Method Article

Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere

DOI:

10.3791/57561

⸱

May 2nd, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center, USDA ARS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, descriviamo un protocollo per ottenere i dati di sequenza di amplicon del suolo, rizosfera e radice endosphere microbiomi. Questa informazione può essere utilizzata per studiare la composizione e la diversità delle comunità microbiche pianta-collegato ed è adatta per l'uso con una vasta gamma di specie di piante.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'intima interazione tra pianta ospite e microrganismi associati è cruciale nel determinare la pianta fitness e può favorire una migliore tolleranza agli stress abiotici e malattie. Come il microbioma di pianta può essere molto complesso, a basso costo, metodi di high throughput come amplicon di sequenziamento del gene del rRNA 16S sono spesso preferiti per caratterizzare la composizione microbica e la diversità. Tuttavia, la selezione di una metodologia appropriata quando lo svolgimento di tali esperimenti è fondamentale per ridurre le distorsioni che possono rendere difficile analisi e confronti tra campioni e studi. Questo protocollo descrive in dettaglio una metodologia standardizzata per la raccolta e l'estrazione di DNA da terreno, rizosfera ed esempi di radice. Inoltre, evidenziamo una pipeline di sequenziamento consolidata 16S rRNA amplicone che consente per l'esplorazione della composizione delle comunità batteriche in questi campioni e può essere facilmente adattati per altri geni marcatori. Questa pipeline è stata convalidata per una varietà di specie vegetali, tra cui sorgo, mais, frumento, fragola e agave e può aiutare a superare i problemi associati alla contaminazione da organelli di pianta.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microbiomi pianta-collegato è costituito da comunità microbiche dinamica e complessa, costituita da batteri, archaea, virus, funghi e altri microrganismi eucarioti. Oltre al loro ruolo ben studiata a causa di malattia delle piante, microbi pianta-collegato possono influenzare positivamente anche pianta salute migliorando la tolleranza agli stress biotici e abiotici, promuovendo la disponibilità di nutrienti, e migliorare la crescita delle piante attraverso la produzione di ormoni vegetali. Per questo motivo, particolare interesse esiste nel caratterizzare i taxa che associano con pianta radice endospheres, metodologie e il terreno circostante. Mentre alcuni microbi possono essere coltivate in isolamento il laboratorio multimediale generato, molti non possono, in parte perché essi possono si basano su relazioni simbiotiche con altri microbi, crescono molto lentamente, o richiedono condizioni che non possono essere replicate in un ambiente di laboratorio. Perché aggira la necessità per la coltivazione ed è relativamente poco costoso e ad alta velocità, analisi filogenetica basata su sequenza di campioni microbici ambientali e host-associato è diventata un metodo comodo per analizzante comunità microbica composizione.

La selezione delle tecnologie di sequenziamento appropriati forniti da vari prossima generazione sequenziamento (NGS) piattaforme1 dipende dalla necessità degli utenti, con importanti fattori tra cui: copertura desiderata, lunghezza amplicon, previsto comunità diversità, come pure sequenziamento tasso di errore, la lettura-lunghezza e il costo-per-Esegui/megabase. Un'altra variabile che deve essere considerato in esperimenti di sequenziamento degli ampliconi è quale gene sarà amplificati e verrà utilizzato quale primer. Quando si progetta o scegliendo gli iniettori, i ricercatori spesso sono costretti a fare compromessi tra l'universalità dell'amplificazione e la risoluzione tassonomica ottenibile dagli ampliconi risultanti. Per questo motivo, questi tipi di studi scelto spesso primer e marcatori che mirare selettivamente specifici sottoinsiemi del microbioma. Valutare la composizione delle comunità batteriche avviene comunemente ordinando uno o più delle regioni ipervariabili del batterici 16S rRNA gene2,3. In questo studio, descriviamo un amplicone basato sequenziamento protocollo sviluppato per una piattaforma NGS quella regione di bp V3-V4 obiettivi la 500 del gene del rRNA 16S batterica, che consente ampia amplificazione dei taxa batterici, fornendo inoltre una sufficiente variabilità a distinguere tra diversi taxa. Inoltre, questo protocollo può essere facilmente adattato per l'uso con altri set di primer, come quelli targeting il marcatore ITS2 di funghi o la subunità di rRNA 18S degli eucarioti.

