Articolo metodologico

Oligomero di β-amiloide a11-positiva preparazione e valutazione utilizzando Dot Blotting analisi

DOI:

10.3791/57592

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22 maggio 2018

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1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Li Dak Sum Yip Yio Chin Kenneth Li Marine Biopharmaceutical Research Center, Ningbo University, 3School of Materials Science and Chemical Engineering, Ningbo University

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive come preparare oligomeri Aβ da un peptide sintetico in vitro e per valutare la quantità relativa di oligomero Aβ da un punto di analisi macchiante.

Abstract

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Β-amiloide (Aβ) è un peptide idrofobo con un'intrinseca tendenza ad auto-assemblarsi in aggregati. Tra i vari aggregati, oligomero Aβ è ampiamente accettata come la neurotossina leader nel progresso della malattia di Alzheimer (AD) ed è considerato l'evento cruciale nella patogenesi dell'annuncio. Di conseguenza, Aβ oligomero inibitori potrebbero impedire la neurodegenerazione e hanno il potenziale per essere sviluppato come modificante la malattia trattamenti dell'annuncio. Tuttavia, i protocolli di diversa formazione di oligomeri Aβ potrebbero portare a oligomeri con caratteristiche diverse. Inoltre, non ci sono molti metodi per efficacemente gli inibitori di oligomero del1-42 di schermo Aβ. Un anticorpo A11 può reagire con un sottoinsieme di tossico oligomero di Aβ1-42 con strutture di β-foglio anti-parallelo. In questo protocollo, si descrive come preparare un campione di oligomero-ricco A11-positivi Aβ1-42 da un sintetico Aβ1-42 del peptide in vitro e per valutare la quantità relativa di oligomero di1-42 di Aβ A11-positivi in campioni tamponando un puntino analisi usando A11 e Aβ1-42-6E10 specifici anticorpi. Usando questo protocollo, inibitori dell'oligomero di A11-positivi Aβ1-42 possono essere selezionati anche da risultati sperimentali semi-quantitativa.

Introduzione

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Morbo di Alzheimer (annuncio) è una delle più importanti malattie neurodegenerative che colpisce le persone anziane nel mondo1. È ampiamente accettato che l'aggregazione anormale di β-amiloide (Aβ) può essere il fattore patologico principale dell'annuncio. Aggregati Aβ sono i componenti principali delle placche senili, uno dei marcatori biologici nei cervelli dei pazienti dell'annuncio. Inoltre, gli aggregati Aβ, oligomeri in particolare, producono neurotossicità potente, che potrebbe essere la causa della morte di un neurone come progredisce AD. Di conseguenza, l'inibizione della formazione di oligomeri Aβ potrebbe impedire la neurodegenerazione e inibitori oligomero Aβ potrebbero essere sviluppati come modificante la malattia trattamenti dell'annuncio. Molti studi hanno utilizzato un peptide Aβ sintetico per formare oligomeri in vitro, esplorare morfologie e strutture degli oligomeri Aβ artificiali e indagare gli inibitori dell'oligomero Aβ utilizzando in vitro modelli2,3 , 4. Tuttavia, protocolli di formazione diversi in vitro dell'oligomero Aβ potrebbero portare a oligomero con differenti caratteristiche morfologiche, che potrebbe causare i risultati incomparabili tra diversi gruppi di ricerca. Di conseguenza, un protocollo di formazione standard per oligomero Aβ è urgentemente necessaria.

Fino ad ora, non ci sono molti metodi sono stati segnalati per rilevare direttamente oligomeri Aβ. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM), gel elettroforesi non-denaturante, analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) e dot blotting analisi può essere utilizzati per esaminare la quantità e/o la morfologia di Aβ oligomero in vitro5, 6. ad esempio, la morfologia e la struttura dell'oligomero Aβ può essere osservati nel TEM. La quantità relativa e dimensioni molecolari delle aggregazioni di Aβ può essere misurate mediante elettroforesi non-denaturante. ELISA potrebbe essere utilizzata per determinare oligomero Aβ in siero, plasma ed estratti dal tessuto cerebrale. Infine, dot blotting analisi, una tecnica utilizzata per la rilevazione, analisi e identificazione di proteine, potrebbe essere utilizzato per valutare la concentrazione relativa di oligomero Aβ in diversi campioni con l'aiuto di anticorpi Aβ-specifiche e oligomero. Inoltre, un dot blotting analisi offre notevole risparmio di tempo, come l'elettroforesi del gel e le procedure macchiante per gel non sono necessari. Pertanto, questa analisi è usata normalmente per potenziali inibitori di oligomero Aβ di schermo. L'obiettivo generale del presente protocollo è di descrivere un metodo relativamente semplice, affidabile e riproducibile per preparare un campione Aβ1-42 oligomero-ricco, di analizzare la quantità di oligomero Aβ1-42 da dot blotting analisi e oligomero Aβ schermo inibitori utilizzando semi-quantitativa di risultati sperimentali.

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Protocollo

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1. soluzione preparazione

Nota: Vedere Tabella materiali per le origini di reagente.

