Gene candidato test negli studi clinici di coorte con genotipizzazione multiplex e spettrometria di massa

Sommario

Identificazione di varianti genetiche che contribuiscono alla malattia umana complessa permette di identificare nuovi meccanismi. Qui, dimostriamo un approccio di genotipizzazione multisala di geni candidati o analisi dei percorsi gene che massimizza la copertura a basso costo ed è favorevole agli studi di coorte.

Abstract

Malattie complesse sono spesso sostenuti dalla più comuni varianti genetiche che contribuiscono alla suscettibilità di malattia. Qui, descriviamo un approccio di polimorfismo (SNP) di singolo nucleotide conveniente tag usando un'analisi di genotipizzazione multiplex con spettrometria di massa, per studiare gene via associazioni in coorti cliniche. Studiamo il luogo del candidato allergia alimentare Interleukin13 (IL13) come esempio. Questo metodo, in modo efficiente, massimizza la copertura approfittando di squilibrio condivisa (LD) all'interno di una regione. Selezionato LD SNPs sono quindi progettati in un'analisi multiplex, consentendo fino a 40 diversi SNPs essere analizzati simultaneamente, aumentando la redditività. Reazione a catena della polimerasi (PCR) viene utilizzata per amplificare i loci di destinazione, seguiti dall'estensione di singolo nucleotide, e gli ampliconi sono quindi valutati con matrix-assisted laser desorption/ionizzazione-tempo di spettrometria di massa flight(MALDI-TOF). L'uscita raw viene analizzata con il genotipo di chiamare un software, utilizzando le definizioni di controllo di qualità rigoroso e cut-off, e genotipi di alta probabilità sono determinati e output per l'analisi dei dati.

Introduzione

Nella malattia umana complessa, varianti genetiche contribuiscono alla suscettibilità di malattia e quantificare queste varianti possono essere utili per la patogenesi di comprensione, identificare gruppi di pazienti ad alto rischio e trattamento risponditori. Infatti, la promessa della medicina di precisione dipende che utilizzano informazioni genomiche per identificare sottogruppi di pazienti¹. Purtroppo, all'interno dello spazio di biologia della malattia complessa, dove i fenotipi di malattia sono sostenuti dalla sostanziale eterogeneità genetica, bassa penetranza ed espressività variabile, coorte dimensioni requisiti per approcci di genoma identificare romanzo i candidati sono spesso eccessivamente grande². In alternativa, un approccio del gene candidato mirata comincia con un'ipotesi aprioristicamente su specifici geni/pathways in eziologia di malattia³. Strumenti di analisi del percorso sono comunemente utilizzati per studiare la patofisiologia di loci un target identificati, generando numerose vie di candidato di essere esplorato. Qui dimostriamo un approccio di genotipizzazione multiplex che consente per l'indagine di decine o centinaia di SNPs con un saggio, adatto a studi di coorte umano⁴. Questo approccio è relativamente alta attraverso-metta, permettendo a centinaia di migliaia di campioni di DNA per essere genotipizzati per studi di romanzo scoperta e studio delle specifiche vie. I metodi descritti qui sono utili per identificare gli alleli di rischio e le loro associazioni con caratteristiche cliniche in modo relativamente rapido e poco costoso. Questa piattaforma è stata estremamente vantaggiosa per screening e diagnostica fini^5,6e più recentemente, per l'infezione microbica⁷ e⁸di papillomavirus umano.

Questo protocollo inizia con la selezione di un set di geni per le indagini, i. e., le regioni di destinazione, in genere determinate attraverso ricerche di letteratura o aprioristicamente ipotesi per il coinvolgimento nel processo di malattia; o forse selezionata per la replica come le più importanti associazioni di uno studio di associazione genome-wide (GWA) scoperta. Dal set di gene, il ricercatore selezionerà una raffinata lista di tag SNPs. Vale a dire la squilibrio (LD), o la correlazione tra varianti nella regione viene utilizzato per identificare un rappresentante 'modifica SNP' per un gruppo di SNPs in alto LD, conosciuto come un aplotipo. Il LD alta della regione significa che gli SNPs sono spesso ereditati insieme tale che genotyping uno SNP è sufficiente per rappresentare la variazione a tutti gli SNPs nell'aplotipo. In alternativa, se in seguito su un elenco definitivo di SNPs da molte regioni, ad es., replica per uno studio GWA, questo processo può essere inutile. Per la genotipizzazione multiplex, un'analisi quindi devono essere progettata intorno a questi obiettivi tale che i primer di amplificazione sono di massa differenti a quelle dei primer extension e prodotti per produrre interpretabile spettri di massa. Questi parametri sono facilmente implementati da uno strumento di progettazione di test di genotipizzazione multiplex. I primer forward e reverse da questo progetto servirà per mirare i marcatori di interesse e per amplificare la sequenza contenente il SNP. I primers di estensione allegare direttamente prossimale per gli SNPs e una base di 'terminator' singola, Ultima modifica di massa, che è complementare al SNP è aggiunto. La base di terminator impedisce l'ulteriore estensione del DNA. La massa-modifica della base consente di frammenti diversi di un'unica base per essere rilevato mediante spettrometria di massa. La piastra che contiene la chimica di genotipizzazione viene quindi applicata a un chip per la misura su una piattaforma di spettrometria di massa. Dopo l'applicazione di adeguati controlli di qualità per le chiamate di genotipizzazione grezzi rilevate dal sistema, i dati possono essere esportati e utilizzati per l'analisi statistica per verificare l'associazione con i fenotipi di malattia.

