Articolo metodologico

Generazione di insulina senza impalcatura, tridimensionale esprimendo Pancreatoids dal Mouse progenitori pancreatico In Vitro

DOI:

10.3791/57599

⸱

2 giugno 2018

 ,  ,  , 
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Center for Cell and Gene Therapy, Texas Children's Hospital, and Houston Methodist Hospital, Baylor College of Medicine, 3Molecular and Cellular Biology Department, Baylor College of Medicine, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Center, Baylor College of Medicine, 5McNair Medical Institute, Baylor College of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un protocollo per generare insulina esprimendo 3D pancreatoids murino da progenitori pancreatici e 10.5 digalleggiante dissociato e mesenchima associato.

Abstract

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Il pancreas è che un organo complesso composto di molti diversi tipi di cellule che lavorano insieme per regolare la digestione e l'omeostasi del glucosio di anima. Questi tipi di cellule includono enzima-secrezione delle cellule acinose, un sistema duttale arborized responsabile del trasporto degli enzimi per le cellule endocrine dell'intestino e producono ormoni.

Beta-cellule endocrine sono il tipo di suola delle cellule nel corpo che producono l'insulina per abbassare i livelli di glucosio nel sangue. Diabete, una malattia caratterizzata da una perdita o la disfunzione delle cellule beta, sta raggiungendo proporzioni epidemiche. Quindi, è essenziale stabilire protocolli per studiare lo sviluppo della beta-cellula che può essere utilizzato ai fini dello screening per derivare la droga e le terapie basate su cellule. Mentre l'indagine sperimentale del mouse sviluppo è essenziale, in vivo gli studi sono laboriosa e che richiede tempo. Cellule coltivate forniscono una piattaforma più conveniente per lo screening; Tuttavia, essi sono in grado di mantenere la diversità cellulare, organizzazione architettonica e interazioni cellulari trovati in vivo. Quindi, è essenziale per sviluppare nuovi strumenti per studiare la fisiologia e l'organogenesi pancreatica.

Cellule epiteliali pancreatiche si sviluppano in stretta associazione con mesenchima fin dall'inizio dell'organogenesi come cellule organizzano e si differenziano nell'organo adulto complesso, fisiologicamente competente. Il mesenchima pancreatico fornisce segnali importanti per lo sviluppo del sistema endocrino, molti dei quali non sono buono capiti ancora, così difficile ricapitolare durante la coltura in vitro . Qui, descriviamo un protocollo alla cultura del mouse complesso tridimensionale, cellulare organoids che conservano mesenchima, chiamato pancreatoids. Il germoglio pancreatico murino e 10.5 è sezionato, dissociato e coltivato in un ambiente senza impalcatura. Questi galleggianti cellule assemblarsi con mesenchima avvolgente il pancreatoid in via di sviluppo e un robusto numero delle beta-cellule endocrine, sviluppando insieme l'acinose e cellule del condotto. Questo sistema può essere utilizzato per studiare le interazioni cellula-cellula cellula determinazione di destino, organizzazione strutturale e morfogenesi, durante l'organogenesi, o per la droga, piccola molecola o screening genetico.

Introduzione

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Delineare i meccanismi dello sviluppo normale e la fisiologia è fondamentale per capire l'eziologia di malattia e coltivare in ultima analisi, metodi di trattamento. Mentre la coltura e la differenziazione delle cellule staminali permette analisi di alto-rendimento e veloce di sviluppo, è limitata dal corpo esistente di conoscenza dei meccanismi che regolano il destino delle cellule e artificialmente ricapitola lo sviluppo in un relativamente omogenea, bidimensionale stato1,2. Non solo è in vivo sviluppo influenzato dai fattori estrinseci, con diversi tipi di cellule nella nicchia e milieu fornendo segnali paracrini e supporto organizzativo per guidare l'organogenesi, ma la funzione di queste cellule si basa anche sulla loro dintorni per orientamento3,4,5. Dato l'importanza di queste indicazioni esterne, le limitazioni dei protocolli di differenziazione e la natura laboriosa di in vivo modelli murini, nuovi sistemi sono necessari studiare sperimentalmente fisiologia e processi di base inerente allo sviluppo.