Mentre altri approcci come fucile metagenomica, metatranscriptomics e sequenziamento unicellulare, offrono altri vantaggi tra cui risolti genomi microbici e misura più diretta della funzione di comunità, queste tecniche sono in genere più costoso e computazionalmente intensivi rispetto del profilo filogenetico descritto qui4. Inoltre, eseguendo il fucile metagenomica e metatranscriptomics su campioni di radice produce una grande percentuale di letture appartenendo a genoma della pianta ospite e metodi per superare questa limitazione sono ancora in fase sviluppato5,6.

Come con qualsiasi piattaforma sperimentale, profiling basato su amplicone può introdurre un numero di potenziali pregiudizi che dovrebbe essere considerato durante l'analisi di dati di progettazione e sperimentale. Questi includono i metodi di raccolta dei campioni, DNA estrazione, selezione degli iniettori di PCR e come preparazione di libreria viene eseguita. Diversi metodi possono influenzare notevolmente la quantità di dati utilizzabili generati e possono anche ostacolare gli sforzi per confrontare i risultati tra gli studi. Ad esempio, il metodo di rimozione rizosfera batteri7 e l'uso di tecniche di estrazione diversa o scelta di DNA estrazione Kit8,9 sono stati indicati per avere un impatto significativo dell'analisi a valle, che conduce a conclusioni differenti per quanto riguarda cui i microbi sono presenti e loro abbondanza relativa. Poiché profiling basato su amplicone può essere personalizzato, fare paragoni tra gli studi può essere impegnativo. Il progetto microbioma terra ha suggerito che i ricercatori che studiano i sistemi complessi come il microbioma pianta-collegato trarrebbero beneficio dallo sviluppo di protocolli standardizzati come mezzo per ridurre al minimo la variabilità causata dall'applicazione di metodi differenti tra studi10,11. Qui, discutiamo molti degli argomenti di cui sopra e offrire suggerimenti per quanto riguarda le migliori pratiche dove opportuno.

Il protocollo viene illustrato il processo di raccolta del suolo, rizosfera ed esempi di radice da sorgo bicolore ed estrazione DNA usando una consolidata kit di isolamento del DNA11. Inoltre, il nostro protocollo include un flusso di lavoro sequenziamento degli ampliconi dettagliate, utilizzando una piattaforma NGS comunemente utilizzata, per determinare la struttura delle comunità batteriche12,13,14. Questo protocollo è stato convalidato per l'uso in una vasta gamma di ospiti della pianta in un recente studio pubblicato di radici, rizosfera e associati-terreni di 18 specie di monocot compreso Sorghum bicolor, Zea mays e Triticum aestivum15. Questo metodo è stato convalidato anche per l'utilizzo con altri geni marcatori, come dimostrato dalla sua riuscita applicazione allo studio del gene marcatore ITS2 fungo negli studi del agave microbiome16,17 e fragola microbiome 18.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. raccolta e separazione della radice Endosphere, rizosfera e campioni di terreno

