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Articolo metodologico

Adeno-associato Virus-mediate consegna di CRISPR per Gene cardiaco nei topi di Editing

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DOI:

10.3791/57560

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2 agosto 2018

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, Davis Heart and Lung Research Institute, Biomedical Sciences Graduate Program, Biophysics Graduate Program, Ohio State University Wexner Medical Center

In questo articolo

Sommario

Qui forniamo un protocollo dettagliato per effettuare in vivo gene cardiaco editing nei topi utilizzando Virus ricombinante Adeno-Associated (rAAV)-mediate consegna di CRISPR. Questo protocollo offre una strategia terapeutica di promessa per il trattamento di cardiomiopatia distrofica nella distrofia muscolare di Duchenne e può essere utilizzato per generare specifico knockout in topi postnatali.

Abstract

Il sistema cluster, regolarmente intercapedine, breve, palindromico di ripetere (CRISPR) ha notevolmente facilitato ingegneria genoma in cellule coltivate e gli organismi viventi da una grande varietà di specie. La tecnologia CRISPR è stata esplorata anche come approcci terapeutici per un certo numero di malattie umane. Dati di prova sono molto incoraggianti, come esemplificato da studi recenti che dimostrano la fattibilità e l'efficacia di gene editing basato su approccio terapeutico per la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) utilizzando un modello murino. In particolare, iniezione endovenosa ed intraperitoneale del rh.74 di sierotipo del virus adeno-associato ricombinante (rAAV) (rAAVrh.74) ha permesso la consegna efficiente cardiaca di Staphylococcus aureus CRISPR-collegata della proteina 9 (SaCas9) e due Guida RNAs (gRNA) per eliminare una regione genomica con un codone mutante nell'esone 23 del gene Dmd del mouse. Questo stesso approccio è utilizzabile anche per battere il gene di interesse e studiare la loro funzione cardiaca nei topi postnatali quando il gRNA è progettato per la regione di codificazione del gene. In questo protocollo, vi mostriamo nel dettaglio come ingegnere vector rAAVrh.74-CRISPR e come raggiungere altamente efficiente consegna cardiaca in topi neonatali.

Introduzione

Il cluster, regolarmente intercapedine, breve palindromi ripetere (CRISPR) tecnologia rappresenta il più recente avanzamento in ingegneria del genoma e ha rivoluzionato la pratica corrente della genetica in cellule e degli organismi. Editing basato su CRISPR genomico utilizza una sola guida RNA (gRNA) per dirigere un'endonucleasi associata CRISPR come CRISPR-associated protein 9 (Cas9) e Cpf1 ad un target di DNA genomico che è complementare in sequenza la protospacer codificati da gRNA con un protospacer specifici motivi adiacenti (PAM)1,2. Il PAM varia a seconda della specie batterica del gene Cas9 o Cpf1. Il più comunemente usata nucleasi Cas9 derivata da Streptococcus pyogenes (SpCas9) riconosce una sequenza di PAM di NGG che si trova direttamente a valle della sequenza dell'obiettivo nel DNA genomico, sul filo del non-bersaglio. Presso il sito di destinazione, le proteine Cas9 e Cpf1 generano una rotture a doppio filamento (DSB), che sono poi ripristinata via intrinseci meccanismi di riparazione del DNA cellulari tra cui unirsi non-omologo fine (NHEJ) e riparazione omologia-diretto (HDR) vie3, 4. In assenza di un modello di DNA per ricombinazione omologa, il DSB è principalmente riparato da pathway NHEJ errori, che possono provocare gli inserimenti o eliminazioni (indels) di nucleotidi causando mutazioni frameshift, se l'organo di conciliazione sono stato creato nella codificazione regione di un gene5,6. Così, il sistema CRISPR è stato ampiamente utilizzato per progettare le mutazioni di perdita-de-funzione in vari modelli cellulari e interi organismi, al fine di studiare la funzione di un gene. Inoltre, il cataliticamente inattivo Cas9 e Cpf1 sono stati sviluppati per trascrizionalmente ed epigeneticamente modulare l'espressione di geni bersaglio7,8.