L'emersione dei protocolli per generare organoids tridimensionale, complesso fornisce un sistema conveniente e congruo per studiare l'organogenesi, la fisiologia, l'efficacia dei farmaci e anche patogenesi. Che istituisce organoids murino per diversi sistemi come lo stomaco6 e intestino7 hanno ampliato la nostra comprensione dell'organogenesi, fornendo uno strumento per studiare la complessità inerente allo sviluppo con meno restrizioni rispetto a vivo e modelli in vitro . A causa di questi avanzamenti nella murino organoid formazione e l'avvento di pluripotenti umane derivano cellule, intestinale umano8, retinica9, renale10,11, e cerebrale12 organoids sono state prodotte e questo repertorio è limitato solo dalla conoscenza esistente per quanto riguarda i meccanismi di sviluppo.

Di particolare interesse è la generazione dei organoids del pancreas, come una miriade di malattie affligge tipi differenti delle cellule del pancreas, compreso le cellule acinose e condotti in insufficienza pancreatica exocrine13, cellule acinose in pancreatite14, e cellule beta nel diabete15. Acquisire conoscenze relative allo sviluppo di questi tipi differenti delle cellule potrebbe aiutare a comprendere la loro patologia e può, inoltre, agire come una piattaforma per lo screening di stupefacenti personalizzati o trapianto. In precedenza, Greggio et al ha sviluppato un metodo per creare organoids pancreatico murino che ricapitolare in vivo morfogenesi e sviluppare strutture organizzate, tridimensionale, complesse composte da tutti i principali delle cellule epiteliali del pancreas tipi di16,17. Si tratta di un importante passo avanti nel campo del pancreas, soprattutto come fare le cellule in vitro possibile attivare indagini biologiche dello sviluppo della cellula beta. Tuttavia, una scarsità di cellule endocrine formata in questo protocollo, a meno che il organoids sono stati trapiantati in tessuto, dove la nicchia potrebbe interagire e fornire spunti didattici17. Il mesenchima costituisce la più grande parte della nicchia, pesantemente avvolgente dell'epitelio in via di sviluppo dalle fasi iniziali dell'organogenesi a fasi successive, tra cui endocrino delaminazione e differenziazione3,4, 18. L'interazione del mesenchyme con il pancreas in via di sviluppo è l'ennesimo esempio di segnalazione estrinseca e l'importanza di mantenere in vivo cellulare complessità per studiare l'organogenesi.

Qui, descriviamo come generare tridimensionale organoids pancreatico, chiamato pancreatoids, da progenitori pancreatico murino dissociate e 10.5. Questi pancreatoids conservare mesenchima nativo, auto-assemblarsi in condizioni di libero di fluttuare e generare tutti i tipi principali delle cellule del pancreas, compreso un robusto numero di cellule endocrine beta19. Questo approccio è più adatto per l'analisi dello sviluppo endocrino, come protocolli precedenti mancano robusta differenziazione endocrina. Tuttavia, utilizzando il protocollo per organoids pancreatico come descritto da Greggio et al è più adatto per analisi di ramificazione epiteliale del pancreas e morfogenesi, come ramificazione è più limitato a pancreatoids.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali descritti in questo metodo sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato del Baylor College of Medicine.

1. preparazione del Mouse giorno embrionale 10.5 progenitori del pancreas

Nota: Questo protocollo non ha bisogno di essere seguiti in condizioni sterili fino al passaggio 2, tuttavia è ottima per sterilizzare strumenti di dissezione e spruzzare prima di etanolo al 70% di utilizzare.