  1. Prima di entrare il campo, autoclave acqua ultrapura (almeno 90 mL di acqua per esempio) per sterilizzare. Preparare epifita rimozione tampone (almeno 25 mL per campione) aggiungendo 6,75 g di KH2PO4, 8,75 g di K2HPO4e 1 mL di Triton X-100, 1 L di acqua sterile. Sterilizzare il buffer utilizzando un filtro a depressione con pori di 0,2 µm.
    1. Per la procedura 1.2 a 1.5, indossare guanti puliti sterilizzati con etanolo a tutte le volte e sostituire i guanti tra ogni campione per evitare la contaminazione. Tutte le apparecchiature con etanolo al 70% di sterilizzare e pulire tutte le attrezzature tra campioni. Prima del campionamento, determinare la profondità di campionamento ottimale per il tuo esperimento ed essere coerente con tutte le collezioni del suolo e radice.
  2. Per raccogliere campioni di suolo bulk, utilizzare un collezionista di nucleo di terreno sterilizzato di etanolo per ottenere del suolo che è privo di radici delle piante attraverso la raccolta di un nucleo circa 23 a 30 cm dalla base della pianta.
  3. Trasferire il terreno a un sacchetto di plastica, omogeneizzare il terreno mediante agitazione delicata e trasferire un'aliquota del campione di terreno (circa 600 mg) per riempire una provetta da 2 mL. Posizionare immediatamente la provetta da 2 mL su ghiaccio secco o flash congelare il tubo liquido N2 fino al momento di procedere con l'estrazione del DNA (passaggio 2).
    1. In alcuni ambienti, il terreno circostante può contenere materiale vegetale. In questo caso, utilizzare un setaccio sterilizzato 2 mm per separare i detriti vegetali dal suolo prima dell'immissione nel sacchetto di plastica.
  4. Per raccogliere la radice e la rizosfera, utilizzare una pala da etanolo-sterilizzato per scavare la pianta, avendo cura di ottenere tanto della radice come possibile. Profondità dipende dalla pianta. Mentre piccole piante come il grano possono essere rimosso da parecchi centimetri di scavo, piante più grandi come il sorgo possono richiedere 30 cm o più. Agitare delicatamente fuori suolo in eccesso dalle radici fino a quando c'è di circa 2 mm di terreno aderendo alla superficie della radice.
    Nota: fare attenzione quando si lavora con le piccole piante, con radici fragili, o in terreni contenuti secco, alta-argilla. Idealmente, dovrebbe esserci solo un sottile strato di suolo restanti sulle radici dopo l'agitazione. Se rimangono grandi aggregati del suolo, un martello di gomma utilizzabile per sloggiare il terreno premendo delicatamente la base delle riprese. Se la quantità di terreno rimanente dopo questo processo superiore o inferiore a 2 mm, lo spessore approssimativo dovrebbe essere notato.
  5. Per impianti di grandi dimensioni, utilizzare forbici sterili e/o cesoie per tagliare una sottosezione rappresentativa delle radici e inserire un minimo di 500 mg di tessuto di radice in un flaconcino di coniche da 50 mL. Per piccole erbe, posizionare l'intero sistema della radice nel flaconcino. Aggiungere sufficiente buffer di rimozione epifite per coprire le radici, quindi immediatamente mettere il campione sul ghiaccio secco o flash congelare il campione a liquido N2.
    Nota: fare attenzione per non riempire eccessivamente il flaconcino da 50 mL conica, come si fanno lavare un passo difficile. Dovrebbe esserci abbastanza spazio vuoto tale che il buffer di epifite è in grado di fluire verso il basso, circondano le radici in tutto il flaconcino e coprire la parte superiore. Perché alcune erbe hanno più biomassa di radice che si adattano in un flaconcino di coniche da 50 mL, una sottosezione delle radici dovrebbe essere raccolti. Tuttavia, dovrebbe essere notato che le radici di taglio potrebbe portare ad batteri endofiti essere lavati fuori nella frazione rizosfera, rompendo così le radici dovrebbe essere minimizzato. Se i campioni non vengono elaborati immediatamente dopo il ritorno al laboratorio, essi possono essere conservati a-80 ° C.
  6. Per separare la rizosfera dalle radici, scongelare il campione di radice sul ghiaccio, quindi sottoporre ad ultrasuoni i campioni di radice a 4 ° C per 10 min con impulsi di 160 W per 30 s, separati da 30 s. trasferimento le radici in un freddo (4 ° C), pulire il tubo da 50 mL utilizzando pinze sterili. Non gettare il tubo originale con buffer e terreno, che è la frazione di rizosfera (Figura 1).
  7. Centrifugare la provetta contenente tampone e rizosfera per 10 min a 4 ° C, 4.000 x g. decantare il supernatante, flash nella provetta contenente la frazione di rizosfera nel liquido N2di congelare e conservare la frazione di rizosfera a-80 ° C fino al momento di procedere con il DNA estrazione (passaggio 2).
  8. Per lavare le radici, aggiungere circa 20 mL di acqua sterile freddo (4 ° C) per la frazione di radice. Lavare la radice agitando vigorosamente (a mano o mixer, per 15-30 s) e poi scolare l'acqua.
  9. Ripetere questo passaggio almeno due volte, fino a quando nessun terreno rimane sulla superficie della radice. Se l'estrazione del DNA (passaggio 2) non viene eseguita immediatamente, avvolgere le radici in un foglio di alluminio sterile, flash congelare le radici in liquido N2e archivio i campioni a-80 ° C fino al pronto a procedere con l'estrazione del DNA.

2. DNA estrazione

Nota: In tutto i passaggi 2 e 3, guanti puliti, sterilizzati con l'etanolo devono essere indossati in ogni momento e tutti i lavori devono essere eseguiti su una superficie sterilizzata con etanolo.