Più recentemente, sia SpCas9 e SaCas9 (derivato da Staphylococcus aureus) sono stati imballati in vettori ricombinanti virus adeno-associato (rAAV) per la correzione genica postnatale nel modello animale di malattie umane, in particolare, Duchenne distrofia muscolare (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD è una malattia recessiva legata al X fatale causata da mutazioni nel gene DMD , che codifica per la proteina distrofina16,17, che interessa circa uno in 3500 nati maschi secondo screening neonatale18 , 19. è caratterizzata da debolezza muscolare progressiva e lo spreco. I pazienti DMD di solito perdono la capacità di camminare tra i 10 e i 12 anni di età e morire di insufficienza respiratoria e/o cardiaco all'età di 20-30 anni20. In particolare, la cardiomiopatia si sviluppa in > 90% dei pazienti DMD e rappresenta la principale causa di morte in pazienti DMD21,22. Anche se Deflazacort (un farmaco anti-infiammatorio) ed Eteplirsen (un esone che salta medicina per saltare essone 51) recentemente sono stati approvati per la DMD da Food and Drug Administration (FDA)23,24, nessuno di questi trattamenti correggere il difetto genetico a livello di DNA genomico. Il topo mdx, che trasporta una mutazione di punto all'esone 23 del gene della distrofina, è stato ampiamente usato come un DMD modello25. Inoltre, abbiamo in precedenza dimostrato che l'espressione di distrofina funzionale è stato restaurato da omissione in-struttura del DNA genomic che coprono gli essoni 21, 22 e 23 nella muscolatura scheletrica di topi mdx utilizzando intramuscolare annuncio-SpCas9/gRNA consegna9 e nei muscoli del cuore di topi mdx/utrofina+ /- mediante consegna di rAAVrh.74-SaCas9/gRNA endovenosa ed intraperitoneale26.

In questo protocollo, descriviamo in dettaglio ogni passo nel gene cardiaco postnatale di editing per ripristinare la distrofina in topi mdx/utrofina+ /- utilizzando rAAVrh.74-SaCas9/gRNA vettori, dalla progettazione di gRNA alla distrofina analisi nelle sezioni del muscolo di cuore.

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Protocollo

Gli animali utilizzati in questo protocollo sono stati mantenuti a The Ohio State University laboratorio le risorse animali conformemente alle linee guida sull'uso degli animali. Tutti gli studi sugli animali sono stati autorizzati dal istituzionale Animal Care, uso e Comitato di revisione della Ohio State University.