  1. Preparare una soluzione di 5% albumina di siero bovino (BSA) con l'aggiunta di 5 g di BSA per 100 mL di acqua bidistillata. Mescolare nel Vortex completamente loro. Conservare la soluzione a 4 ° C per 1 mese.
  2. Preparare una soluzione di A11 dell'anticorpo anti-oligomero (1:1, 000) aggiungendo 10 µ l di soluzione madre di anticorpo a 10 mL di soluzione di BSA al 5%. Mescolare nel Vortex completamente loro. Conservare la soluzione a 4 ° C per 1 mese.
  3. Preparare una soluzione di 6E10 di anticorpo anti-Aβ (1:1, 000) aggiungendo 10 µ l di soluzione madre di anticorpo a 10 mL di soluzione al 5% BSA. Mescolarli completamente nel Vortex. Conservare la soluzione a 4 ° C per 1 mese.
  4. Preparare una soluzione OC di anticorpo anti-fibrillari oligomero (1:1, 000) aggiungendo 10 µ l di soluzione madre di anticorpo a 10 mL di soluzione al 5% BSA. Mescolarli completamente nel Vortex. Conservare la soluzione a 4 ° C per 1 mese.
  5. Preparare una soluzione di riserva (TBS) Tris-buffered salina con l'aggiunta di 24 g di Tris base e 88 g di NaCl a 1.000 mL di acqua bidistillata. Regolare il pH a 7.4. Conservare la soluzione a 4 ° C fino a 3 mesi.
  6. Preparare una soluzione fisiologica tamponata e Tween-20 (TBST) soluzione aggiungendo 1 mL di Tween-20 a 100 mL di TBS stock soluzione e 900 mL acqua bidistillata.
  7. Preparare una soluzione di anticorpo secondario da aggiungere 10 µ l di rafano perossidasi (HRP) Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) a 10 mL di soluzione TBST. Mescolare nel Vortex completamente loro. Conservare la soluzione a 4 ° C per 1 mese.
  8. Sciogliere 3,68 g di curcumina in 1 mL di solfossido dimetilico (DMSO) per formare una soluzione stock di curcumina di 10 mM.
  9. Sciogliere 5 mg di sintetico Aβ1-42 in 2 mL di 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanolo (HFIP) per formare una soluzione di monomero Aβ 2,5 mg/mL. Mettetelo a temperatura ambiente (25 ° C) per le aliquote di 20 min. rendere 100 µ l e conservare a-20 ° C fino a 6 mesi.
    Nota: Questa procedura deve essere eseguita velocemente come possibile. Le punte di pipetta dovrebbero essere tagliate fuori per garantire pipettaggio accurata.
  10. Preparare elettrochemiluminescenza (ECL) liquido mescolando ECL fluido A e B con un rapporto di volume di 1:1. Questa soluzione deve essere preparata appena prima dell'uso.

2. preparazione del campione

Nota: Eseguire la preparazione del campione 2 giorni prima del punto, l'analisi macchiante.

  1. Aggiungere 900 µ l di acqua bidistillata in una provetta di soluzione di monomero Aβ1-42 ; la concentrazione di Aβ1-42 sarà 0,25 mg/mL. Mettere l'impasto a temperatura ambiente per 20 min.
  2. Far evaporare la soluzione con gas azoto ad alta purezza fino a quando il suo volume è circa 850 µ l. La concentrazione della soluzione Aβ1-42 sarà circa 0,29 mg/mL.
    Nota: La soluzione deve essere agitata di volta in volta a garantire che il HFIP è completamente evaporato. Normalmente, dopo 30 min di evaporazione, il volume della soluzione residua è di circa 850 µ l.
  3. Diluire la soluzione madre di curcumina per una soluzione di lavoro di curcumina (0,2 e 2 µM) con acqua bidistillata. Mescolare la soluzione Aβ1-42e curcumina soluzione con un rapporto di 1:1 di volume di lavoro. Le concentrazioni finali di curcumina sarà 0,1 e 1 micron.
    Nota: Gli inibitori potenziali oligomero possono essere miscelati con la soluzione Aβ1-42 in qualsiasi rapporto, se necessario.
  4. Agitare bene la soluzione continuamente in un agitatore magnetico (Vedi Tabella materiali).
    1. Fissare una scatola di divisorio in plastica per l'agitatore magnetico. Posto 2 magnetica mescolare bar a 2 angoli della scatola e posizionare le provette dei campioni al centro della scatola.
    2. La scatola a temperatura ambiente (25 ° C) per 48 h di scossa.
      Nota: La velocità dell'agitatore magnetico è circa 60 giri/min.
  5. Centrifugare le provette per 15 min a 4 ° C e 18.000 g. x raccogliere il surnatante.

3. dot Blotting analisi

Nota: Tutte le incubazioni vengono eseguite su un agitatore orizzontale.

