Qui, descriviamo un protocollo per una microdissezione laser riproducibile (LCM) per isolare il trabecolato (TM) per analisi di RNA a valle. La capacità di analizzare i cambiamenti nell'espressione genica nella TM vi aiuterà a comprendere i meccanismi molecolari delle malattie oculari correlate a TM.
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Articolo metodologico
Microdissezione laser di elevata purezza trabecolato dai Mouse occhi per analisi dell'espressione genica
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Microdissezione laser (LCM) ha consentito di analisi dell'espressione genica di cellule singole e arricchita di popolazioni cellulari in sezioni di tessuto. LCM è un ottimo strumento per lo studio dei meccanismi molecolari alla base della differenziazione delle cellule e lo sviluppo e la progressione di varie malattie, compreso il glaucoma. Glaucoma, che comprende una famiglia di neuropatie ottiche progressive, è la più comune causa di cecità irreversibile in tutto il mondo. Cambiamenti strutturali e danno all'interno il trabecolato (TM) può causare aumento della pressione intraoculare (IOP), che è un fattore di rischio importante per lo sviluppo di glaucoma. Tuttavia, i precisi meccanismi molecolari coinvolti sono capiti ancora male. La possibilità di eseguire analisi di espressione genica sarà cruciale per ottenere ulteriori approfondimenti la funzione di queste cellule e il suo ruolo nella regolazione dello sviluppo dello IOP ed il glaucoma. Per raggiungere questo obiettivo, un metodo riproducibile per isolare altamente arricchito TM da sezioni congelate del mouse occhi e un metodo per l'analisi dell'espressione genica a valle, come RT-qPCR e RNA-Seq è necessario. Il metodo descritto nel presente documento è stato sviluppato per isolare altamente puro TM dagli occhi del mouse per PCR digitale a valle e l'analisi di microarray. Inoltre, questa tecnica può essere facilmente adattata per l'isolamento di altre cellule oculari altamente arricchite e compartimenti cellulari che sono stati difficili da isolare dagli occhi del mouse. La combinazione di analisi LCM e RNA può contribuire a una comprensione più completa degli eventi cellulari alla base di glaucoma.
Introduzione
Il glaucoma è un gruppo di malattie caratterizzate da neuropatia ottica e retinopatia che infine conduce a cecità irreversibile1,2. Si stima che entro il 2020 oltre 70 milioni di persone in tutto il mondo vivrà con qualche forma di malattia3,4,5,6,7. Glaucoma ad angolo aperto primario (POAG), il più diffuso tipo di glaucoma, è caratterizzato da una diminuzione nel deflusso di umore acqueo (AH) che conduce all'aumento della pressione intraoculare (IO....
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Protocollo
Il National Institute di Environmental Health Sciences (NIEHS) Animal Care e utilizzo Comitato (ACUC) ha approvato tutte le metodologia di questo studio sotto il NIEHS animale studiare proposta IIDL 05-46.
1. ottimale dei tessuti insieme per microdissezione Laser
- Ottenere 2 ai topi di 3 mesi, maschio o femmina C57BL/6. Eutanasia con CO2 per un minimo di 1 min o fino a quando la respirazione è cessato. Rimuovere l'animale dalla gabbia e assicurare la morte da dislocazione cervicale, decapitazione o toracotomia.
- Prima della dissezione, garantire che tutti gli strumenti di dissezione sono puliti e sterilizzati.
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Risultati
LCM raccolti RNA dalla TM e corpo ciliare da 4 diversi topi è stato isolato al fine di essere in grado di analizzare l'espressione genica e confrontare l'espressione con cui in occhio intero, sclera, iride, retina, cornea e lente isolati da tre topi separati. TM che esprimono i geni, MYOC48 e ACTA249 sono stati analizzati in tutti i tessuti raccolti per confermare che i campioni di TM isolati infatti altamente sono stati ar.......
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Discussione
Il TM svolge un ruolo vitale nel mantenere attivamente omeostatico IOP e sua disfunzione è ampiamente accettata come il principale fattore causativo per ipertesi glaucoma1,2,19. Un numero di polimorfismi a singolo nucleotide in diversi geni identificati dall'analisi di GWAS è stato collegato al rischio del glaucoma aumentato e la resistenza aumentata alla funzione di uscita AH presso il TM; Tuttavia, i meccanismi molecolari prec.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Primer ACTA2 ddPCR (dMmuCPE5117282) | BioRad | 10031252 | FAM |
| Agilent 2100 Bioanalizzatore | Agilent Technologies | G2946-90004 | |
| Kit Agilent RNA 6000 Pico | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| BioRad QX200 Sistema PCR digitale a goccia | BioRad | ||
| Pennello | |||
| piccoloVetrino per microscopio in vetro caricato | Thermo scientific | 4951PLUS-001 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| Forbici | |||
| Eosin Y | dye Thermo scientific | 71204 | |
| Pinza | |||
| HemaCen | American MasterTech | STHEM30 | |
| Kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacità | Biosystems applicati | 4368814 | |
| Hsp90a ddPCR Primer (dMmuCPE5097465) | BioRad | 10031255 | VEX |
| Leica CM1850 Cryostat | Leica | ||
| Millex-GS Unità filtrante | EMD Millipore | SLGS033SB | 0,22 e micro; m |
| MMI CellCut UV Cutting Model | Macchine molecolari & Industrie: | Strumenti LCM, | |
| Software MMI CellTools | Macchine molecolari e Industries | 50202 | Software LCM |
| Tubo campione per la microdissezione a cattura laser | Prodotti ASEE | ST-LMD-M-500 | Tubo con tappo di isolamento/Prodotto da Microdissect GmBH in Germania e distribuito da ASEE Prodotti |
| Tubo campione per la cattura laser Microdissezione (alternativa) | Macchine molecolari e Industrie | ||
| modificate Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 7211 | FAM |
| MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) | BioRad | 10031252 | |
| PBS | |||
| Memebrane Slides, RNase Free | ASEE Prodotti | FS-LMD-M-50r | Membrana in polietilene tereftalato (PET)/Prodotto da Microdissect GmBH in Germania e distribuito da ASEE Prodotti |
| Vetrini per memebrane, senza RNasi (alternative) | Macchine molecolari e Industries | 50102 | |
| Rapid Fix | Thermo scientifico | 6764212 | H& Colorazione E Tampone |
| RLT | Qiagen | 79216 | bufffer di lisi utilizzato per campioni LCM |
| RNAseZap | Sigma | R2020 | Soluzione di decontaminazione dell'RNasi Protect RNA RNAsi |
| Inhibitor | Sigma Aldrich | R7397 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Kit di isolamento dell'RNA |
| SMART-Seq v4 Kit di RNA a bassissimo input | Takara Clontech | Kit 634888 | da RNA a cDNA a basso input per campioni LCM |
| SuperMix (senza dUTP) | BioRad | 1863023 | PCR digitale master mix |
| Tissue-Tek Cryomold (25 mm x 20 mm x 5 mm) | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Stratalinker UV Crosslinker | Stratagene | 400075 | |
| Xilene | Macron | 8668 |
Riferimenti
- Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
- Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
- Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D.
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Ristampe e permessi
