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Articolo metodologico

Trasporto dell'elettrone di miotubi C2C12 Trans-Plasma membrana di misura

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DOI:

10.3791/57565

⸱

4 maggio 2018

 ,  , 
1Department of Biology, Saint Louis University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'obiettivo del presente protocollo è di monitorare spettrofotometricamente trans-plasma membrana elettrone trasporto utilizzando accettori extracellulari e di analizzare le interazioni enzimatiche che possono verificarsi con questi accettori extracellulari.

Abstract

Trans-plasma membrana electron transport (tPMET) svolge un ruolo nella protezione delle cellule dallo stress riduttivo intracellulare così come protezione da danni da ossidanti extracellulari. Questo processo di trasporto di elettroni da riducenti intracellulare agli ossidanti extracellulari non è ben definito. Qui vi presentiamo le analisi spettrofotometriche di miotubi C2C12 per monitorare tPMET utilizzando gli accettori extracellulari: sale di tetrazolio solubile in acqua-1 (WST-1) e 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP o DCIP). Attraverso la riduzione di questi accettori, siamo in grado di monitorare questo processo in un'analisi in tempo reale. Con l'aggiunta di enzimi come la superossido dismutasi (SOD) per l'analisi e l'ascorbato ossidasi (AO), possiamo determinare quale parte del tPMET è a causa della produzione di superossido o esportazione dell'ascorbato, rispettivamente. Mentre WST-1 è stato indicato per produrre risultati stabili con fondo basso, DPIP è stato in grado di essere ri-ossidato dopo l'aggiunta di AO e SOD, che è stata dimostrata con analisi spettrofotometriche. Questo metodo dimostra un'analisi spettrofotometrica in tempo reale, multi-pozzetto e veloce con vantaggi rispetto ad altri metodi utilizzati per il monitoraggio tPMET, come ferricianuro (FeCN) e ferricitocromo c riduzione.

Introduzione

La capacità delle membrane plasmatiche purificate per ridurre accettori ha condotto alla vista che la membrana plasmatica ha un redox intrinseca capacità1. Precedentemente visto in funghi, piante e animali, tPMET è un processo comune a più organismi2,3,4,5. In particolare, questo processo è stato dimostrato in Saccharomyces cerevisiae, cellule di carota, eritrociti, linfociti, osteosarcoma, il melanoma, macrofagi, muscolo scheletrico e neutrofili2,3, 4 , 5 , 6 , 7. in un processo che trasporta gli elettroni attraverso la membrana plasmatica per ridurre extracellulari ossidanti, tPMET è coinvolto in molte funzioni cellulari tra cui: cella crescita5,8, cellula attuabilità9, Ferro da stiro metabolismo10,11,12,13e protezione da ossigeno reattivo specie12,14,15di segnalazione delle cellule. A causa del coinvolgimento di tPMET in molte funzioni cellulari, uno squilibrio di tPMET è stata supposta per contribuire allo sviluppo di alcune condizioni di salute gravi, tra cui cancro16, malattia cardiovascolare17e metabolica la sindrome18.

Ci sono diversi modi per monitorare il trasferimento di elettroni attraverso la membrana plasmatica, ma la tecnica più ampiamente usata è quello di valutare la riduzione di accettori extracellulari attraverso saggi colorimetrici. Accettori extracellulari comunemente utilizzati sono sali di tetrazolio, DPIP e FeCN ferricitocromo c19,20. Il sale di tetrazolio più comunemente usato è un noto sale seconda generazione come WST-119. Questo composto è più facile da utilizzare in saggi colorimetrici rispetto ai sali di tetrazolio di prima generazione a causa di due gruppi solfonato, che aumentano la sua acqua solubilità21. WST-1, in concomitanza con l'intermedio elettrone accettore 1-metossi-fenazina methosulfate (MPM), è ridotto in eventi di due trasferimento singolo elettrone. Questa riduzione cambia la forma ossidata debolmente colorato di WST-1 a un più intenso, giallo formazan20,22. WST-1 ha un coefficiente di estinzione molare alta di 37 x 103 M-1cm-1, portando a un dosaggio ad alta sensibilità21,22. DPIP viene anche utilizzato come un ricettore dell'elettrone extracellulare per monitorare tPMET. È stato dimostrato che DPIP può essere ridotto extracellularly di tPMET senza l'ausilio di intermedi elettroni accettori23,24. A causa della mancanza di accettori intermedi, DPIP può direttamente gli elettroni di pick-up dalla membrana del plasma, a differenza di WST-124. Simile a DPIP, FeCN ha dimostrato di essere ridotto extracellularly a ferrocianuro di tPMET senza l'ausilio di intermedi elettroni accettori19,24. A differenza di WST-1 e DPIP, FeCN ha un coefficiente di estinzione molare basso che conduce a un più basso dosaggio sensibilità9. Un altro accettore di elettroni extracellulare comunemente usate per monitorare tPMET è ferricitocromo c. simile a WST-1, ferricitocromo c riduzione aumenta con l'uso di accettore di elettroni intermedi, mPMS22. A differenza di WST-1 però, il metodo di ferricitocromo c è meno sensibile a causa di un'alta priorità bassa e un coefficiente di estinzione molare basso22.