  1. Per impostare per dissezione, riempire un secchio di ghiaccio e posizionare un contenitore di tampone fosfato salino (PBS) nel ghiaccio. Pulire due pinze a punta fine e forbici per dissezione con etanolo al 70%. Situato vicino alla zona di dissezione, un contenitore con almeno tre borosilicato capillare tubi, una pipetta di bocca, un accendino e filtrata puntali per pipette 1.000 µ l.
    1. Preparare almeno 1 mL di dispase freddo di 1,25 mg/mL diluito in acqua sterilizzata e posto nel secondo pozzetto di una piastra ben 12 su ghiaccio. Mettere PBS nel primo, terzo e quarto pozzi del 12 ben piatto. Posizionare 1 mL di 0.05% tripsina in un 1,5 mL tubo sul ghiaccio. Pre-riscaldare un agitazione incubatore a 37 oC.
  2. Eutanasia e 10.5 topi temporizzato-incinta conformemente agli orientamenti IACUC. Spruzzare l'addome con etanolo al 70% per pulire la regione prima di effettuare un'incisione a forma di V nella zona genitale del mouse con delle forbici, pinze e continuarlo fino a diaframma.
    Nota: L'aspetto di un plug vaginale in questo protocollo indica giorno 0,5. Utilizzando 5 - 6-settimana-vecchi topi, un aumento di peso di più di 2 g agisce come misura secondaria di impregnazione di successo.
    1. Con attenzione asportare l'utero praticando un'incisione le porzioni superiore e laterale dell'utero, tirando l'organo verso l'alto dal mouse e a seguito di questa incisione verso la regione genitale prima di ripetere sul lato opposto. Posto in un 10cm Petri con il PBS freddo.
      Nota: È possibile ottenere organoids da cellule e11.5 dissociato, tuttavia a differenza del pancreatoids e 10.5, questi organoids non sono ancora caratterizzate e così non possono mantenere la capacità di differenziarsi in tutti i tre lignaggi principali del pancreas.
  3. Sotto un microscopio chiaro dissezione, collocare la capsula di Petri e aprire con cautela il tessuto uterino posizionando due pinze tra ciascun embrione e peeling tessuto lontano il sacco vitellino. Trasferire gli embrioni afferrando il sacco vitellino delicatamente con forcipe e posto in un 10cm Petri con fresco, PBS freddo. Mettere la capsula di Petri sul ghiaccio.
    Nota: È importante rimuovere heedfully embrioni, preferibilmente mantenuti entro il sacco vitellino, come rimozione forzata può tirare il cordone ombelicale, lo strappo dei tessuti dell'embrione e compromettere l'integrità strutturale.
  4. Posto più PBS gocce su un coperchio di scatola di Petri di 10 cm. Utilizzare queste goccioline per trasferire l'embrione durante la dissezione come tessuti extraembryonic vengono rimossi per assicurare la visibilità. Trasferire un embrione a una goccia di PBS e rimuovere delicatamente dal sacco vitellino usando il forcipe, mentre i rimanenti embrioni soggiorno in PBS su ghiaccio (Figura 1A). Rimuovere la testina prima di spostare l'embrione di un nuovo calo di PBS utilizzando forcipe a scoop leggermente l'embrione, a non danneggiare il tessuto (Figura 1B).
    Nota: Il tessuto potrebbe essere necessario essere trasferiti più frequentemente alle goccioline di PBS fresche rispetto a quelli descritti qui, a seconda l'opacità del liquido.
