Due metodi per decellularizzazione di tessuti vegetali per applicazioni di ingegneria del tessuto

Summary

Qui vi presentiamo, e contrasto due protocolli utilizzati per decellularize tessuti vegetali: un approccio basato su detergente e un approccio privo di detersivo. Entrambi i metodi si lasciano alle spalle la matrice extracellulare dei tessuti vegetali utilizzati, che quindi può essere utilizzata come scaffold per applicazioni di ingegneria dei tessuti.

Abstract

Gli innesti autologhi, sintetici e derivati animali attualmente utilizzati come scaffold per la sostituzione del tessuto hanno limitazioni a causa della scarsa disponibilità, scarsa biocompatibilità e costo. Tessuti vegetali hanno caratteristiche favorevoli che li rendono particolarmente adatti per utilizzare come scaffold, quali elevata area superficiale, trasporto d'acqua eccellente e ritenzione, porosità interconnesse, preesistenti reti vascolari e una vasta gamma di meccanica Proprietà. Due metodi di successo di decellularizzazione pianta per applicazioni di ingegneria del tessuto sono descritti qui. Il primo metodo si basa sui bagni detergenti per rimuovere la materia cellulare, che è simile ai metodi stabiliti in precedenza utilizzati per cancellare tessuti di mammiferi. Il secondo è un metodo privo di detersivo, adattato da un protocollo che isola il sistema vascolare foglia e prevede l'utilizzo di una candeggina riscaldata e il bagno di sale per eliminare le foglie e steli. Entrambi i metodi portano a impalcature con proprietà meccaniche comparabili e basso impatto metabolico cellulare, permettendo così all'utente di selezionare il protocollo che meglio si adatta alle loro applicazione prevista.

Introduction

Ingegneria tissutale è emerso nel 1980 per creare tessuto vivente sostituti e, potenzialmente, indirizzo significativo dell'organo e del tessuto carenze¹. Una strategia è utilizzato Ponteggi per stimolare e guidare il corpo per rigenerare tessuti o organi mancante. Anche se avanzato fabbricazione approcci quali stampa 3-d hanno prodotto ponteggi con proprietà fisiche uniche, la capacità di produrre impalcature con una vasta gamma di proprietà fisiche e biologiche realizzabili rimane una sfida^{2 , 3}. Inoltre, a causa di una mancanza di una rete vascolare funzionale, queste tecniche sono state limitate a rigenerare tessuti 3-dimensionale. L'uso di decellularizzazione tessuti animali ed umani come scaffold ha aiutato a eludere questo problema^4,5,6,7. Tuttavia, costo elevato, lotto variabilità e disponibilità limitata può limitare l'uso molto diffuso di decellularizzazione animale ponteggi⁸. Ci sono inoltre preoccupazioni circa la potenziale trasmissione di malattie ai pazienti e reazione immunologica per alcuni tessuti di mammiferi decellularizzati⁹.

Cellulosa, derivata dalla pianta e fonti batteriche, è stato ampiamente utilizzato per generare biomateriali per una vasta gamma di applicazioni nella medicina rigenerativa. Alcuni esempi includono: osso^10,11, cartilagine^12,13,14 e¹⁵di guarigione della ferita. Impalcature che sono composti di cellulosa hanno un ulteriore vantaggio, in quanto sono durevoli e resistenti per essere ripartiti dalle cellule di mammiferi. Questo è dovuto al fatto che le cellule di mammiferi non producono gli enzimi necessari per abbattere le molecole di cellulosa. In confronto, scaffolds impiegando macromolecole della matrice extracellulare, come il collagene, sono prontamente ripartiti¹⁶ e potrebbero non essere idonei per applicazioni a lungo termine. Scaffold di collagene può essere stabilizzata tramite cross-linking chimico. Tuttavia, esiste un compromesso a causa della tossicità intrinseca dei linkers che influenzano la biocompatibilità delle impalcature¹⁷. Al contrario, cellulosa ha il potenziale per rimanere presenti presso il sito dell'impianto per periodi prolungati di tempo perché è impermeabile alla degradazione enzimatica di cellule di mammifero^18,19,20. Questo può essere modificato regolando la velocità di degradazione attraverso il pretrattamento idrolisi e co-consegna di impalcature con cellulasi²¹. La biocompatibilità di cellulosa pianta-derivati decellularizzati impalcature in vivo è stata dimostrata anche in uno studio condotto su topi²².

