esito del trapianto, come un volume eccessivo può aumentare la sollecitazione di taglio. Un volume di 0,2 mL è considerato appropriato per trapianto dell'isolotto nella vena portale. La ferita di perforatura (ago 26-gauge) induce emorragia dalla vena portale, che deve essere fermato in modo tempestivo ed efficace. Garza sterile o un dito può essere applicato con una pressione minima presso il sito della puntura per circa 6 minuti per fermare l'emorragia. Presi insieme, portale isolotto iniezione è efficace e fornisce il regolamento sopra i livelli della glicemia in modelli di topo diabetico chimicamente indotta.
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Protocollo
Tutte le procedure in questo protocollo sono state approvate da linee guida e normativa sul benessere degli animali di tedesco. Considerare l'utilizzo di topi nudi di 10 a 12-week-old NMRI e topi C57Bl/6 (donatore: vecchia femmina; destinatario: maschio) durante gli esperimenti. Utilizzare topi nudi NMRI per isolamento dell'isolotto. Tenere i topi in condizioni definite secondo le normative di struttura animale locale.
1. induzione di diabete da Streptozotocin
- Il giorno -4, misurare il peso corporeo di 10 a 12 settimana-vecchio NMRI nudi topi e topi C57Bl/6 utilizzando una macchina di pesatura.
- Secondo il peso corporeo misurato, preparare una dose di 180 mg/kg dello streptozotocin in 0,1 mL di soluzione fisiologica per topo.
Nota: Streptozotocin dovrebbe essere appena preparata prima dell'uso e coperto con carta stagnola, in quanto è sensibile alla luce. - Iniettare i topi syngeneic e allogenici ciascuno con una singola dose di 0,1 mL dello streptozotocin (180 mg/kg) per via intraperitoneale utilizzando un ago 26-G.
- Il giorno -3, -2 e -1 raccogliere 2-4 µ l di sangue da puntura le vene di coda dei topi non a digiuno.
- Utilizzare 2-4 µ l di campione di sangue a striscia reattiva per misurare il glucosio nel sangue in topi nudi NMRI e topi C57Bl/6
Nota: A questo punto, l'80% dei topi dovrebbe diventare diabetico (20 mmol/L).- Utilizzare topi per trapianto dell'isolotto quando loro livelli di glucosio nel sangue raggiungono 20 mmol/L.
2. isolamento degli isolotti pancreatici dai topi
- Anestetizzare i topi con ketamina (100 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (20 mg/kg di peso corporeo) tramite l'iniezione intraperitoneale con un ago 26-G.
Nota: I volumi di ketamina e xilazina sono stati determinati secondo il peso corporeo degli animali (0,10 mL/10 g). - Tenere i topi in posizione supina e disinfettare con soluzione povidone-iodio. Confermare l'eutanasia corretto controllando il riflesso di pedale.
Nota: In caso di C57Bl/6 radere la regione addominale. - Tenete la pelle con una pinzetta e fare un'incisione del midline con le forbici per esporre la cavità addominale. Posto il situs dell'intestino a sinistra e di fuori della cavità addominale su un impacco di garza sterile.
- Regolare lo stomaco in un'altra direzione per individuare il pancreas e gli altri associati tessuti.
- Raggiungere l'aorta e fare un piccolo taglio per drenare il sangue. Utilizzare garza sterile per assorbimento di sangue.
- Rimuovere con cura l'intestino. Separare il pancreas dallo stomaco e milza.
- Asportare il pancreas e metterlo in una capsula Petri fresco. Rimuovere tutti i materiali indesiderati, quali grassi, usando il forcipe.
- Riempire una siringa da 5 mL con 4 mL di collagenasi e iniettare nel pancreas con un ago da 26 G (soluzione: 30 mg di collagenasi in 12 mL di soluzione di Hank).
- Tritare il pancreas con le forbici per aumentare la superficie per una migliore digestione e trasferirlo in una provetta tappo rosso 12 mL.