Qui presentiamo un metodo per l'analisi in tempo reale di tPMET attraverso analisi spettrofotometriche. Il metodo utilizzato l'accettori extracellulari WST-1 e DPIP, dato che entrambi hanno un coefficiente di estinzione molare alta mentre essendo meno costoso rispetto agli altri comunemente usato accettori extracellulari quali ferricitocromo c. Abbiamo utilizzato fenazina methosulfate (PMS) invece di mPMS hanno una composizione chimica simile e PMS è molto meno costoso. mPMS è fotochimicamente stabile che è una caratteristica importante per un kit commerciale che ha bisogno di una lunga shelf life. Tuttavia, facciamo PMS fresco per ogni dosaggio, quindi stabilità non dovrebbe essere un problema. Presentiamo anche un metodo per valutare le possibili interazioni enzimatiche (Vedi Figura 1) tra il ricettore dell'elettrone extracellulare ed enzimi che possono essere utilizzati per caratterizzare ulteriormente il processo di tPMET. In particolare, gli enzimi AO e SOD può essere usato determinano quale parte del tPMET è dovuto al trasporto dell'ascorbato o rilascio extracellulare del superossido, due metodi comuni per gli elettroni essere trasportato attraverso la membrana plasmatica.

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Protocollo

Nota: Vedere la Figura 1 per una descrizione schematica di passaggi chiave.

1. analisi di riduzione WST-1

  1. Crescere e differenziare cellule aderenti C2C12 con cella standard cultura procedure7 in una piastra a 96 pozzetti utilizzando righe A-F.
    1. Usare un mezzo di differenziazione consistente dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) completati con 2% di siero equino, 100 U/mL di penicillina e 0,1 mg/mL di streptomicina. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% CO2.
    2. Durante il monitoraggio di coinvolgimento di ascorbato in tPMET, supplemento media di differenziazione con l'acido ascorbico 100 µM. Consentire alle cellule di Incubare in media di differenziazione per ~ 24-48 h.
  2. Preparare soluzioni «stock» WST-1 e PMS.
    1. Per rendere uno stock di 10 mM di WST-1, sciogliere 0,033 g di WST-1 (Formula peso (FW): 651.34 g/mol) in 5 mL di fosfato tampone salino (PBS). Conservare a 4 ° C.
    2. Per rendere una scorta di 5 mM di PMS, sciogliere 0,0023 g di PMS (FW: 306.34 g/mol) in 1,5 mL di deionizzata H2O (diH2O). Conservare a-20 ° C e proteggere dalla luce.
  3. Aggiungi 0,0108 g di glucosio per soluzione salina tamponata con una concentrazione finale di 5 mM a 11,4 mL di PBS o HEPES (HBS; sale di sodio di 20 mM HEPES, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM MgSO4, 1mm CaCl2). µ L 480 di 10mm WST-1 per una concentrazione finale di 400 µM e 48 µ l di 5mm PMS per una concentrazione finale di 20 µM.
  4. Durante il monitoraggio di coinvolgimento di ascorbato in tPMET, è possibile dividere la soluzione in due aliquote di 6 mL. Ad un'aliquota, aggiungere 6 µ l di diH2O e l'altra aliquota aggiungere 6 µ l di AO 2 kU/mL per una concentrazione finale di 2 U/mL.
  5. Durante il monitoraggio di coinvolgimento di superossido in tPMET, è possibile dividere la soluzione in due aliquote di 6 mL. Ad un'aliquota, 55 µ l di tampone di4 KPO 0.1 M e l'altra aliquota aggiungere 55 µ l di SOD 6.5 kU/mL per una concentrazione finale di 60 U/mL.
  6. Lavare le cellule con PBS. Aspirare i media e aggiungere 150 µ l PBS. Poi aspirare il PBS.
    Nota: Il test è fatto con cellule placcate, allegate. Così, non esiste nessuna centrifugazione o uso della tripsina nel processo di lavaggio.
  7. Aggiungere 100 µ l di soluzione WST-1 (-) SOD o (-) AO a colonne 1-6 e aggiungere 100 µ l di soluzione WST-1 (+) SOD o (+) AO a colonne 7-12 la piastra a 96 pozzetti. Utilizzare righe G e H come sfondo controlli (vale a dire, per monitorare il cambiamento di assorbanza nel reagente solo nei pozzi senza cellule).
  8. Misurare i valori di assorbanza utilizzando lo spettrofotometro ogni 10 min per 1 h a 438 nm.
  9. Dopo la lettura, i media di aspirare e lavare ogni bene con 150 µ l di PBS. Poi aspirare il PBS.
  10. Calcolare la variazione di assorbanza di ciascun pozzetto sottraendo l'assorbanza iniziale per un pozzo dall'assorbanza in qualsiasi momento per bene. Correggere questo cambiamento per la variazione di assorbanza (se qualsiasi) osservata nei pozzetti sfondo (cioè, pozzetti con soluzione di saggio ma nessun cellule).
  11. Per l'analisi, normalizzare i dati di assorbanza per la misurazione di controllo 60 min o lavare i pozzetti con PBS o HBS e quindi eseguire un'analisi della proteina di bicinconinico acida (BCA).
  12. Aggiungere standard di albumina di siero bovino (BSA) 2 mg/mL (intervallo da 0,5-2 µ l per la curva standard, a seconda del grado di confluenza delle cellule) ai pozzetti vuoti (righe G e H), quindi aggiungere il reagente BCA in tutti i pozzetti.
  13. Quantificare i dati via nmol di WST-1 riduzione per µ g di proteina. Utilizzare 37 mM-1 cm-1 22 come il coefficiente di estinzione per ridotta WST-1 a 438 nm.