    1. Una nuova caduta di PBS, rimuovere i germogli di zampa anteriore usando il forcipe (Figura 1B). Collocare la pinza nell'apertura dove era presente di arto e delicatamente strappare solo il tessuto più esterno anteriormente (Figura 1B). Ruotare l'embrione e ripetere in direzione posteriore, fermandosi sul nascere hindlimb. A questo punto, il tratto gastrointestinale dovrebbe essere visibile (Figura 1B).
    2. La regione posteriore del tratto gastrointestinale ha una leggera curva (Figura 1F). Inserire la pinza dietro questa curva nell'apertura tra il tratto gastrointestinale e la regione spinale della parete del corpo. Staccare il tratto gastrointestinale, lavorando lentamente verso l'alto fino a raggiungere la regione più anteriore dove la regione cardiaca si connette (Figura 1B-E).
      FACOLTATIVO: Rimuovere il cuore primordiale e le gemme del fegato dalle regioni ventrali del tratto gastrointestinale, lasciando solo il tubo continuo dell'intestino. Le prime volte che viene eseguito questo protocollo potrebbe essere più facile lasciare il cuore e il fegato come punti di riferimento ventrale fino la morfologia del tratto gastrointestinale e il germoglio pancreatico dorsale sono più familiare (Figura 1C e D ).
    3. Trasferire il tratto gastrointestinale la gocciolina di PBS.
    4. Prendere il forcipe e pizzicare delicatamente il tessuto sotto il germoglio sporgente e l'intestino e sollevare leggermente il tessuto esterno fuori (Figura 1D-F).
      Nota: Il germoglio pancreatico dorsale si trova tra lo stomaco e l'intestino (Figura 1C-G). Il germoglio pancreatico sotto dovrebbe apparire come una struttura rotonda, tassellata (Figura 1G).
    5. Collocare la pinza dove il germoglio si connette per l'intestino e pizzico verso l'alto per allentare il germoglio (Figura 1G). Lavare una volta in una nuova bolla di PBS prima del trasferimento sul nascere nel primo pozzetto della piastra ben 12 in PBS freddo sul ghiaccio. Ripetere fino a quando tutti i germogli sono raccolti dagli embrioni e collocati nel primo pozzetto della piastra ben 12.
  5. Mettere il piatto ben 12 sotto il microscopio di dissezione luce. Contare il numero di gemme pancreatici con successo sezionati per poi calcolare il rapporto di divisione.
    1. Posto un filtrato 1.000 puntale µ l nella pipetta bocca con un tubo capillare associata. Fiamma sterilizzare il tubo capillare e creare una curva del tubo per la facilità d'uso. Utilizzare il capillare per trasferire i germogli per la seconda soluzione contenente dispase freddo per 2 min prima del trasferimento al terzo pozzo con il PBS pulito (Figura 1G).
      Nota: Durante il trasferimento germogli da dispase PBS, evitare di toccare il tessuto fino alla punta del capillare. Se il tessuto si incastra sulla punta del tubo, pipettare su e giù o agitare nella soluzione PBS pulita fino a quando allentato.
    2. Pipettare germogli su e giù e trasferire al quarto pozzo con PBS pulito. Infine, utilizzando il trasferimento capillare periferica germogli per la provetta da 1,5 mL con 0,05% tripsina. Collocare la provetta nel pre-riscaldato 37 oC shaker e agitare a 1.500 giri/min per 4 min.
    3. Vortex per circa 10 s, quindi, inserire immediatamente il tubo in una centrifuga e spin per 5 min a 200 g. Togliere tutto ma circa 50 µ l di soluzione con cautela per non disturbare le cellule centrifugate (Figura 1G).