Nota: Soluzione salina equilibrata di Hank: HBSS 10 x (100 mL), penicillina-streptomicina (10ml), gentamicina (1 mL), ciprofloxacina (10ml), HEPES (35 mL), distillato di H2O (900 mL) - Eseguire una digestione per 10 min a 37 ° C in un bagnomaria con agitazione. Vortexare il campione tre volte a intervalli regolari per 15 s.
- Mescolare energicamente il pancreas digerito a mano per 3 min e posizionarlo sul ghiaccio per 10 s.
- Aggiungere 6 mL di soluzione di Hank fredda per fermare la reazione di digestione e centrifugare a 560 x g per 3 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere il supernatante e sciogliere la pastiglia in 10 mL di terreno di siero (P/FCS) vitello Parker/fetale a temperatura ambiente.
Nota: Medio P/FCS: TCM-199 10 x (100 mL), FCS (50 mL), penicillina-streptomicina (10ml), HEPES (20 mL), distillato di H2O (900 mL) - Identificare gli isolotti sulla base della loro morfologia (sferoide, colore bruno-dorato) sotto un microscopio chiaro. Evitare di isolotti con centri di scuri. Verifica per purezza e vitalità eseguendo Ditizone macchiatura sotto un microscopio chiaro.
Nota: Ditizone si lega allo ione zinco e fornisce la macchia di colore rosso agli isolotti. - Utilizzare una pipetta 1 mL per contare e accuratamente isolotti sotto un microscopio chiaro e trasferirli su una piastra Petri fresca (60 x 15 mm) contenente 4 mL di terreno di P/FCS.
Nota: Il volume di P /medie FCS di Petri non devono superare i 4 mL al fine di garantire la disponibilità di ossigeno. - Mantenere gli isolotti isolati in 4 mL di terreno di P/FCS durante la notte a 37 ° C in un incubatore.
3. preparazione degli animali per trapianto di insule pancreatiche
- Rimuovere gli isolotti isolati da incubatore 37 ° C e metterli sotto una panchina di flusso. Centro gli isolotti con un movimento oscillante circolare del piatto Petri.
- Riempire una siringa 1 mL (ago 23-G blu) con 0,1 mL di terreno di P/FCS. Quindi, aggiungere 350 isolotti in 0,3 mL di soluzione di Hank. Tenere la siringa in posizione verticale per consentire gli isolotti di stabilirsi.
- Diminuire il volume a 0,05 mL e sostituire l'ago 23-G blu con un ago 26G marrone. La stessa siringa, aggiungere 0,15 mL di Ficoll (medio gradiente di densità) verso l'alto per raggiungere un volume finale di 0,2 mL in siringa. Evitare le bolle d'aria.
- Tenere la siringa in posizione verticale e ruotare leggermente per evitare l'agglutinamento di isolotti. Le isolette si depositerà presso il cono della siringa entro 2-3 min.
- Misurare i livelli di glucosio nel corpo peso e sangue dei topi destinatari; i livelli di glucosio nel sangue dovrebbero essere circa 20 mmol/L.
- Anestetizzare i topi con ketamina (100 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (20 mg/kg di peso corporeo) tramite l'iniezione intraperitoneale con ago 26-G.
- Posizionare i mouse in posizione supina su una piastra termica calda (37 ° C). Controllare la profondità dell'anestesia pizzicando la punta.
- Pulire la regione addominale con soluzione povidone-iodio (disinfettante della pelle). Per evitare che gli occhi secchi, tenerli umidi con unguento oculare.
Nota: In caso di C57Bl/6 radere la regione addominale.
4. islet trapianto Intraportal per via
- Il giorno 0, iniziare con una laparotomia tenendo la pelle con il forcipe e fare un 2-3 cm-incisione del midline lungo con una forbice. Posto una garza sterile bagnata comprimere intorno ai bordi della ferita per mantenerla umida.
- Posto il situs dell'intestino a sinistra e di fuori della cavità addominale sull'impacco di garza sterile.