2. analisi di riduzione DPIP

  1. Crescere e differenziare le cellule aderenti C2C12 con la stessa procedura come passo 1.1.
  2. Preparare soluzione DPIP stock 10 mM come segue. Sciogliere 0,029 g di DPIP (FW: 290.08 g/mol) in 10 mL di diH2O. Confirm la concentrazione di DPIP misurando l'assorbanza a 600 nm con uno spettrofotometro. Utilizzare 1 mM-1 cm-1 23 come il coefficiente di estinzione per DPIP ridotta a 600 nm. Conservare a 4 ° C.
  3. Aggiungere 0,0108 g di glucosio 11,880 mL di PBS per una concentrazione finale di 5 mM. Aggiungere 120 µ l di 10 mM DPIP per una concentrazione finale di 100 µM.
  4. Durante il monitoraggio di coinvolgimento di ascorbato in tPMET, è possibile dividere la soluzione in due aliquote di 6 mL. Ad un'aliquota, aggiungere 6 µ l di diH2O e l'altra aliquota aggiungere 6 µ l di AO 2 kU/mL per una concentrazione finale di 2 U/mL.
  5. Durante il monitoraggio di coinvolgimento di superossido in tPMET, è possibile dividere la soluzione in due aliquote di 6 mL. Ad un'aliquota, 55 µ l di tampone di4 KPO 0.1 M e l'altra aliquota aggiungere 55 µ l di SOD 6.5 kU/mL per una concentrazione finale di 60 U/mL.
  6. I media di aspirare e lavare le cellule in 150 µ l di PBS. Aspirare il PBS e aggiungere 100 µ l di soluzione di DPIP (-) SOD o (-) AO a colonne 1-6 e aggiungere 100 µ l di soluzione DPIP (+) SOD o (+) AO a colonne 7-12 la piastra a 96 pozzetti. Utilizzare righe G e H volontà come sfondo controlli (vale a dire, per monitorare il cambiamento di assorbanza nel reagente solo nei pozzi senza cellule).
  7. Misurare l'assorbanza a 600 nm mediante spettrofotometro ogni 10 min per 1 h. quantificare la variazione di assorbanza relativo al controllo al min 60 simile procedura 1,9-1.13.