1. progettazione e clonazione del gRNAs nel vettore CRISPR

  1. Selezionare 2 gRNAs targeting distrofina introne 20 e introne 23 (i20 e i23) per SaCas9: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT e i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (la sequenza di PAM è sottolineata e corsivo).
    Nota: I siti di destinazione per i20 e i23 sono circa 23 kg coppia di basi (kbp) distanza. Per interrompere un gene che codifica, due gRNAs targeting degli esoni comuni con il PAM NNGRRT sequenza per SaCas9 (preferibilmente NNGAAT, NNGGGT e NNGAGT) e distanza all'interno di 20 kbp sono raccomandati.
  2. Utilizzare i seguenti parametri PCR per temprare il gRNA oligos (100 µmol/L) in 1x tampone di ricottura (5 x ricottura scorte regolatrici contiene 0,5 mol/L K-acetato, 150 mmol/L HEPES-KOH, 10 mmol/L Mg-acetato, pH7.4): 95 ° C 10 min, 90 cicli di 95-59 ° C con un 0,4 ° C diminuire al ciclo per 20 s, 90 cicli di 59 a 32 ° C con una diminuzione di 0,3 ° C per ciclo per 20 s, 20 cicli di 32 a 26 ° C con una diminuzione di 0,3 ° C per ciclo per 20 s.
  3. Legare i oligos gRNA ricotto nella pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA utilizzando BsaI e T4 DNA ligasi in uno reazione (1 µ l 50 ng / µ l pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, i oligos 1 µ l ricotto, buffer di 1,5 µ l 10 x T4 DNA ligasi, 0,5 µ l T4 DNA ligasi, 1 µ l BsaI, 10 µ l ddH2O ), con la seguente condizione di reazione in un cycler PCR: 5 cicli di [37 ° C 5 min e 16 ° C 10 min]; 37 ° C 20 min; 80 ° C 5 min.
  4. Trasformare il prodotto di legatura di 15 µ l in cellule competenti di 30 µ l, piatto le cellule nella piastra di agar con 100 µ g/mL di ampicillina e coltura a 37 ° C per 24 h.
  5. Prendere 5-10 colonie e cultura in LB medium contenente ampicillina 100 µ g/mL a 37 ° C, 250 giri/min in un incubatore agitatore per 3-4 h.
  6. Le colonie di PCR a schermo: 10 µ l 2 x mix master PCR, 8 µ l ddH2O, cultura di e. Coli 1 µ l, primer di 10 µmol/L U6-forward 1 µ l, 1 µ l i20 o i23 gRNA reverse primer. I parametri di ciclismo di PCR: 95 ° C 5 min, 35 cicli di 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s.
  7. Preparare 5 mL coltura dei cloni positivi aggiungendo 4 mL fresco LB Media containing100 µ g/mL ampicillina e cultura durante la notte a 37 ° C, 250 giri/min.
  8. Purificare il plasmide DNA utilizzando il kit di estrazione del plasmide appropriato e verificare il plasmide di Sanger sequenziamento con il primer di U6-forward.
  9. Coltura di cellule C2C12 in DMEM completati con 10% FBS e 1% penna-Strep fino a raggiungere la confluenza di ~ 70% per le prove del gene efficacia dei plasmidi di editing.
  10. Electroporate un totale di 5 µ g SaCas9/gRNA miscela di plasmide in rapporto molare 1:1 in 1 x 106 C2C12 cellule secondo il protocollo del produttore.
  11. Dopo la post-trasfezione 48h raccolto le cellule C2C12 ed estrarre il DNA genomico.
  12. Uso 100 ng DNA genomico come modello per eseguire la reazione di PCR per locus distrofina del mouse: forward primer 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µ l 10 µmol/L), reverse primer 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µ l 10 µmol/L), 10 µ l 2 x il verde PCR master mix, 7 µ l ddH2O, (DNA genomico di 1 µ l 100 ng). Utilizzare la PCR ciclismo condizioni come 95 ° C 5 min, 35 cicli di [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s], 72 ° C 2 min.

2. rAAV produzione

  1. Per la coltura delle cellule, le cellule di AD293 sui 20-40 di 15 cm piatti del seme e mantenere in DMEM completati con 10% FBS e 1% penna-Strep fino a raggiungere la confluenza di ~ 90% per la transfezione.
  2. Diluire 3 plasmidi con 200 µ l ridotto medio del siero (per ogni piatto): 1) 10 µ g pHelper; 2) 5 µ g pXR (rh.74 o altri sierotipi) e 3) un totale di 5 µ g di miscela pX601-i20 e pX601-i23 (rapporto 1:1). Eseguire polyethylenimine (PEI) transfezione mescolando con 80 µ l PEI e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Aggiungi la miscela su colture cellulari AD293 in modo goccia a goccia.
  3. Per la produzione di virus AAV, dopo la trasfezione di 72 h post, usate un raschietto di cella per raccogliere sia i media e il pellet di cellule AD293 mediante centrifugazione a 1100 x g per 10 minuti.
  4. Risospendere il pellet cellulare in tampone di lisi rAAV 15 mL (50 mmol/L Tris Base, 150 mmol/L NaCl, pH 8.5) seguito da 3 cicli di gelo-disgelo con alternanza di incubazione in azoto liquido e bagnomaria a 42 ° C. Memorizzare i lisati cellulari a-80 ° C per l'elaborazione di futuri se non vengono elaborati immediatamente.
  5. Filtrare i terreni di coltura con un filtro da 0,45 µm e aggiungere un 40% PEG8000 2,5 mol/L NaCl a una concentrazione finale di 8%. Incubare la miscela a 4 ° C per 1 h e centrifugare a 1100 x g per 15 min.
  6. Risospendere il pellet in tampone di lisi rAAV e si combinano con i lisati cellulari dal punto 2.3, seguita da trattamento benzonase (50 U/mL) a 37 ° C per 1 h.
  7. Centrifugare il rAAV benzonase-trattati contenente miscela 1100 x g per 15 min a 4 ° C e salvare il surnatante (la preparazione rAAV grezzo).