  1. Estrazione del DNA dai campioni del suolo e della rizosfera.
    1. Utilizzare una spatola sterile trasferire velocemente 250 mg del suolo e della rizosfera da passaggi 1.3 e 1.7 nelle provette di raccolta differenziata fornita in un kit di isolamento del DNA commerciale progettato per estrazione dal terreno, quindi procedere con isolamento del DNA utilizzando il kit Fornitore protocollo.
    2. Dopo l'eluizione del DNA nel buffer di eluizione in dotazione con il kit di isolamento del DNA, è possibile conservare il DNA a-20 ° C fino al momento di procedere con il passaggio 3.
  2. Estrazione del DNA dai campioni di radice.
    1. Raffreddare un sterilizzato mortaio e pestello usando liquido N2. Misurare 600 a 700 mg di tessuto di radice e posizionare il tessuto nel mortaio. Aggiungere con cautela, abbastanza liquido N2 per coprire le radici.
    2. Macinare le radici in piccoli pezzi. Continuare il processo di aggiunta di liquido N2 e rettifica (almeno due volte, essere coerenti tra campioni), fino a quando le radici sono una polvere fine. Assicurarsi che il tessuto di radice non scongelare durante questo passaggio.
      Attenzione: Utilizzare appropriati dispositivi di protezione individuale (camice, occhiali protettivi e Guanti criogenici) quando lavorano con liquido N2.
      Nota: Per un'estrazione di DNA di bassa qualità, può essere utile macinare le radici in eccesso in polvere e conservare la polvere a-80 ° C.
    3. Rapidamente, prima della radice polvere inizia a scongelare, utilizzare una spatola sterile per trasferire la polvere di radice nelle provette da 1,5 mL pre-pesati sul ghiaccio. Registrare il peso del tubo e la polvere. In genere, 300-400 mg di polvere viene trasferito.
    4. Utilizzare una spatola sterile per trasferire velocemente 150 mg di polvere di radice verso il tubo di raccolta fornito in un kit di isolamento del DNA commerciale progettato per estrazione dal terreno, quindi procedere con isolamento del DNA usando protocollo del fornitore kit.
      Nota: Per alcuni campioni di radice, ci può essere un'alta concentrazione di sostanze organiche restanti nel pellet di DNA, che impedisce l'amplificazione del DNA durante la PCR, soprattutto quando un diverso protocollo di estrazione del DNA (ad es., estrazione CTAB) viene utilizzato. Se necessario, pulire il DNA seguendo le istruzioni fornite nel kit di pulizia ambientale di DNA.
  3. Misurare la concentrazione di tutti i campioni di DNA usando un fluorometro benchtop ad alta sensibilità.
    1. Aggiungere 1-20 µ l di ciascun campione di DNA eluite in tubi forniti nel kit di test ad alta sensibilità di dsDNA. Aggiungere la soluzione di lavoro del fluorimetro (tintura: buffer di 1: 200) fino a 200 µ l.
    2. Preparare due altre provette contenenti 10 µ l di DNA campione 1 (0 ng / µ l DNA) o 10 µ l di campione 2 (100 ng / µ l) e aggiungere 190 µ l di soluzione di lavoro del fluorimetro ad ogni livello.
    3. Misurare la concentrazione di norme e di ogni campione. Se non viene fatto automaticamente, è possibile calcolare la concentrazione di DNA dall'output di assorbanza di una regressione lineare tra le due norme.

