Articolo metodologico

Polisoma Profiling nel testicolo di topo, cellule umane e di Leishmania

DOI:

10.3791/57600

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8 aprile 2018

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1Department of Cell Biology and Biochemistry, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Department of Biological Sciences, Texas Tech University, 3CISER (Center for the Integration of STEM Education & Research), Texas Tech University

In questo articolo

Sommario

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L'obiettivo generale di tecnica di profilatura polisoma è analisi di attività traduzionale di singoli mRNA o del trascrittoma mRNA durante la sintesi proteica. Il metodo è importante per gli studi di regolamento di sintesi della proteina, l'attivazione di traduzione e repressione in salute e più malattie umane.

Abstract

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Espressione della proteina corretta al momento giusto e nelle giuste quantità è alla base della funzione normale delle cellule e la sopravvivenza in un ambiente veloce-cambiante. Per lungo tempo, gli studi di espressione genica sono stati dominati dalla ricerca al livello trascrizionale. Tuttavia, i livelli allo stato stazionario di mRNA non correlano bene con la produzione di proteine, e la traducibilità dei mRNAs varia notevolmente a seconda delle condizioni. In alcuni organismi, come il parassita Leishmania, l'espressione della proteina è regolata principalmente a livello traduzionale. Studi recenti hanno dimostrato che dysregulation di traduzione della proteina è associata con cancro, metabolico, neurodegenerative e altre malattie umane. Polisoma profiling è un metodo potente per studiare il regolamento della proteina di traduzione. Permette di misurare lo stato traduzionale di singoli mRNA o esaminare la traduzione su scala genomica. La base di questa tecnica è la separazione di polisomi, ribosomi, loro subunità e mRNAs gratuito durante la centrifugazione di un pattern citoplasmatico lisato attraverso un gradiente di saccarosio. Qui, presentiamo un protocollo profilatura polisoma universale utilizzato su tre diversi modelli - parassita maggiore di Leishmania, cellule umane coltivate e tessuti animali. Leishmania cellule crescono liberamente in sospensione e cellule umane coltivate crescono nello strato monomolecolare aderente, mentre testicolo di topo rappresenta un campione di tessuto animale. Così, la tecnica si adatta a tutte queste fonti. Il protocollo per l'analisi delle frazioni polisomici include rilevamento dei singoli livelli di mRNA di RT-qPCR, proteine mediante Western blot e analisi di RNA ribosomiale (rRNA) tramite l'elettroforesi. Il metodo può essere ulteriormente esteso da esame dell'associazione di mRNA con il ribosoma a livello del trascrittoma di profonda RNA-seq e analisi delle proteine associate ribosoma di spettroscopia di massa delle frazioni. Il metodo può essere facilmente regolato ad altri modelli biologici.

Introduzione

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Regolazione dell'espressione genica in cellule è controllata da meccanismi trascrizionali, post-trascrizionale e post-traduzionali. Progressi nel sequenziamento di RNA profondo consentono lo studio dei livelli di mRNA di stazionario su scala genomica a un livello senza precedenti. Tuttavia, recenti scoperte hanno rivelato che il livello di mRNA allo steady-state non correla sempre con proteina produzione1,2. Il destino di una trascrizione individuale è molto complesso e dipende da molti fattori come stress, stimoli interni/esterni, ecc. Regolazione dell'espressione genica durante la sintesi delle prot....

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Protocollo

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Tutti i trattamenti degli animali e la gestione dei tessuti ottenuti nello studio sono state eseguite secondo protocolli approvati dal comitato di utilizzo presso la Texas Tech University Health Science Center secondo il National Institutes of e istituzionali Animal Care Salute benessere animale linee guida, numero di protocollo 96005. Si prega di sacrificare animali vertebrati e preparare tessuti secondo le linee guida del Comitato di uso e istituzionali Animal Care. Se in mancanza di tale comitato, consultare le linee guida sul benessere degli animali di National Institutes of Health. Adulto (> 60 giorni di età) sono stati utilizzati topi C57BL/6. Tutti gli animali ....

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Risultati

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In questo studio, descriviamo l'applicazione della tecnica di profilatura polisomici a tre diverse fonti: parassita maggiore di Leishmania, cellule umane coltivate e testicolo di topo. Leishmania cellule crescono liberamente in mezzi liquidi in sospensione, cellule umane coltivate crescono nello strato monomolecolare del aderente su piastre e testicolo del mouse rappresenta un campione di tessuto. Il metodo può essere facilmente regolato a altri tipi di cellule liberamen.......