Nota: Mantenere umido durante tutta la procedura con soluzione di NaCl 0,9% pre-riscaldata o garza sterile imbevuto in una soluzione salina normale dell'intestino. - Spostare il duodeno e individuare il pancreas. Individuare la vena portale situata presso il sito ventrale spingendo verso l'alto il pancreas. Utilizzare un dito e il pollice per esporre la vena portale e, una volta esposto, perforarla vicino al fegato.
- Entro 1 min, lentamente e costantemente iniettare gli isolotti (0,2 mL dal punto 3.4) nella vena portale sotto l'ispezione di lente di ingrandimento per evitare eventuali perdite di isolotti.
Nota: Dopo l'iniezione, controllare sempre per isolotti rimanenti nella siringa. Prendere 1 mL di media P/FCS in una siringa, a filo in un fresco di Petri e conteggio al microscopio. - Posizionare un misuratore sterile sul sito di puntura e applicare una pressione con il dito indice (profondità di penetrazione: 0,5-1 cm) per 6 min fermare l'emorragia.
Nota: Il volume iniettato non deve superare 0,2 mL. Pressione e volume eccessivo può danneggiare le isolette a causa della sollecitazione di taglio. - Posizionare con attenzione il situs dell'intestino, peritoneo, strato del muscolo addominale e fascia posteriore in posizione.
- Usando il forcipe, sollevare la pelle, chiudere l'incisione del muscolo con il suturare assorbibile di seta e strato superiore della pelle con 2-3 clip.
- Pulire la superficie con un disinfettante della pelle, applicare un guaritore ferita e posizionare i topi in gabbie individuali. Guaritore ferita fornisce un strato di acrilico resistente all'acqua e proteggere da macerazione e infezione secondaria.
Nota: Osservare i topi fino a quando essi hanno ripreso conoscenza sufficiente, fornire tramadol (0,2 mg per topo) insieme a fluidi. In questo protocollo, topi recupero dall'anestesia rapidamente e tramadol amministrazione ha ridotto il dolore. Dopo 7 giorni, dovrebbe guarire la ferita. - Nutrire i topi con acqua e cibo normale. L'escrezione dell'urina e del consumo di cibo e acqua aumenterà dopo l'iniezione di streptozotocin.
- Misurare i livelli di glucosio nel sangue ogni giorno per la prima settimana e poi una volta a settimana in topi syngeneic. In topi allogenici, misurare i livelli di glucosio nel sangue tre volte a settimana per fino a 15 giorni.
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Risultati
La competenza delle insule trapiantate è stata studiata in topi diabetici chimicamente indotti. Gli isolotti sono stati trapiantati tramite il sistema venoso portale nel modello di topi diabetici. Il rapporto donatore-destinatario era 2:1. Nel modello syngeneic del topo, due topi di donatore sono stati utilizzati per ottenere 350 isolotti. Gli isolotti sono stati poi trapiantati in topi diabetici. Stata osservata una riduzione nel livello di glucosio nel sangue il giorno 1 dopo trapianto,...
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Discussione
In questo studio, il percorso intraportal di trapianto dell'isolotto è esplorato. Questo protocollo è altamente efficace nell'alleviamento dello stress diabetico e fornisce un'opportunità di approfondimento per esplorare studi di trapianto dell'isolotto. Questo protocollo conferma che circa 350 isolotti murini sono in grado di invertire lo stato iperglicemico. Inoltre, nessuno dei topi morti durante la procedura e controllo glicemico è stato realizzato in tutti i destinatari. Livelli di glucosio nel sangue e peso del cor...