3. presentazione e preparazione amplicone biblioteca

  1. Impostare i materiali per la reazione di amplificazione.
    1. Scongelare i campioni di DNA a 4 ° C e tenerli sul ghiaccio durante il passaggio 3. Randomizzare l'ordine dei campioni di DNA per minimizzare la distorsione a causa della posizione sulla piastra PCR (tabella 2).
    2. In una piastra PCR a 96 pozzetti, diluire DNA da ogni campione in acqua grado molecolare a 5 ng / µ l in un volume totale di 20 µ l. aggiungere 20 µ l acqua di grado molecolare dei pozzetti di quattro angolo come controllo negativo per l'amplificazione (vuote) (tabella 2).
    3. Organizzare gli iniettori con codice a barre (10 µM) in provette per PCR striscia o una piastra a 96 pozzetti, tale che possono essere aggiunti con una pipetta multicanale (Figura 2).
    4. Preparare il mix master sufficiente di PCR per amplificare ogni campione di DNA in triplice copia. Preparare 1,5 µ l di BSA (20 mg/mL), 37,5 µ l di pre-fatte 2 x mix master (composta da tampone di PCR, MgCl2, dNTPs e Taq DNA polimerasi), 0,57 µ l del cloroplasto PNA (100 µM), 0,57 µ l di PNA mitocondriale (100 µM) e 25.86 µ l di acqua di grado molecolare.
    5. Versare il mix master in una sterile 25 mL di serbatoio pipetta multicanale e distribuire 66 µ l di master mix in ciascun pozzetto di una nuova piastra PCR a 96 pozzetti usando una pipetta multicanale.
      Nota: Quando calcolo di volumi di reagente per il mix master, assicurarsi di includere anche 4 pozzetti del bianco per piastra.
    6. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 6 µ l di DNA (dalla piastra di DNA normalizzato) alla piastra di mix master di 5 ng / µ l. Quindi aggiungere il master piatto 1,5 µ l di primer in avanti di 10 µM tale che ogni colonna ha un diverso codice a barre in avanti e 1,5 µ l di 10 µM reverse primer in modo tale che ogni riga ha un codice a barre inverso diverso (Figura 2).
      Nota: Prima di aggiungere gli iniettori, le piastre randomizzati e mix master possono essere utilizzati per amplificare i geni fungini ITS o ITS2 se sono stati aggiunti diversi primer. Se questo è il caso, un simile disegno dell'iniettore può essere utilizzato.
    7. Selezione verso il basso la piastra brevemente a 3.000 x g. utilizzare una pipetta multicanale per mescolare delicatamente, quindi dividere in tre piastre con 25 µ l di miscela di reazione.
      Nota: Anche se tre replicati non sono strettamente necessarie, si riduce l'impatto della variabilità tecnica.
  2. Amplificare il DNA in ogni piastra utilizzando un termociclatore impostare le seguenti condizioni: 180 s a 98 ° C, 30 cicli di: 98 ° C per 45 s (denaturazione), 78 ° C per 10 s (PNA ricottura), 55 ° C per 60 s (ricottura di primer) e 72 ° C per 90 s (estensione) , quindi 600 s a 72 ° C, seguita da una 4 ° C tenere il passo. Dopo l'amplificazione, piscina le tre lastre di replicare in una singola piastra a 96 pozzetti.
  3. Quantificare il DNA utilizzando reagenti fluorometro di alto-sensibilità in un lettore di piastra a 96 pozzetti.
    1. Aggiungere 2 µ l di ciascun prodotto PCR di una micropiastra a 96 pozzetti, insieme a 98 µ l di soluzione di lavoro del fluorimetro (tintura: buffer di 1: 200). Sono 4 pozzi come standard: 5 µ l di DNA campione 1 (0 ng / µ l DNA), 1 µ l di campione 2 (10 ng / µ l), 2 µ l di campione 2 (20 ng / µ l) e 5 µ l di campione 2 (50 ng / µ l). Quindi aggiungere la soluzione di lavoro del fluorimetro per un volume finale di 100 µ l.
      Nota: Ogni campione può essere misurata usando un fluorometro benchtop come descritto al punto 2.3, se un lettore non è disponibile.
    2. Calcolare la concentrazione di DNA dall'output di assorbanza di una regressione lineare dei quattro standard.
    3. Per il codice a barre con successo amplificato prodotti (quelli che hanno una concentrazione maggiore di 15 ng / µ l), piscina di 100 ng di ciascun campione in una provetta di singolo 1,5 mL (tabella 2).
    4. Calcolare il volume medio dei campioni aggiunto al pool utilizzando la funzione =AVERAGE() in un programma di foglio di calcolo. Aggiungere il volume dei prodotti di PCR "in bianco" per il pool di campioni.
      Nota: Poiché i "vuoti" prodotti di PCR hanno loro proprie combinazioni di codice a barre univoco, può essere sequenziate per verificare eventuali contaminanti di laboratorio.