2. coltura dissociati progenitori per formare Pancreatoids

Nota: Il seguente deve essere eseguito in un ambiente sterile in un cappuccio di coltura del tessuto standard, utilizzando le procedure sterili standard.

  1. Per ogni gemma raccolto, aggiungere 400 µ l organogenesi media16,17 (tabella 1) le cellule centrifugate. Vortice di impulso tre volte e piastra 100 µ l di un attacco basso 96 ben piatto, spaccare gustative in un rapporto di 1:4 (Figura 1G).
  2. Controllare al microscopio per visualizzare dissociato cellule galleggiano liberamente (Figura 1H). Posizionare la piastra di coltura in un incubatore a 37 oC con 5% CO2 su un agitatore meccanico a media velocità.
  3. Monitorare lo stato di pancreatoids al giorno. Sostituire con 100 µ l di media fresca ogni 3 giorni, attentamente pipettaggio media sotto controllo microscopico nella cappa di rimuovere lasciando pancreatoid nel pozzo. In alternativa, fresca 100 µ l di media può essere aggiunto a un nuovo pozzo e pancreatoid trasferiti utilizzando il tubo capillare di borosilicato collegato a bocca pipetta e 1000 µ l filtrata punta della pipetta.

3. il trattamento Pancreatoids per l'Imaging immunofluorescente

  1. Per elaborare pancreatoids per immagini immunofluorescenti, innanzitutto preparare 4% paraformaldeide/PBS, soluzione pH7.4 (PFA). Mettere 50 µ l di PFA in pozzi di un 96 piastra ben il 4%.
    1. Utilizzando i tubi capillari borosilicato e pipetta in bocca con la punta della pipetta filtrata 1.000 µ l, trasferimento pancreatoids da terreno di coltura tenendo il pozzo fresco con 4% mezzi come piccoli come possibile PFA. Impostare il rocker a temperatura ambiente per 15 min.
    2. Trasferimento di pancreatoids da 4% roccia PFA in un pozzo con 100 µ l di PBS fresco, a temperatura ambiente per 5-10 min ripetere per un totale di tre lavaggi di PBS freschi.
      Nota: Il protocollo può essere sospesa qui, con pancreatoids memorizzati in 100 µ l di PBS a 4 oC fino ad una settimana.
  2. Per l'imaging di wholemount (consigliato se gli anticorpi sono approccio alternativo adatto nella sezione 3.3. e microscopia in 3.4.), trasferimento da PBS in 50 µ l di siero di 5% asino in 1X PBS con 0,1% detergente non ionico (PBST) al blocco. Rock tutta la notte a 4 oC o in alternativa per 4 h a temperatura ambiente.
    1. Trasferimento pancreatoids a un nuovo pozzo che contiene gli anticorpi primari diluiti in 50 µ l di siero di 5% asino in 1 x PBST. In modo ottimale, roccia per 24 h a 4 oC (almeno 12 h ma fino a 36 h).
      Nota: Gli anticorpi elencati nella Tabella materiali contro Chitaga (1: 100), DBA (1: 400), Vim (1: 400) e Pdx1 (1: 100) sono adatti per la colorazione del wholemount; altri anticorpi possono richiedere ottimizzazione.
    2. Trasferimento pancreatoids ad un pozzo che contiene 100 µ l di PBST fresca per lavare e rock per 30 min a temperatura ambiente. Ripetere questo passaggio per un totale di tre lavaggi PBST freschi.
    3. Trasferimento pancreatoids a un nuovo pozzo contenente anticorpi secondari diluiti in 50 µ l di siero di 5% asino in 1 x PBST. Proteggere la piastra dalla luce e posto in 4 oC, a dondolo per in modo ottimale 24 h (almeno 12 h ma fino a 36 h).
      Nota: Tutti gli anticorpi secondari elencati nella Tabella materiali e DAPI controcolorazione nucleare sono adatti per la colorazione del wholemount.
    4. Trasferimento pancreatoids a un nuovo pozzo che contiene 100 µ l di 1x PBST e roccia a temperatura ambiente per 30 min. Ripetere per un totale di tre lavaggi in 1 x PBST. Nel terzo e ultimo lavaggio, aggiungere 300 nM DAPI.
    5. Infine, inserire in 100 µ l di PBS pulito e conservare a 4 oC al riparo dalla luce per fino ad una settimana prima dell'imaging mediante microscopia confocale, sebbene i migliori risultati provengono da formazione immagine immediatamente dopo la colorazione. Per impedire il movimento di pancreatoids durante la formazione immagine, ma evitare l'essiccazione, inserire ogni pancreatoid in una goccia di 20 µ l di PBS. Se pancreatoids non rimangono ancora, ridurre il volume di PBS.
  3. Per sezioni congelate, trasferire pancreatoids da PBS in soluzione di saccarosio 30% durante la notte alle 4 oC.
    1. Aggiungi media incorporamento in una bolla sotto un microscopio di dissezione. Usando il forcipe sotto controllo microscopico, ammollo pancreatoids spingendo delicatamente attraverso i media che utilizza più volte per rimuovere saccarosio residua prima di trasferire a un blocco di tessuto con media incorporamento congelati.
    2. Posizionare il blocco di tessuto sul ghiaccio secco fino a quando congelati e sezione del criostato a 8 µm.
      Nota: Sezioni possono essere conservate a-80 oC o immunostained immediatamente.
    3. Consentire le sezioni da-80 oC a scongelare a temperatura ambiente per circa 5 min fino a secco. Disegnare una barriera idrofoba utilizzando la penna di pap idrofobo intorno il tessuto e il blocco usando 5% asino siero diluito in 1 x PBST per 30 min a temperatura ambiente.
    4. Rimuovere e sostituire immediatamente con gli anticorpi primari diluiti in 5% di siero di asino diluito in 1 x PBST pernottamento in 4 oC.
    5. Rimuovere la soluzione primaria e lavare tessuti tre volte con 1 x PBST per 10 minuti ciascuno. In seguito, aggiungere la soluzione di anticorpo secondario diluito in 5% di siero di asino diluito in 1 x PBST per 1 h a temperatura ambiente e proteggere i vetrini dalla luce.
    6. Rimuovere la soluzione secondaria e lavare i vetrini tre volte in 1 x PBST per 10 minuti ciascuno. Il lavaggio finale, aggiungere 300 nM DAPI.
    7. Rimuovere i supporti e aggiungere mezzi di montaggio e un vetrino coprioggetti. Archivio scivola lontano dalla luce in 4 oC fino al momento della battuta.