Attraverso centinaia di milioni di anni di evoluzione, piante hanno perfezionato la loro struttura e composizione per aumentare l'efficienza di trasporto di fluidi e di ritenzione. Pianta vascolare vasi minimizza la resistenza idraulica di ramificazione in vasi più piccoli, simili al sistema vascolare dei mammiferi secondo legge^{23 di Murray}. Dopo decellularizzazione, complessa rete dell'impianto di vasi e pori interconnessi è mantenuto. Considerando il vasto numero di specie di piante distinte prontamente disponibili, impalcature pianta-derivati hanno il potenziale per superare i limiti di progettazione attualmente interessano impalcature in tessuto ingegneria^24,25. Per esempio, Modulevsky et al hanno dimostrato che l'angiogenesi e migrazione cellulare si è verificato quando apple decellularizzati tessuto è stato impiantato sottocute sul retro di un mouse²². Allo stesso modo, Gershlak et al ha mostrato che le cellule endoteliali possono essere coltivate all'interno del vasculature di decellularizzazione foglie²⁴. In un esperimento separato, Gershlak et al sono stati anche in grado di mostrare che cardiomiociti potevano essere coltivati sulla superficie delle foglie e sono stati in grado di contrarre²⁴.

Piante includono anche organizzazione complessa da cellulare alla scala macroscopica, che è difficile da raggiungere anche con le più avanzate tecniche di produzione sviluppate fino ad oggi. Il complesso disegno gerarchico dei tessuti vegetali li rende più forti rispetto alla somma dei loro costituenti²⁶. Piante possiedono una pletora di diverse proprietà meccaniche che vanno dai componenti rigidi e duri come steli, a quelli molto più flessibile e duttile come foglie²⁷. Foglie variano a seconda della specie in termini di dimensioni, forma, rompono la resistenza, il grado di vascolarizzazione e possono portare a diversi gradi di idrofilia. Nel complesso, queste proprietà pianta suggeriscono che piante decellularizzati possono servire come dispositivi medici unici e altamente funzionali, tra cui come impalcature di ingegneria tissutale.

Questo protocollo si concentra su due metodi per decellularize tessuti vegetali, come foglie e steli, per uso come impalcature in ingegneria tissutale. Il primo metodo è una detergente a base di tecnica che utilizza una serie di bagni per rimuovere il DNA e materia cellulare, che è stato adattato da una tecnica ampiamente utilizzata per decellularize dei mammiferi e vegetali tessuti^{6,22,25 ,28,29,30}. Il secondo metodo è privo di detersivo ed è adattato da un protocollo di "scheletrizzazione" generalmente utilizzato per rimuovere i tessuti molli delle foglie³¹. Lavoro precedente ha mostrato che simmering foglie in una soluzione di candeggina e bicarbonato di sodio ha facilitato la separazione del vasculature dai tessuti molli circostanti³¹. Questa tecnica può essere citata torna a esperimenti svolti in 17^th e 18 secoli del^th , come il lavoro di Albertus Seba³² ed Edward Parrish³³. Questi esperimenti centrati intorno lasciando la materia vegetale, come foglie e frutta, immersa nell'acqua per lunghi periodi di tempo (settimane o mesi) e permettendo i tessuti più morbidi a distanza decadere naturalmente. Qui l'approccio di "scheletrizzazione" è adattato per utilizzare condizioni più miti, come ad esempio i tempi di incubazione più lunghi a temperature più basse, per rimuovere i residui cellulari e per evitare di alterare significativamente la struttura dei tessuti molli. Per gli esperimenti dettagliati nel presente documento, sono stati utilizzati tre tipi di pianta: Ficus hispida, Pachira aquatica e una specie di Garcinia. Risultati di quantificazione del DNA, prove meccaniche e impatto sull'attività metabolica cellulare da entrambi i metodi sono descritti.