  4. Misurare la concentrazione del prodotto pool utilizzando un fluorometro benchtop come descritto al punto 2.3 e prendere 600 ng di DNA e diluire in acqua di grado molecolare ad un volume finale di 100 µ l in una provetta da 1,5 mL. Conservare il prodotto rimanente in pool a-20 ° C.
  5. Lavare il 600 ng DNA aliquota seguendo il processo di purificazione di PCR stabilito con i branelli di purificazione paramagnetica in un formato a 96 pozzetti con poche eccezioni.
    1. Fare un fresco 600 µ l aliquota di etanolo al 70%. Agitare il flacone di biglie magnetiche per risospendere perline che si depositano sul fondo.
    2. Aggiungere volume x 1 (100 µ l) di soluzione di perlina a parte aliquota 600 ng di DNA. Mescolare accuratamente pipettando 10 volte. Incubare per 5 min a temperatura ambiente.
    3. Collocare la provetta sul supporto magnetico per 2 minuti (o fino a quando la soluzione è limpida) per separare le perle dalla soluzione. Mentre il filmato è ancora nel supporto magnetico, aspirare il supernatante chiaro con attenzione senza toccare i branelli magnetici e scartare il supernatante chiaro.
      Nota: A questo punto, i prodotti di ampliconi sono tenuti a biglie magnetiche. Tutti i branelli che sono disturbato o perso durante l'aspirazione si tradurrà in una perdita di DNA.
    4. Lasciare il tubo nel supporto magnetico e aggiungere 300 µ l di etanolo al 70% per il tubo; Incubare a temperatura ambiente per 30 s. aspirato fuori l'etanolo e scartare. Ripetere questo processo ed eliminare l'etanolo tutti dopo il secondo lavaggio. Togliere il tubo dal supporto magnetico e aria secca per 5 min.
    5. Aggiungere 30 µ l di acqua grado molecolare ai talloni secchi e Miscelare pipettando 10 volte. Incubare a temperatura ambiente per 2 min ritorno il tubo per il supporto magnetico per 1 min per separare le perle dalla soluzione. Trasferire l'eluato ad un nuovo tubo.
      Nota: Biglie magnetiche non influenzerà le reazioni a valle.
  6. Misurare la concentrazione finale di puliti, pool DNA usando un fluorometro benchtop come descritto al punto 2.3. Diluire una parte aliquota di 10 nM in un volume finale di 30 µ l, o alla concentrazione e volume preferito da parte dell'impianto di sequenziamento.
  7. Utilizzare i servizi di una struttura di sequenziamento per sequenziare il DNA su una piattaforma NGS, 2 x 300 sequenziamento accoppiato-fine di bp.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eseguire il protocollo raccomandato dovrebbe comportare un dataset di indicizzata fine accoppiato letture che possono essere abbinati torna a ciascun campione e assegnate a entrambi un batterico unità tassonomica operative (OTU) o variante di sequenza esatta (ESV, noto anche come amplicone variante di sequenza (ASV) e sub-operational unità tassonomica (sOTU)), a seconda dell'analisi a valle. Al fine di ottenere dati di sequenza di alta qualità, si deve prestare attenzione ad ogni passo pe...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo dimostra una pipeline stabilita per esplorare radice endosphere, rizosfera e composizioni di comunità microbica del suolo, dalla campionatura del campo di trattamento del campione e sequenziamento a valle. Studio associato radice microbiomi presenta sfide uniche, dovuto in parte per le difficoltà insite nel campionamento dal suolo. I terreni sono altamente variabile in termini di proprietà fisiche e chimiche, e condizioni del terreno possono essere separate da appena pochi millimetri28...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato finanziato dalla USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS è supportato dal NSF Graduate Research Fellowship Program.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1-10/20 µ L puntali per micropipette filtratiUSA Scientific1120-3810Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.
Provette per microcentrifuga da 1,5 mLUSA Scientific1615-5510Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.
10 µ L pipetta multicanaleEppendorf3122000027Può sostituire con equivalente di altri fornitori.
10 µ L, 100 & micro; L, e 1000 µ L micropipetteEppendorf3120000909Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.
100 µ L pipetta multicanaleEppendorf3122000043Può sostituire con equivalente di altri fornitori.
1000 µ L puntali per micropipette filtratiUSA Scientific1122-1830Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.
Provette per microcentrifuga da 2 mLUSA Scientific1620-2700Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.