4. isolamento di RNA da Pancreatoids per analisi della trascrizione

  1. Raccogliere pancreatoids utilizzo capillare di borosilicato collegato a una pipetta di bocca con una punta di pipetta µ l 1.000 filtrata per la sterilità e posto in 500 µ l di soluzione di tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinium acido in una provetta da 1,5 mL. Conservare a-80 oC o procedere immediatamente all'isolamento del RNA.
  2. Per l'isolamento di RNA, scongelare i campioni su ghiaccio se necessario e aggiungere 100 µ l di cloroformio. Vortice bene e posto in 4 oC per 15 min. pre-raffreddare una centrifuga a 4 oC.
    1. Inserire tubi di centrifuga e spin per 20 min a 12.000 g a 4 oC.
    2. Estrarre con cautela le provette per non disturbare la separazione degli strati. Utilizzando una pipetta di 200 µ l, raccogliere la soluzione acquosa limpida e inserire in una nuova provetta da 1,5 mL, lasciando dietro di sé una piccola quantità di buffer dal livello di proteina bianco e rosa strato di DNA. Non toccare la punta della pipetta per nulla in questo processo e non toccare le pareti del tubo da 1,5 mL.
    3. Aggiungere 500 µ l di isopropanolo 100% nella nuova provetta contenente lo strato acquoso e vortice. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 20 minuti, più a lungo sul ghiaccio, o per precipitazione massima di lasciare durante la notte-20 oC.
    4. Centrifugare a 12.000 g per 15 min a 4 oC a pellet il RNA. Rimuovere l'isopropanolo senza disturbare il pellet.
      Nota: Come pancreatoids sono piccole, è probabile che la pallina non sarà visibile.
    5. Freddo, aggiungere 75% etanolo e capovolgendo il tubo. Posto nella centrifuga e spin a 9.000 x g per 10 min a 4 oC. Rimuovi l'etanolo e spin per 2 min a 9.000 x g.
    6. Utilizzare una pipetta 200 µ l per rimuovere qualsiasi residuo etanolo nel tubo, senza contattare il pellet risiede nella regione. Lasciare aperto il tappo sul tubo per 5-10 min a temperatura ambiente per garantire la evaporazione di etanolo residuo.
    7. Risospendere il pellet nel Vortex in 20 µ l di acqua pulita, privo di nucleasi.
      Opzionale: Calore il RNA a 65 oC per 3 min e immediatamente tornare al ghiaccio. RNA possa essere conservato a-80 oC o immediatamente utilizzato per trascrizione inversa e qPCR.

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Risultati

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La dissezione attenta degli embrioni del mouse alle e 10.5 dal corno uterino dovrebbe produrre embrioni intatti in PBS per ulteriore dissezione (Figura 1A). Il tratto gastrointestinale può essere rimosso in modo efficiente dall'embrione (Figura 1B), permettendo di discernimento del germoglio pancreatico dorsale alla giunzione dell'intestino e dello stomaco (Figura 1<...