Protocol

1. decellularizzazione di tessuto vegetale utilizzando l'approccio basato su detergente

1. Utilizzare fresche o congelate F. hispida, campioni di foglia. Congelare i campioni freschi inutilizzati in un congelatore a-20 ° C e conservare per uso futuro (fino ad un anno).
   Nota: Uso di staminali o foglia di quasi qualsiasi impianto desiderato. Tempi di conservazione prolungati possono causare danni ai tessuti.
   1. Determinare la dimensione e la forma dei campioni da elaborare sulla base della destinazione d'uso del campione (cioè campioni tagliati a strisce sono adatti per applicazioni di test meccaniche, nel frattempo 8 mm disco campioni sono utili nelle applicazioni multi-pozzetto di coltura ). Tagliare la foglia in dischi di 8 mm con una biopsia nette pugno mentre sommersa sotto temperatura ambiente (20-25 ° C) deionizzata H₂O.
      Nota: Questo protocollo può essere usato su steli e foglie intere. Tuttavia, i campioni più piccoli saranno decellularize più velocemente.
   2. Incubare i campioni per 5-10 min a temperatura ambiente (20-25 ° C) deionizzata H₂O su un frullato settato a un'impostazione bassa velocità per lavare e/o scioglierli. Utilizzare abbastanza deionizzata H₂O affinché che tutti i campioni sono completamente bagnati.
2. Preparare una soluzione di 10% (p/v) sodio dodecil solfato (SDS) in deionizzata H₂O. posto i campioni in un contenitore adatto (un vetro o plastica piatto è l'ideale) e aggiungere la soluzione di SDS per coprire completamente i campioni. Incubare i campioni per 5 giorni a temperatura ambiente (20-25 ° C) su un shake piastra insieme ad una bassa velocità per evitare di danneggiare i campioni.
   Nota: Non sovraffollamento del contenitore, poiché ciò può rallentare il processo di decellularizzazione e condurre al trattamento irregolare di SDS. Durante questo passaggio, campioni dovrebbero acquisire una tonalità marrone.
   1. Dopo 5 giorni, sostituire la soluzione di SDS con deionizzata H₂O. Incubare i campioni per altri 10-15 min sulla piastra di agitare a risciacquare accuratamente qualsiasi soluzione residua di SDS.
3. Preparare un tensioattivo non ionico di 1% (v/v) in soluzione di candeggina al 10% (v/v). Per fare una soluzione di 500 mL, mescolare 5 mL del tensioattivo non ionico con 50 mL di candeggina poi aggiungere 445 mL di deionizzata H₂O. Submerge campioni in soluzione appena preparata.
   Nota: La soluzione di tensioattivo non ionico/candeggina non ha una lunga shelf life, pertanto, deve essere utilizzato entro 48 ore di preparazione.
4. Sostituire la soluzione di tensioattivo non ionico/candeggina ogni 24 ore fino a quando i campioni sono completamente cancellati (vedere Figura 1A per un confronto visivo). Incubare il campione in acqua deionizzata su una zolla di agitare per 2 min per risciacquare la soluzione in eccesso tensioattivo non ionico/candeggina. Mettere la piastra di agitare a un'impostazione bassa per evitare di danneggiare i campioni.
   Nota: Il tempo necessario per cancellare i campioni utilizzati varia, a seconda del tipo e specie della pianta. La decolorazione completa dei campioni è indicativo di decellularizzazione completo (eseguire la quantificazione del DNA per garantire completa compensazione).
   1. Lyophilize i campioni per conservarli fino a un anno (congelamento con azoto liquido flash è comodo, congelare i campioni a-80 ° C è anche accettabile) e conservarle a temperatura ambiente (20-25 ° C) a bassa umidità.
   2. Ricostituire i campioni in Tris-HCl (10 mM, pH 8.5) utilizza abbastanza ai campioni di cappotto. Sciacquare i campioni 2 - 3 volte in media senza siero delicatamente con una micropipetta prima dell'uso (cioè uso 150-300 µ l per risciacquo, in una piastra ben 24 standard).
      Nota: Tampone Tris-HCl e terreni privi di siero (cioè DMEM, ma qualsiasi cellula fondamentale cultura media può essere sostituito) sono più efficaci nel ridurre l'impatto di attuabilità delle cellule di trattamento con SDS campioni rispetto a quelli trattati con deionizzata H₂O da soli.