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Dichiarazioni
Tutti gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Vorremmo riconoscere Gundula Hertl per il suo sostegno.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| C57Bl/6 topi | Charles River (Sulzfeld, Germania) | (10-12 settimane) | |
| Topi BALB/c | Charles River (Sulzfeld, Germania) | (10-12 settimane) | |
| NMRI topi nudi | Charles River (Sulzfeld, Germania) | (10-12 settimane) | |
| Ketamina | Bela-pharm | ||
| Xilazina | CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH | ||
| Siringa, ago 23G e 26G | BD | ||
| Piastra di Petri | Falcon | 303800 | |
| NaCl | Carl Roth | 351007 | |
| Garza sterile | Fuhrmann | 7647-14-5 | |
| Agitazione Bagno d'acqua | Kotterman | 1501 | |
| Forbici | Braun | 1501 | |
| Glucometro | One Touch | ||
| Thermo Fisher | |||
| Braunol (soluzione di ioduro di povidone) | B.Braun Melsungen AG | 3864154 | |
| Liposic Edo - Unguento spruzzato (unguento per gli occhi) | Dr. G Mann Chem.-Pharm. Incubatore GmbH | ||
| Fa. Roth | |||
| Flow Bench | Herdus | ||
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 5-0 Sutura in seta Vicryl | Braun | (7,5 * 1,75 mm) | |
| Morsetti Michel (clip) | Aesculap | BN507R | |
| P/FCS Soluzione | Gibco | 21180-021 | |
| TCM-199 (10x) | Gibco | 21180-021 | |
| FCS | Biowest | S1810-500 | |
| Penicillina-streptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES (1 M) | Biochrom | L 1613 | |
| Gentamycin | Ratiopharm | ||
| Ciprofloxacina | Fresenius Kabi | ||
| Hank's Solution | Gibco | 14060-040 | |
| Collagenasi | Roche | 11213865001 | |
| Streptozotocina | Calbiochem | 572204 | |
| OPSITE-spray (guaritore di ferite) | Smith e nipote | 66004978 | |
| Reugular cibo | Altromin | ||
| Faro LED 16042 (lente d'ingrandimento) | Eschenbach | 16042 | |
| Anticorpo primario monoclonale anti-topo PECAM-1(CD31) | Millipore, Chemicon | CBL1337 | Diluizione (1:100) |
| Anticorpo secondario anti-ratto asino | Dianova | 712095153 | Diluizione (1:400) |
| Anticorpo primario anti-insulina cavia policlonale | Dako | A0564 | (1:500) |
| Anticorpo secondario anti-cavia d'asino | Dianova | 706-259-148 | Diluizione (1:400) |
Riferimenti
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), a007823(2012).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Cantarelli, E., et al. Bone marrow as an alternative site for islet transplantation. Blood. 114 (20), 4566-4574 (2009).
- Echeverri, G. J., et al. Endoscopic gastric submucosal transplantation of islets (ENDO-STI): technique and initial results in diabetic pigs. American Journal of Transplantation. 9 (11), 2485-2496 (2009).
- Korsgren, O., et al. Optimising islet engraftment is critical for successful clinical islet transplantation. Diabetologia. 51 (2), 227-232 (2008).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. British Journal of Surgery. 95 (12), 1449-1461 (2008).
- Lingwal, N., et al. Inhibition of gelatinase B (matrix metalloprotease-9) activity reduces cellular inflammation and restores function of transplanted pancreatic islets. Diabetes. 61 (8), 2045-2053 (2012).
- Chen, C., et al. Improved intraportal islet transplantation outcome by systemic IKK-beta inhibition: NF-kappaB activity in pancreatic islets depends on oxygen availability. American Journal of Transplantation. 11 (2), 215-224 (2011).
- Wang, Y., Wang, T., Zhang, L. Three aspects are critical for carrying out intraportal islet transplants successfully in a diabetes mouse model. Experimental and Clinical Transplantation. 10 (3), 302-304 (2012).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374(2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Rother, K. I., Harlan, D. M. Challenges facing islet transplantation for the treatment of type 1 diabetes mellitus. Journal of Clinical Investigation. 114 (7), 877-883 (2004).
- Su, Z., et al. Small islets are essential for successful intraportal transplantation in a diabetes mouse model. Scandinavian Journal of Immunology. 72 (6), 504-510 (2010).
- Rekittke, N. E., Ang, M., Rawat, D., Khatri, R., Linn, T. Regenerative Therapy of Type 1 Diabetes Mellitus: From Pancreatic Islet Transplantation to Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 22(2016).
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Ristampe e permessi