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Discussione

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Frazionamento di polisoma di gradiente di saccarosio combinato con RNA e proteina analisi delle frazioni è un metodo potente per analizzare stato traduzionale di singoli mRNA o l'intero translatome e anche ruoli di fattori proteici regolazione traduzionale macchinari durante il normale stato fisiologico o malattia. Profilatura polisomici è una tecnica particolarmente adatta per studiare la regolazione traduzionale in organismi come trypanosomatids tra cui Leishmania dove controllo trascrizionale è praticamente a.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano Ching Lee per aiuto con la registrazione audio. La ricerca è stata sostenuta dai fondi di Start-up da Texas Tech University Health Sciences Center e per il centro di eccellenza per neuroscienze traslazionali e Therapeutics (CTNT) concede PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW a A.L.K.; in parte da grant di NIH R01AI099380 K.Z. James C. Huffman e Kristen R. Baca erano studiosi CISER (centro per l'integrazione di staminali formazione & ricerca) e sono stati sostenuti dal programma.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Instruments:
Gradient masterBiocomp Instruments Inc.108
Frazionatore a gradiente a pistoneBiocomp Instruments Inc.152
Raccoglitore di frazioniGilson, Inc.FC203B
NanoDrop OneThermo ScientificNanoDrop One
Nikon microscopio invertitoNikonECLIPSE Ts2-FL/Ts2
2720 TermociclatoreApplied Biosystems by Life Technologies4359659
CO2 incubatorePanasonic Healthcare Co.MCO-170A1CUV
HERATHERM incubatoreThermo Scientific51028063
Cabina di Sicurezza Biologica, classe II, tipo A2NuAire Inc.NU-543-400
Congelatore Revco RevcoTechnologiesULT1386-5-D35
Beckman L8-M UltracentifugeBeckman ColtroL8M-70
CentrifugaEppendorf5810R
CentrifugaEppendorf5424
Ultracentrifuga Rotore SW41Beckman Coulter331362
Rotore a secchiello oscillanteEppendorfA-4-62
Rotore ad angolo fissoEppendorfF-45-30-11
Quant Studio 12K Flex Macchina per PCR in tempo reale 285880228Applied Biosystems by life technologies4470661
TC20 Contatore cellulare automatizzatoBio-Rad145-0102
EmatocitometroHausser Scientific02-671-51B
Software 
Software triax Strumenti Biocomp Inc.
Materiali:
Vetrini di conteggio, doppia camera per contatore di celluleBio-Rad145-0011
Provetta per microcentrifuga da 1,5 mLUSA Scientific1615-5500
Provette per centrifuga polyclear open-top, (14 mm x 89 mm)Siringa Seton Scientific7030
, 5 mLBD
BD 3 mL23 Ago da 1 polliceBD10020439
Piastra di superficie Nunclon Delta, 14 cmThermo Scientific168381
Nunclon Delta Piastra di superficie, 9 cmThermo Scientific172931
Nalgene unità filtro a flusso rapido da 90 mm, 500 mL, 0,2 aPESThermo Scientific569-0020
BioLite 75 cm3Thermo Scientific130193
Nunc 50 mL provette coniche da centrifugaThermo Scientific339653
Chemicals:
Trizol LSAmbion di Life Technologies10296028
HEPESFisher ScientificBP310-500
Trizma baseSigmaT1378-5KG
Glucosio medio-alto dell'aquila modificata di Dulbecco (DMEM)SigmaD6429-500ML
Siero fetale bovino (FBS)SigmaF0926-50ML
Penicillina-Streptomicina (P/S)SigmaP0781-100ML
Lipofectamina 2000Invitrogen11668-019
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco ( DPBS)SigmaD8537-500ML
Cloruro di magnesio esaidrato (MgCl2x6H2O)Acros OrganicsAC413415000
Cloruro di potassio (KCl)SigmaP9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40)Fluka (Sigma-Aldrich)74385
Inibitore ribonucleasi della RNASINA ricombinantePromegaN2511
Eparina sale di sodioSigmaH3993-1MU
cOmplete Mini inibitori della proteasi senza EDTA RocheDiagnostics11836170001
GlicogenoThermo ScientificR0551
AcquaSigmaW4502-1L
CicloesimideSigmaC7698-1G
CloroformioFisher Scientific194002
Ditiotreitolo (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Bromuro di etidioFisher ScientificBP-1302-10
Acido etilendiamminotetraacetico disodico disodico (EDTA)Fisher ScientificS316-212
OptimemLife Technologies22600050
Puromicina dicloridratoSigmaP8833-100MG
SaccarosioFisher ScientificS5-3KG
Soluzione di tripsina-EDTASigmaT4049-100ML
Hgh Capacità cDNA Kit di trascrittasi inversaBiosistemi applicati da tecnologie di vita4368814
Power SYBR Green PCR Master MixBiosistemi applicati da tecnologie di vita4367659
HClFisher ScientificA144SI-212
IsopropanoloFisher ScientificBP26324
Idrossido di potassio (KOH)Sigma221473-500G
Anticorpo anti-RPL11Abcamab79352
Proteina ribosomiale S6 (C-8) anticorpoSanta Cruz Biotechnology Inc.sc-74459
1xM199SigmaM0393-10X1L
Cloruro di litioSigmaL-9650
Dimetil solfossido (DMSO)Fisher ScientificD128-500
Gel Loading Buffer IIThermo ScientificAM8546G
UltraPure AgarosioThermo Scientific16500-100
Acido tricloroacetico (TCA)Fisher ScientificA322-100
SuperSignal West Pico PLUS substrato chemiluminescenteThermo Scientific34580
FormaldeideFisher ScientificBP531-500
Sodio Dodecil solfato (SDS)SigmaL5750-1KG
Fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)SigmaP7626-5G
RNeasy Mini kitQiagen74104
Adenosina 5′-trifosfato sale disodico idrato (ATP)SigmaA1852-1VL
Citosina 5'-trifosfato sale disodico idrato (CTP)SigmaC1506-250MG
Uridina 5'-trifosfato sale trisodico idrato (UTP)SigmaU6625-100MG
Guanosina 5'-trifosfato sale sodico idrato (GTP)SigmaG8877-250MG
SP6 RNA polimerasiNEBM0207S
pirofosatasiSigmaI1643-500UN
spermidinaSigmaS0266-1G
Siringa 309646

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host.

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Gradiente di saccarosioultracentrifugazionepreparazione del lisatoraccolta delle frazionianalisi dell RNAWestern blotassociazione ribosomialeregolazione della traduzioneorganismi modello

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