2. preparazione dei campioni utilizzando l'approccio di decellularizzazione senza detersivo

Nota: I primi passi di questa procedura coincidono con passaggi 1.1-1.1.2 (Vedi sopra).

1. Preparare una soluzione di sodio bicarbonato (NaHCO₃) di 3% (p/v) e candeggiante al 5% (v/v) (NaClO). Riscaldare la soluzione in una cappa a 60-70 ° C per i campioni di foglia F. hispida tagliato in dischi di 8 mm mentre si mescolano su un piatto caldo.
   Nota: Il bicarbonato di sodio può essere sostituito con carbonato di sodio (Na₂CO₃) o idrossido di sodio (NaOH). La temperatura varia notevolmente (da temperatura ambiente a 90 ° C) e deve essere regolata secondo le proprietà dei campioni utilizzati.
2. Una volta che la soluzione non raggiunge la temperatura desiderata, immergere i campioni e ridurre la velocità di agitazione per evitare di danneggiarli. Dopo i campioni vengono visibilmente cancellati (vedere Figura 1B per un confronto visivo), rimuovere con cautela dal bagno. Incubare i campioni una volta nel deionizzata di H₂O per 1-2 min rimuovere la soluzione di candeggina in eccesso.
   Nota: Il tempo necessario per cancellare i campioni possa variare ampiamente. Ad esempio, prezzemolo tagliato può essere cancellato in 10-15 minuti, mentre più spessi e/o più grandi campioni come intero foglie o steli possono richiedere ore nei bagni ad alta temperatura per cancellare completamente.
3. Lyophilize i campioni e conservarle a temperatura ambiente (20-25 ° C) a bassa umidità.

Results

Entrambi i metodi hanno reso impalcature adatte alla coltura cellulare e applicazioni di ingegneria tissutale. La figura 1 Mostra il flusso di lavoro generale del processo di decellularizzazione utilizzando una foglia intatta per il metodo basato su detergente e tagliati campioni (8 mm di diametro) per il metodo privo di detersivo. Successo decellularizzazione di Ficus hispida tessuti dopo entrambi i metodi hanno reso chiari e intatti campioni (

Discussion

Qui, vengono descritti due metodi per decellularize tessuti vegetali. I risultati presentati qui, accoppiato con i risultati di studi precedenti²⁵, suggeriscono che i protocolli messi avanti siano probabili applicabile ad un ampio spettro di specie vegetali e può essere eseguita su entrambi i gambi e foglie. Queste procedure sono semplici e non richiedono attrezzature specializzate, quindi pianta decellularizzazione può essere effettuata nella maggior parte dei laboratori. È interessante nota che ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodio dodecil solfato	Sigma Life Science	75746-1KG
Triton X-100	MP Biomedicals, LLC		nell'articolo. Reagente molto viscoso, può aiutare a tagliare l'estremità della punta della pipetta durante l'estrazione.
Candeggina concentrata (8,25% ipoclorito di sodio)	Clorox	Articolo #: 31009	Candeggina concentrata standard.
Bicarbonato di sodio	Acros Organics	217120010	Può essere sostituito con idrossido di sodio o carbonato di sodio.
8 mm Biopunch	HealthLink	15111-80	Taglia campioni che si adattano bene alla piastra a 24 pozzetti
Tavolo Belly Dancer-Shake	Stovall Life Sciences	BDRAA115S	Utilizzare basse velocità per non danneggiare i tessuti. Può utilizzare qualsiasi modello/marca di tavolo a scuotimento.
Isotemp piastra calda/agitatrice	Fisher Scientific		Può utilizzare qualsiasi stile/marca di piastra calda/agitatrice.
Bicchiere	qualsiasi		Può utilizzare un bicchiere di qualsiasi dimensione, purché si adatti ai vostri campioni e non li sovraffolla.
Tris cloridrato	Fisher Scientific	BP153-500
DMEM	Corning	MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA assay	Life Technologies	P11496	Può utilizzare qualsiasi metodo di quantificazione del dsDNA a portata di mano.