3. determinazione di se ridotta accettori sono substrati per AO o SOD

  1. 5,436 mL di PBS o HBS, aggiungere 240 µ l di 10 mM WST-1 per una concentrazione finale di 400 µM e 24 µ l di 5mm PMS per una concentrazione finale di 20 µM.
    1. Per DPIP, aggiungere 60 µ l di 10 mM DPIP, per una concentrazione finale di 100 µM, a 5,940 mL di PBS o HBS.
  2. Aggiungere 100 µ l di soluzione di ogni bene in una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto in assenza di cellule e misurare l'assorbanza a uno spettrofotometro a 438 nm, per WST-1, o 600 nm, per DPIP.
  3. Aggiungere 1 µ l di ascorbato di 10 mM per la metà dei pozzi per una concentrazione finale di 100 μM. Monitorare l'assorbanza finché non si stabilizza.
  4. Al momento di stabilizzazione, aggiungere 1 µ l di 200 U/mL AO per una concentrazione finale di 2 U/mL ad ogni pozzetto o aggiungere 1 µ l di 6 kU/mL SOD per una concentrazione finale di 60 U/mL a ciascun bene e monitorare l'assorbanza per 1 h.

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Risultati

Le statistiche sono state effettuate con ANOVA con misure ripetute utilizzando RStudio software statistico25. Dimensioni del campione sono indicate nelle leggende figura.

Per monitorare tPMET, miotubi C2C12 sono stati utilizzati insieme accettori extracellulari, WST-1 e DPIP. AO è stato usato per determinare quale parte del WST-1 e DPIP riduzione era a causa del deflusso dell'ascorbato e SOD è stato utili...

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Discussione

Abbiamo presentato due metodi per utilizzare extracellulare accettori, WST-1 e DPIP, nelle analisi spettrofotometriche per monitorare tPMET in miotubi C2C12. Con la crescita di linee cellulari nelle procedure standard di cultura e di un lettore di piastra spettrofotometro, è possibile monitorare tPMET con questi accettori in un'analisi semplice micropiastra. WST-1 riduzione è riproducibile dal pozzetto a altro all'interno di un test, ma non c'è variabilità giorno per giorno. Il quotidiano coefficiente di variazione (CV) ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino e Neej Patel per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal premio United States Public Health Service R15DK102122 dall'Istituto nazionale di diabete e digestivo e malattie renali (NIDDK) a Jonathan Fisher. Il contenuto del manoscritto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale il NIDDK o il National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Collezione di colture di tipo americanodei mioblasti C2C12CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucoseSigmaD6046
Fetal Plex animal serum complexGemini Bio-Products 100-602
penicillina-streptomicinaSigma516106
siero di cavalloGibco Technologies16050-130
Soluzione salina tamponata con fosfato di DulbeccoSigmaD8537
tripsina-EDTASigmaT4049
Piastre di coltura da 15 cmTPP93150
Piastre di coltura a 96 pozzettiTPP92096
2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disolfofenil)-2H-tetrazolio sale sodico (WST-1)Accela ChemBio  IncSY016315
fenazina metosolfato SigmaP9625
acido L-ascorbicoSigmaA5960
ascorbato ossidasi SigmaA0157
superossido dismutasi SigmaS5395
Sale sodico di 2,6-dicloroindofenolo ICN Biomedicals215011825
D-(+)-glucosioSigmaG7528
HEPES sale sodicoSigmaH3784
cloruro di sodioSigmaS7653
cloruro di potassioFisher ScientificBP366
solfato di magnesio eptaidratoSigmaM5921
cloruro di calcio diidratoSigmaC7902
fosfato di potassioFisher ScientificBP363
Kit per il dosaggio delle proteine BCA PierceThermo Scientific23225
Spettrofotometro Powerwave X-IBiotek Istitumentsfuori produzione
Spettrofotometro Spectronic Genesys 5Thermo Scientific336001
Micropiastra a 96 pozzetti PureGrade, fondo F, trasparente, non trattata, non sterileMidSci781602
cloruro tetraidratoSigma220299
solfato di ferro (II) eptaidratoSigma215422
ipoxantinaSigmaH9636
xantina ossidasiSigmaX4500
ExcelMicrosoft
R StudioRstudiohttps://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4Biotek Insturmentsfuori produzione 

Riferimenti

  1. Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
  2. Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
  3. Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
  4. Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
  5. Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
  6. Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
  7. Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89(2017).
  8. Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
  9. Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
  10. Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).
  11. Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
  12. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
  13. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
  14. Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234 (0), 79-81 (1997).
  15. Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
  16. Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
  17. Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
  18. Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
  19. Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
  20. Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
  21. Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
  22. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  23. Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
  24. Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
  25. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2013).
  26. Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
  27. Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
  28. Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
  29. Dayan, J., Dawson, C. R. Substrate specificity of ascorbate oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).
  30. Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
  31. Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
  32. Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
  33. Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
  34. Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
  35. Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
  36. Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
  37. Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).

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