Qui, descriviamo un protocollo per ottenere i dati di sequenza di amplicon del suolo, rizosfera e radice endosphere microbiomi. Questa informazione può essere utilizzata per studiare la composizione e la diversità delle comunità microbiche pianta-collegato ed è adatta per l'uso con una vasta gamma di specie di piante.
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Articolo metodologico
Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'intima interazione tra pianta ospite e microrganismi associati è cruciale nel determinare la pianta fitness e può favorire una migliore tolleranza agli stress abiotici e malattie. Come il microbioma di pianta può essere molto complesso, a basso costo, metodi di high throughput come amplicon di sequenziamento del gene del rRNA 16S sono spesso preferiti per caratterizzare la composizione microbica e la diversità. Tuttavia, la selezione di una metodologia appropriata quando lo svolgimento di tali esperimenti è fondamentale per ridurre le distorsioni che possono rendere difficile analisi e confronti tra campioni e studi. Questo protocollo descrive in dettaglio una metodologia standardizzata per la raccolta e l'estrazione di DNA da terreno, rizosfera ed esempi di radice. Inoltre, evidenziamo una pipeline di sequenziamento consolidata 16S rRNA amplicone che consente per l'esplorazione della composizione delle comunità batteriche in questi campioni e può essere facilmente adattati per altri geni marcatori. Questa pipeline è stata convalidata per una varietà di specie vegetali, tra cui sorgo, mais, frumento, fragola e agave e può aiutare a superare i problemi associati alla contaminazione da organelli di pianta.
Introduzione
Microbiomi pianta-collegato è costituito da comunità microbiche dinamica e complessa, costituita da batteri, archaea, virus, funghi e altri microrganismi eucarioti. Oltre al loro ruolo ben studiata a causa di malattia delle piante, microbi pianta-collegato possono influenzare positivamente anche pianta salute migliorando la tolleranza agli stress biotici e abiotici, promuovendo la disponibilità di nutrienti, e migliorare la crescita delle piante attraverso la produzione di ormoni vegetali. Per questo motivo, particolare interesse esiste nel caratterizzare i taxa che associano con pianta radice endospheres, metodologie e il terreno circostante. Mentre alcuni microbi po....
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Protocollo
1. raccolta e separazione della radice Endosphere, rizosfera e campioni di terreno
- Prima di entrare il campo, autoclave acqua ultrapura (almeno 90 mL di acqua per esempio) per sterilizzare. Preparare epifita rimozione tampone (almeno 25 mL per campione) aggiungendo 6,75 g di KH2PO4, 8,75 g di K2HPO4e 1 mL di Triton X-100, 1 L di acqua sterile. Sterilizzare il buffer utilizzando un filtro a depressione con pori di 0,2 µm.
- Per la procedura 1.2 a 1.5, indossare guanti puliti sterilizzati con etanolo a tutte le volte e sostituire i guanti tra ogni campione per evitare la contaminazione. Tutte le apparecchiature....
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Risultati
Eseguire il protocollo raccomandato dovrebbe comportare un dataset di indicizzata fine accoppiato letture che possono essere abbinati torna a ciascun campione e assegnate a entrambi un batterico unità tassonomica operative (OTU) o variante di sequenza esatta (ESV, noto anche come amplicone variante di sequenza (ASV) e sub-operational unità tassonomica (sOTU)), a seconda dell'analisi a valle. Al fine di ottenere dati di sequenza di alta qualità, si deve prestare attenzione ad ogni passo pe.......
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Discussione
Questo protocollo dimostra una pipeline stabilita per esplorare radice endosphere, rizosfera e composizioni di comunità microbica del suolo, dalla campionatura del campo di trattamento del campione e sequenziamento a valle. Studio associato radice microbiomi presenta sfide uniche, dovuto in parte per le difficoltà insite nel campionamento dal suolo. I terreni sono altamente variabile in termini di proprietà fisiche e chimiche, e condizioni del terreno possono essere separate da appena pochi millimetri28.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS è supportato dal NSF Graduate Research Fellowship Program.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,1-10/20 µ L puntali per micropipette filtrati | USA Scientific | 1120-3810 | Può sostituire con equivalenti di altri fornitori. |
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL | USA Scientific | 1615-5510 | Può sostituire con equivalenti di altri fornitori. |
| 10 µ L pipetta multicanale | Eppendorf | 3122000027 | Può sostituire con equivalente di altri fornitori. |
| 10 µ L, 100 & micro; L, e 1000 µ L micropipette | Eppendorf | 3120000909 | Può sostituire con equivalenti di altri fornitori. |
| 100 µ L pipetta multicanale | Eppendorf | 3122000043 | Può sostituire con equivalente di altri fornitori. |
| 1000 µ L puntali per micropipette filtrati | USA Scientific | 1122-1830 | Può sostituire con equivalenti di altri fornitori. |