Setaccio del suolo da 2 mmSilvicoltura Fornitori60141009Può sostituire con equivalente di altri fornitori.
200 µ L puntali per micropipette filtratiUSA Scientific1120-8810Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.
Serbatoi da 25 mL VWRInternational LLC89094-664Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.
Fiale coniche da 50 mLThermo Fisher Scientific352098Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.
Filtri sottovuoto da 500 mL (0,2 & micro; VWRInternational LLC156-4020
micropiastre a 96 pozzettiUSA Scientific655900
Piastre PCR a 96 pozzettiBioRadHSP9631
Agencourt AMPure XP perlineThermo Fisher ScientificNC9933872Istruzioni per l'uso:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
Foglio di alluminioBoardwalk7124Può sostituire con equivalente di altri fornitori.
Bilancia analitica con risoluzione di 0,001 gOhaus PioneerPA323Può sostituire con equivalente di altri fornitori.
Ultrasuonatore Bioruptor PlusDiagenodeB01020001
Albumina sierica bovina (BSA) 20 mg/mLNew England BiolabsB9000S
CentrifugaEppendorf5811000908Include adattatori per secchi per piastre da 50 ml e 96 pozzetti
Guanti criogeniciMillipore SigmaZ183490Può sostituire con equivalente di altri fornitori.
Kit DNeasy PowerClean (opzionale)Qiagen Inc.12877-50In precedenza MoBio
DNeasy PowerSoil kitQiagen Inc.12888-100Precedentemente MoBio
Ghiaccio seccoQualsiasiNA
DynaMag-2magnete Thermo Fisher Scientific12321DNon sostituire
EtanoloVWR International LLC89125-188Può sostituire con equivalente di altri fornitori.
Sacchetti per congelatore da galloniZiplocNAPuò sostituire con equivalenti di altri fornitori.
Lettori di micropiastre Gemini EMDispositivi molecolariEMPuò utilizzare un altro fluorimetro che legge le piastre a 96 pozzetti dall'alto.
K2HPO4Sigma-AldrichP3786
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
Camice da laboratorioWorkriteJ1367Può sostituire con equivalente di altri fornitori.
Liquido N2AnyNAPuò sostituire con equivalente di altri fornitori.
Liquido N2 dewarThermo Fisher Scientific4150-9000Può sostituire con equivalente di altri fornitori.
Sistema di purificazione dell'acqua ultrapura Milli-QMillipore SigmaSYNS0R0WW
Mini-centrifugaEppendorf5404000014
Acqua di grado molecolareThermo Fisher Scientific4387937Può sostituire con equivalente di altri fornitori.
MortaiVWR International LLC89038-150Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.
Guanti in nitrileThermo Fisher Scientific19167032BPuò sostituire con equivalenti di altri fornitori.
Asciugamani di cartaVWR International LLCBWK6212Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.
Pellicola sigillante per piastre PCRThermo Fisher ScientificNC9684493
Provette per strisce PCRUSA Scientific1402-2700
PestelliVWR International LLC89038-166Può sostituire con equivalente di altri fornitori.
Spatole in plasticaLevGo, Inc.17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)Thermo Fisher Scientific13000014
PNA - cloroplasti e PNA mitocondrialiBioNAAssicurati di verificare la sequenza bioinformaticamente
Occhiali protettiviMillipore SigmaZ759015Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.
Qubit 3.0 FluorimetroThermo Fisher ScientificQ33216
Kit di analisi Qubit dsDNA HSThermo Fisher ScientificQ32854
Martello di gomma (opzionale)Ace Hardware2258622Può sostituire con equivalente di altri fornitori.
Cesoie o forbiciVWR International LLC89259-936Può sostituire con equivalenti di altri fornitori.
PalaHome Depot2597400Può sostituire con equivalente di altri fornitori.
Raccoglitore di carote di terreno (diametro piccolo: < 1 pollice)Ben Meadows221700Può sostituire con equivalente di altri fornitori.
Flaconi spraySanta Cruz Biotechnologysc-395278Può sostituire con equivalente di altri fornitori.
Primer standard desalinizzati con codice a barre (10 & micro; M) (Tabella 1)IDTNA4 nmole Ultramer DNA Oligo con desalinizzazione standard. L'adattatore NGS e il primer di sequenziamento (Tabella 1) sono progettati per l'uso con Illumina MiSeq utilizzando la chimica v3.
TermociclatoreThermo Fisher ScientificE950040015Può sostituire con equivalente di altri fornitori.
Triton X-100Sigma-AldrichX100Può sostituire con equivalente di altri fornitori.
Pesare le barcheSpectrum ChemicalsB6001WPuò sostituire con equivalente di altri fornitori.

References

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