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Discussione

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La progressione dei modelli della coltura cellulare è fondamentale per correttamente modello sviluppo, produrre tipi cellulari clinicamente rilevanti, prova l'efficacia dei farmaci o trapianto anche ai pazienti. Tuttavia, artificialmente ricapitola lo sviluppo in un piatto è impegnativo come siamo ancora lontani dal comprendere i meccanismi della organogenesi e fisiologia in vivo. Così le cellule in vitro sono inefficacemente generato, non completamente funzionale, incapace di essere mantenuti per lungh...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jolanta Chmielowiec vi ringraziamo utile discussione per quanto riguarda il protocollo e il manoscritto. Ringraziamo anche Benjamin Arenkiel per l'accesso al microscopio confocale. Questo lavoro è stato supportato da NIH (P30-DK079638 a M.B.) e T32HL092332-13-m.a.s. e M.B., il fondamento medico di McNair (a M.B.) e il nucleo confocale al BCM intellettuale e centro di ricerca di inabilità inerenti allo sviluppo (NIH U54 HD083092 dal Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2-MercaptoetanoloSigma-AldrichM6250
Tubi Aspiratore per Pipette Microcapillari CalibrateSigma-AldrichA5177
BarnStead NanoPure Acqua priva di nucleasiThermoFisherD119
Tubi capillari in borosilicatoSutter InstrumentsGB1007515O.D. 1 mm, D.I. 0,75 mm, lunghezza
1,5 cmCaCl2Sigma-AldrichC5080
Greiner per micropiastre a 96 pozzetti repellente per celluleBio-One650970Centrifuga con fondo a U
5424 REppendorf5401000013
CloroformioSigma-Aldrich233306
anticorpo Cromogranina-AAbcamab15160
Stereomicroscopio compatto e modulare M60Leica
Countess Contatore di cellule automatizzatoInvitrogenC10310
Countess Contatore di cellule VetriniInvitrogenC10312
CryoStar NX70ThermoFisher957000L
D-(+)-glucosioSigma-AldrichG7528
DAPI (4',6-diamidina-2'-fenilindo-dicloridrato)Roche10 236 276 001Anticorpo
DBAVector LabRL-1032
Dispase II, Gibco in polvere17105041
DMEM/F-12, HEPESGibco11330032
Dnase IInvitrogen18068-015
Dumont #5 PinzeStrumenti per la scienza fine11251-100,05 x 0,02 mm; Titanio; Consiglio per la biologia
EGF (fattore di crescita epidermico)Sigma-AldrichE9644
Etanolo, 200 ProofDecon Laboratories2716
Incubatori a CO2 a ciclo Forma Steri ThermoFisher370
Fluoromount-GSouthern BiotechOB10001
Eparina sale sodico dalla mucosa intestinale suinaSigma-AldrichH3149-10KU
INSM1 AnticorpoSanta Cruz Biotechnologysc-271408Isopropanolo policlonale di topo
IsopropanoloFishera4164
Isothesia isoflurane, USPHenry Schein11695-6776-2
Anticorpo insulinaDakoA056401cavia policlonale
KAPA SYBR FAST UniversalKAPA BiosystemsKK4618
KCl KaryoMax10575090
KnockOut Siero di ricambioInvitrogen10828028
Leica TCS SPE Confocale spettrale ad alta risoluzioneLeica
MgCl2Sigma-Aldrich442615
Mouse C-peptide ELISAALPCO80-CPTMS-E01
Mouse ultrasensibile LameALPCO80-INSMSU-E01
MX35ThermoFisher3052835
NaClSigma-AldrichS7653
NaHCO3Sigma-AldrichS3817
NaH2PO4Sigma-Aldrich
Siero d'asino normaleJackson Immuno Research017-000-121
ParaformaldeideSigma-Aldrich158127
PBS 1XCorning21-040-CV
Pdx1 anticorpoDSHBF6A11Mouse monoclonale MIgG1
Peel-A-Way Stampi per inclusione monousoVWR15160-157
Soluzione di penicillina-streptomicinaCorningMT30002CI
PMA (Phorbol 12-Myristate 13- Acetato)Sigma-AldrichP1585
Protein LoBind Provette per microcentrifugaEppendorf22431081capacità di 1,5 ml
Proteina umana ricombinante FGF-10R& D Systems345-FG
FGF-acido umano ricombinantePeprotech100-17A
Proteina R-spondina I umana ricombinanteR& D Systems4546-RS
BenchRocker 2DBenchmarkBR2000
Saccarosio 500gSigma-AldrichS0389
SuperFrost Plus Vetrini per microscopioFisher Scientific12-550-15
Super Pap PenMicroscopia elettronica Sciences71310
Thermomixer REppendorf05-412-401
Tessuto Tek O.C.T. CompostoSakura4583
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
TRIzol ReagenteInvitrogen15596018
TrypLE ExpressInvitrogen12604039(1x), senza fenolo rosso
Trypan Blue StainInvitrogen15250061Per vetrini per conteggio cellulare
Tripsina-EDTA (0,05% )Corning25-052-CI
Tripsina-EDTA (0,25%)Gibco25200072Rosso fenolo
Attacco ultrabasso Piastra a 24 pozzettiCorning3473
Piastra sferoidale a bassissimo attaccoCorning4520
Anticorpo VimentinaEMD MilliporeAB5733Pollo policlonale IgY
Vortex GenieBioExpresS-7350-1
Y-27632 DicloridratoR& D Systems1254Conosciuto anche come inibitore ROCK
Zeiss 710 Microscopio confocaleZeiss
in polvere per microtomo ELISA a 96 pozzetti Corning 4520

Riferimenti

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