3. rAAV purificazione e concentrazione

  1. Caricare la preparazione rAAV grezzo su una pendenza di iodixanol in un tubo di ultracentrifuga nel seguente ordine dall'alto verso il basso: greggio AAV lisato (~ 15 mL), 8 mL 15% Iodixanol, 6 mL 25% Iodixanol, 5ml 40% Iodixanol, 5ml 58% Iodixanol. Riempire il restante volume vuoto del tubo verso l'alto utilizzando 1 x DPBS.
  2. Centrifugare i campioni a 230.000 x g in un rotore ultracentrifuga per 120 min a 10 ° C e raccogliere 3-4 mL della frazione gradiente 40% contenenti le particelle rAAV con un ago da 18 G.
  3. Diluire le particelle rAAV con 1 x DPBS e centrifuga utilizzando l'unità filtro centrifugo (MWCO 100 kDa). Ripetere questo passaggio per 3 - 5 volte e finalmente concentrarsi la preparazione rAAV a 300-500 µ l.

4. rAAV titolazione

  1. Estrarre il DNA genomico da 2 µ l concentrato rAAV, precipitato con 3 M NaOAc in etanolo e risospendere in 20 µ l ddH2O.
  2. Per ottenere la curva standard per la quantificazione rAAV diluizione seriale del plasmide pX601: 1 x 109, 1x108,1 x 107, 1 x 106, 1 x 105 copie in ogni 10 µ l ddH2O. Diluire il rAAV dnaasi-trattati campioni come 01:10, 01:50, 1: 100 e 1: 1000.
  3. Determinare il titolo rAAV, mediante PCR quantitativa in tempo reale (qPCR), utilizzando qPCR Kit seguendo le istruzioni del produttore in un sistema Real-Time PCR: 1 µ l 10 µmol/L di ciascun primer (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC e 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µ l 2 x mix master di PCR, 1 µ l diluito rAAV campioni e 2 µ l ddH2O. eseguire la reazione con i seguenti parametri in bicicletta: 95 ° C 3 min, 45 cicli di [95 ° C 5 sec e 61 ° C 20 sec].

5. endovenoso e l'iniezione intraperitoneale di rAAVrh.74-CRISPR in neonatale mdx/utrofina+ /- topi

  1. Immobilizzare il mdx/utrofina+ /- cuccioli di topo (giorno 3) inserendo il ghiaccio per 1 min e quindi amministrare con 1 x 1012 particelle virali in 50 µ l per topo sistematicamente tramite un approccio retro-orbitale o un'iniezione intraperitoneale.
  2. Consentire i topi recuperare e rimettere nella loro casa gabbie. A dieci settimane dopo amministrazione di rAAV, eutanasia i topi di CO2 esposizione per la raccolta del tessuto.
  3. Snap-congelare tessuti per estrazione di DNA e RNA genomico e uso raffreddamento isopentano in azoto liquido per congelare i tessuti con temperatura ottimale di taglio composto per il criosezionamento.