  1. Membrana di nitrocellulosa tagliate a strisce larghe 1 cm.
    Nota: La larghezza della membrana di nitrocellulosa è regolabile in base alle esigenze sperimentali.
  2. Posizionare il campione 2-µ l in modo uniforme sui 2 strisce (striscia 1 e 2) con ogni intervallo del punto a 0,5 cm.
  3. Mettere le strisce a temperatura ambiente per 5 minuti fino a quando la goccia sulla banda è asciutta.
  4. Incubare le strisce con una soluzione di 5% BSA per 30 min a temperatura ambiente.
  5. Sciacquare le strisce con una soluzione TBST per 5 min a temperatura ambiente.
  6. Aspirare la soluzione TBST. Per 1 h a temperatura ambiente, incubare striscia 1 con un anticorpo anti-oligomero A11 soluzione e striscia 2 con una soluzione di 6E10 di anticorpo anti-Aβ.
  7. Sciacquare le strisce con una soluzione TBST tre volte, ogni volta per 5 min a temperatura ambiente.
  8. Aspirare la soluzione TBST. Incubare le strisce con una soluzione di anticorpo secondario per 40 min a temperatura ambiente.
  9. Sciacquare le strisce con una soluzione TBST tre volte, ogni volta per 5 min a temperatura ambiente.
  10. Applicare uniformemente il liquido misto di ECL alla superficie delle strisce. Esporre le strisce in una sistema di imaging automatico di chemiluminescenza (Vedi Tabella materiali).
    Nota: Normalmente, 300 µ l di liquido ECL è sufficiente per una membrana. La membrana deve essere tenuta umida durante l'esposizione. Il tempo di esposizione viene calcolato automaticamente dal sistema di imaging.
  11. Fare un'analisi di scala di grigi utilizzando ImageJ (National Institutes of Health) o un altro software di elaborazione dell'immagine per ottenere risultati semi-quantitativi.

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Risultati

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Per studiare se un monomero Aβ1-42 può formare un oligomero Aβ1-42 dopo la preparazione, analisi TEM è stata usata. Non aggregati visibili sono stati osservati nel campione HFIP-dissolta Aβ1-42 monomero (Figura 1A). Inoltre, principalmente globulari aggregati con un diametro di circa 10-80 nm sono stati osservati nel campione Aβ1-42 dopo 48 h di agitazione, suggerendo che Aβ1-42 forma oli...

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Discussione

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In questo protocollo, abbiamo segnalato un metodo per preparare campioni contenenti oligomero Aβ1-42 e per analizzare la quantità di oligomero di A11-positivi Aβ1-42 da un punto di analisi macchiante. Anche se i nostri metodi per la preparazione di campioni Aβ1-42 oligomero-ricchi sono abbastanza semplici, affidabili e riproducibili, ci sono ancora alcuni punti per essere notato. In primo luogo, HFIP viene utilizzato per sciogliere sintetico peptide Aβ1-42 . Un aggregato peptid...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Natural Science Foundation of China (U1503223, 81673407, 21475131), il progetto di ricerca applicata su tecnologia senza scopo di lucro della provincia del Zhejiang (2016C 37110), Ningbo internazionale di scienza e tecnologia Progetto di cooperazione (2014D 10019), Ningbo comunale Innovation Team del Life Science e salute (2015C 110026), Ningbo Sci & Tech progetto per ricchezza comune (2017C 50042), il Li Dak somma Yip Yio mento Kenneth Li Marine biofarmaceutica Development Fund, e del fondo di K. C. Wong Magna a Ningbo University.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
A11 (ab126892 Rb pAb a oligomeri amiloidi)AbcamGR91739-58
6E10 (beta-amiloide coniglio Ab)Cellula  Tecnologia di segnalazione2454S
OC (Anticorpo anti-amiloidi fibrille OC)MilliporeAB2286
Marcatore di perossidasi di rafano (HRP) Capra anti coniglio IgG (H+L) BeyotimeA0208
Aβ 1-42GL Biochem52487
1,1,1,3,3,3-esafiuoro-2-propanoloAladinoI1523078
CurcuminaSigmaC1386
Albumina Bovina VSolarbioA8020
Cloruro di sodioSangon BiotechD920BA0003
Sodio dodecil solfatoSCR30166428
TRISSolarbioT8060
GlicinaSolarbioG8200
  DimetilsolfossidoSolarbioD8370
5&volte; gel non denaturante PAGE Marcatore proteicoBeyotimeP0016
Genshare CFAS anyKD PAGEGenshareJC-PE022
Membrana di tamponamento a nitrocellulosa puraPall CorporationT50189
MetanoloSCR10014118
EtanoloSCR10009218
Gamma super bassa  marcatore di proteineSolarbioPR1300
Membrane di trasferimentoImmobilon-PSQISEQ00010
BeyoECL StarBeyotimeP0018A
Commassie Blue Soluzione di colorazione rapidaBeyotimeP0017
Tutti - sistema di imaging a chemiluminescenza automaticaTanonTanon 5200
Immagine JNazionale Istituti di sanità
Software di elaborazione delle immaginiAdobePhotoshop CS6
Agitatore magneticoShanghai Huxi

Riferimenti

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  1. Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
  2. De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444(2017).
  3. Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).
  4. Xiang, S. Y., et al. Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).
  5. Chang, L., et al. Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin. Scientific Reports. 5, 10256(2015).
  6. Yam, G. H. F., et al. In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).
  7. Tomaselli, S., et al. The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding. ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).
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