| Provette per microcentrifuga da 2 mL | USA Scientific | 1620-2700 | Può sostituire con equivalenti di altri fornitori. |
| Setaccio del suolo da 2 mm | Silvicoltura Fornitori | 60141009 | Può sostituire con equivalente di altri fornitori. |
| 200 µ L puntali per micropipette filtrati | USA Scientific | 1120-8810 | Può sostituire con equivalenti di altri fornitori. |
| Serbatoi da 25 mL VWR | International LLC | 89094-664 | Può sostituire con equivalenti di altri fornitori. |
| Fiale coniche da 50 mL | Thermo Fisher Scientific | 352098 | Può sostituire con equivalenti di altri fornitori. |
| Filtri sottovuoto da 500 mL (0,2 & micro; VWR | International LLC | 156-4020 | |
| micropiastre a 96 pozzetti | USA Scientific | 655900 | |
| Piastre PCR a 96 pozzetti | BioRad | HSP9631 | |
| Agencourt AMPure XP perline | Thermo Fisher Scientific | NC9933872 | Istruzioni per l'uso: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180 &documentName=B37419AA.pdf |
| Foglio di alluminio | Boardwalk | 7124 | Può sostituire con equivalente di altri fornitori. |
| Bilancia analitica con risoluzione di 0,001 g | Ohaus Pioneer | PA323 | Può sostituire con equivalente di altri fornitori. |
| Ultrasuonatore Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) 20 mg/mL | New England Biolabs | B9000S | |
| Centrifuga | Eppendorf | 5811000908 | Include adattatori per secchi per piastre da 50 ml e 96 pozzetti |
| Guanti criogenici | Millipore Sigma | Z183490 | Può sostituire con equivalente di altri fornitori. |
| Kit DNeasy PowerClean (opzionale) | Qiagen Inc. | 12877-50 | In precedenza MoBio |
| DNeasy PowerSoil kit | Qiagen Inc. | 12888-100 | Precedentemente MoBio |
| Ghiaccio secco | Qualsiasi | NA | |
| DynaMag-2 | magnete Thermo Fisher Scientific | 12321D | Non sostituire |
| Etanolo | VWR International LLC | 89125-188 | Può sostituire con equivalente di altri fornitori. |
| Sacchetti per congelatore da galloni | Ziploc | NA | Può sostituire con equivalenti di altri fornitori. |
| Lettori di micropiastre Gemini EM | Dispositivi molecolari | EM | Può utilizzare un altro fluorimetro che legge le piastre a 96 pozzetti dall'alto. |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Camice da laboratorio | Workrite | J1367 | Può sostituire con equivalente di altri fornitori. |
| Liquido N2 | Any | NA | Può sostituire con equivalente di altri fornitori. |
| Liquido N2 dewar | Thermo Fisher Scientific | 4150-9000 | Può sostituire con equivalente di altri fornitori. |
| Sistema di purificazione dell'acqua ultrapura Milli-Q | Millipore Sigma | SYNS0R0WW | |
| Mini-centrifuga | Eppendorf | 5404000014 | |
| Acqua di grado molecolare | Thermo Fisher Scientific | 4387937 | Può sostituire con equivalente di altri fornitori. |
| Mortai | VWR International LLC | 89038-150 | Può sostituire con equivalenti di altri fornitori. |
| Guanti in nitrile | Thermo Fisher Scientific | 19167032B | Può sostituire con equivalenti di altri fornitori. |
| Asciugamani di carta | VWR International LLC | BWK6212 | Può sostituire con equivalenti di altri fornitori. |
| Pellicola sigillante per piastre PCR | Thermo Fisher Scientific | NC9684493 | |
| Provette per strisce PCR | USA Scientific | 1402-2700 | |
| Pestelli | VWR International LLC | 89038-166 | Può sostituire con equivalente di altri fornitori. |
| Spatole in plastica | LevGo, Inc. | 17211 | |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000014 | |
| PNA - cloroplasti e PNA mitocondriali | Bio | NA | Assicurati di verificare la sequenza bioinformaticamente |
| Occhiali protettivi | Millipore Sigma | Z759015 | Può sostituire con equivalenti di altri fornitori. |
| Qubit 3.0 Fluorimetro | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Kit di analisi Qubit dsDNA HS | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Martello di gomma (opzionale) | Ace Hardware | 2258622 | Può sostituire con equivalente di altri fornitori. |
| Cesoie o forbici | VWR International LLC | 89259-936 | Può sostituire con equivalenti di altri fornitori. |
| Pala | Home Depot | 2597400 | Può sostituire con equivalente di altri fornitori. |
| Raccoglitore di carote di terreno (diametro piccolo: < 1 pollice) | Ben Meadows | 221700 | Può sostituire con equivalente di altri fornitori. |
| Flaconi spray | Santa Cruz Biotechnology | sc-395278 | Può sostituire con equivalente di altri fornitori. |
| Primer standard desalinizzati con codice a barre (10 & micro; M) (Tabella 1) | IDT | NA | 4 nmole Ultramer DNA Oligo con desalinizzazione standard. L'adattatore NGS e il primer di sequenziamento (Tabella 1) sono progettati per l'uso con Illumina MiSeq utilizzando la chimica v3. |
| Termociclatore | Thermo Fisher Scientific | E950040015 | Può sostituire con equivalente di altri fornitori. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Può sostituire con equivalente di altri fornitori. |
| Pesare le barche | Spectrum Chemicals | B6001W | Può sostituire con equivalente di altri fornitori. |
Riferimenti
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
- Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic cl....
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Ristampe e permessi