6. l'analisi del Gene Target risultati di Editing

  1. Analisi di PCR del DNA genomic
    1. Isolare il DNA genomico da tessuti del cuore dei topi mdx/utrofina+ /- trattato con o senza rAAV totale.
    2. Utilizzare lo stesso protocollo in 1.12 passo per l'analisi di PCR.
  2. Analisi di RT-PCR dell'espressione di distrofina
    1. Estrarre RNA totale da tessuti del cuore con il kit di estrazione di RNA seguendo il manuale del produttore.
    2. Per eseguire la trascrizione inversa, pre-trattare il RNA totale con una dnasi RNAsi-libera e utilizzare 5 µ g di RNA trattato come il modello per la sintesi del cDNA del primo-filo con il kit di trascrizione inversa.
    3. Utilizzare il prodotto di trascrizione d'inversione per l'analisi di RT-PCR dell'espressione di distrofina con gli iniettori di cDNA di distrofina: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT e 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.
  3. Stimare il gene editing efficacia da analisi qPCR
    1. Stimare il gene editing efficacia mediante RT-PCR quantitativa per rilevare la riduzione delle trascrizioni di esone contenente 22 utilizzando il primer forward (esone 21): 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA e il primer reverse (esone 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Utilizzare Gapdh come un gene di riferimento con il primer forward: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC e il reverse primer: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.
    2. Eseguire la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR), utilizzando la qPCR Kit seguendo le istruzioni del produttore in un sistema Real-Time PCR e le condizioni di reazione di 2-step: 95 ° C 3 min, 45 cicli di 95 ° C 5 sec e 61 ° C 30 sec.
  4. Immunofluorescenza che macchia per analizzare l'espressione di distrofina
    1. Tagliare i tessuti congelati utilizzando un criostato ad uno spessore di 10 µm. Fix le sezioni congelate con paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 15 min.
    2. Lavare 2 volte con PBS e incubare con blocco soluzione (10% di siero equino) per 1 h.
    3. Incubare l'anticorpo primario anti-distrofina, a 4 ° C durante la notte.
    4. Lavare i vetrini con PBS 3 x 5 min e incubare con anticorpi secondari fluorescenti (1: 500) a temperatura ambiente per 1 h.
    5. Montare le diapositive utilizzando il mezzo di montaggio con DAPI e imaging con un microscopio confocale invertito.

7. off-target analisi dall'analisi di T7E1

  1. Prevedere i potenziali siti di fuori bersaglio utilizzando il CRISPR online strumenti di progettazione come < http://crispr.mit.edu>.
  2. Amplificare le regioni genomiche che copre la parte superiore 5-10 siti potenziali di fuori bersaglio mediante PCR: genomic DNA 200 ng, 1 µ l ad alta fedeltà della polimerasi di DNA, 5 µ l 10X PCR Buffer mix, 1,5 µ l 10 µmol/L di site-specific primers forward e reverse, regolazione del volume totale di 50 µ l con ddH2O.
  3. Eseguire i prodotti PCR mediante elettroforesi, estrarre e purificare il DNA utilizzando un kit di estrazione del gel. Misurare la concentrazione utilizzando spettrofotometri.
  4. Promuovere la formazione di denaturazione e ri-ricottura gli ampliconi purificati lentamente nella 2.1 Buffer utilizzando un cycler PCR. Utilizzare le stesse condizioni di ciclismo come descritto al punto 1.2.
  5. I prodotti ri-Ricotti per 30 min a 37 ° C con enzima di T7E1 0,5 µ l di digerire e analizzare la reazione l'elettroforesi del gel dell'agarosi 1-2%.
    Nota: Gli ampliconi possono essere analizzati anche da sequenziamento profondo mirato.

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Risultati

L'efficacia di gRNAs per indurre l'eliminazione della regione di DNA genomica di destinazione dovrebbe essere valutata in colture di cellule prima del confezionamento in rAAV per studi in vivo. A tal fine, il gRNAs e il SaCas9 esprimenti costrutti erano individulamente in cellule C2C12 e il DNA genomico è stato analizzato mediante PCR con primers fiancheggianti i siti di destinazione (Figura 1). Un prodotto PCR di ~ 500 bp indica l'eliminazione di successo de...

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Discussione

In questo protocollo, abbiamo dettaglio tutti i passi necessari per raggiungere in vivo gene cardiaco modifica in topi postnatali utilizza il recapito rAAVrh.74-mediata di SaCas9 e due gRNAs. Come precedentemente osservato, questo approccio può essere utilizzato per ripristinare l'espressione di distrofina in topi distrofici come descritto nel nostro lavoro27, ma potrebbero anche permettere gli studi di genetica inversa rapida dei geni legati al cardiaco in topi senza il lungo processo de...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi esiste.

Ringraziamenti

U.R. è supportato dagli Stati Uniti istituti nazionali di sovvenzioni di salute (R01HL116546 e AR064241 R01).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Alexa Fluor 555 capra anti-coniglio IgGThermo Fisher ScientificA-21428
Benzonasi NucleasiSigma-AldrichE1014
Bio Armadi di sicurezzaThermo Fisher Scientific13471300 Serie A2 Classe II, Tipo A2
BsaINew England BioLabs IncRO535S
Cellule competentiAgilent Technologies
Piastre per colture cellulari, 150 mmNest Scientific USA715001
CryostatLeica BiosystemsLeica CM3050S
DMEMThermo Fisher Scientific MT10017CVCorning cellgro
Anticorpo distrofinaSpring BioscienceE2660
Fast-Ion Midi Plasmdi KitIBIScientific IB47111
FBSThermo Fisher Scientific26-140-079
Unità filtro, 0,45μ mThermo Fisher Scientific166-0045
GoTaq Master MixesPromegaM7122
Mini kit di plasmidi ad alta velocitàIBI ScientificIB47102
Siero di cavalloAbcamab139501
Isotemp 2239 Bagno d'acquaThermo Fisher Scientific15-460-11Q
Isotemp Blocco termicoThermo Fisher Scientific11-718
Microscopio confocale invertitoCarl Zeiss Microscopy, LLCLSM 780
LightCycler 480 strumentoRoche5015243001LightCycler 480 Strumento II
Centrifuga di grande capacitàThermo Fisher Scientific46-910Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus
MicrocentrifugaThermo Fisher Scientific75002445Sorvall Legend Micro 21R
Spettrofotometri NanodropThermo ScientificND2000CLAPTOPNanoDrop™ 2000/2000c
Oligo per i20-FIntegrated DNA TechnologiesCACCgGGCGT
TGAAATTCTCATTAC
Oligos per i20-RIntegrated DNA TechnologiesAAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;
Oligo per i23-FIntegrated DNA TechnologiesCACCgCACCGATGAGAGGG
AAAGGTC
Oligos for i23-RIntegrated DNA TechnologiesGACCTTTCCCTCTCATCGGTGc
OligosIntegrated DNA Technologies
OptiPrep Density Gradient MediumSigma-AldrichD1556-250ML
OptiMEMThermo Fisher Scientific
PEG8000Sigma-Aldrich89510-1kg-F
PolietilenimminaPolysciences23966
Proteinasi KSigma-AldrichP2308
Provetta per centrifuga a tenuta rapidaBeckman Coulter Inc342414
Kit di estrazione del gel QIAquickQiagen28704
Kit qPCR Hi-ROX verde SYBR radianteAlkali ScientificQS2005
RevertAid RT Kit di trascrizione inversaThermo Fisher ScientificK1691
RotoreBeckman Coulter IncTipo 70Ti
DNA ligasiNew England BioLabs IncM0202S
TermociclatoreBio-rad1861096
TRIzol ReagenteThermo Fisher Scientific15596026
UltracentrifugaBeckman Coulter Inc8043-30-1192Optima le-80k
Unità filtrante ultra centrifugaMilliporeSigmaUFC510096
Mezzo di montaggio VECTASHIELD con DAPIVector Laboratories, IncH-1200
20031431985070 337922 T4

Riferimenti

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