Protocollo

Il materiale genetico utilizzato nel presente documento eticamente è stato approvato per l'uso da parte dell'ufficio per bambini HREC (Comitato etica di ricerca umano) (CDF/07/492), il dipartimento di servizi umani HREC (10/07) e Hospital (RCH dei bambini Royal) HREC (27047).

1. progettazione l'analisi multiplex

1. Preparare una lista SNP per progetto assay.
   1. Ingresso della regione di destinazione nella funzione tagger di Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Utilizzare il LD (correlazione, r²) fra SNPs che attraversa la regione di destinazione per generare un elenco di SNPs, che fornisce una copertura completa dell'area desiderata con il minor numero di varianti necessarie. Generare un elenco di SNPs in modo tale che tutti gli alleli per essere catturati sono correlati di sopra una soglia definita dall'utente (ad es., r² ≥ 0,8).
2. Identificazione di sequenze adatte per primer forward, reverse ed estensione
   1. Inserire la lista generata di SNPs lo strumento di progettazione di test di scelta.
      Nota: Le istruzioni seguenti si applicano per lo strumento di progettazione di test utilizzato per generare i risultati rappresentativi, come specificato nella Tabella materiali.
   2. Una volta che è stato lanciato lo strumento di progettazione di test, selezionare Nuovo Design di genotipizzazione. Immettere un nome per la progettazione di test nel campo Nome di Design .
   3. Fornire l'elenco SNP generato nel passaggio 1.1.1 facendo clic sul pulsante Modifica Input di testo con le istruzioni rs o FASTA a sinistra del pulsante.
      Nota: SNPs può essere inserito come un elenco di testo di riferimento (rs) SNP IDs o caricato in formato FASTA, o il formato di file di gruppo di SNP utilizzato dallo strumento. Per caricare i file in questi formati, selezionare il pulsante di Caricamento File . Il limite superiore di varianti che possono essere progettati in una sola analisi, definita 'Beh,' è 40 SNPs. È possibile specificare SNPs che sono una priorità per il disegno prima di iniziare l'esecuzione; questi saranno progettati in primo luogo. SNPs di controllo possono essere specificati: ad esempio, è stato aggiunto un test per rilevare il genere in caso di campione mix up o un controllo per determinare tale modello sufficiente se lavora con qualità scarsa o DNA. Tuttavia, dovrebbe essere notato che usando controllo e priorità SNPs può ridurre il numero di SNPs che può essere progettato in un unico bene.
   4. Dal menu predefinito , selezionare l'opzione alta Multiplexing iPLEX Preset . Selezionare il menu organismo l'organismo da cui deriva il DNA per essere genotipizzati. Per i risultati rappresentativi presentati qui, questo era umano.
      Nota: Mouse e bovina organismi sono anche compatibili con lo strumento. Uno può anche selezionare altri se funziona con un organismo alternativo come la pianta o il microbo; Tuttavia, i passaggi automatizzati per trovare SNPs prossimale e aree di primer ottimale non sarà disponibili a causa dell'assenza di un genoma di riferimento.
   5. Nel menu Database , selezionare l'ultima build del genoma, o una compilazione alternativa, se necessario, dal menu di chimica . Selezionare iPLEX e per il campo Livello di Multiplex , immettere il massimo livello di multiplazione: 40. Selezionare ora, Iniziare a correre. "Step 1" dello strumento avrà inizio.
      Nota: Durante la fase 1, lo strumento recupera e formatta le sequenze SNP. Qui, errori potrebbero includere la formattazione del file FASTA nel qual caso il file FASTA dovrebbe essere controllato e riformattato come necessario. Un altro errore è SNP rs numeri che sono state fuse con un altro numero di rs, nel quale caso il numero di rs dovrebbe essere cercato in un database SNP ad esempio dbSNP di NCBI per identificare il nuovo numero di rs SNP. Sequenze attorno allo SNP sono cercati qualsiasi noto SNPs prossimale che potrebbero interferire con il disegno dell'iniettore. Potenziali siti di primer PCR vengono confrontati con il genoma per evitare l'amplificazione non specifiche a causa di colpi multipli nel genoma.
   6. Attendere il completamento della "Fase 2" dello strumento di progettazione in cui si individueranno SNPs prossimale.
      Nota: Se si utilizza un organismo che non è supportato da questo passaggio, annotare le sequenze con SNPs prossimale nell'annotazione di IUPAC se questa informazione è disponibile. Raramente ci sono errori durante questo passaggio; Tuttavia, possono verificarsi errori se l'organismo di riferimento sbagliato o il genoma è stato selezionato o sequenze del cDNA sono stati inseriti piuttosto che di DNA genomic. Per ottimizzare il passaggio 2, impostazioni Avanzate, è possibile filtrare fuori SNPs basato su una popolazione se lavorano all'interno di una popolazione specifica. SNPs rari possono essere filtrati anche escludendo quelli con una frequenza inferiore all'1%. Infine, SNPs che non hanno uno stato convalidato o non dispongono di informazioni della popolazione può essere escluso anche se lo si desidera.
   7. Attendere il completamento delle regioni "Step 3" dello strumento di progettazione che identifica primer ottimale. Se si preferisce posizioni primer sono stati identificati, o se funziona con un organismo diverso, inserire manualmente posizioni primer annotando la sequenza di input (i file di gruppo SNP) con le regioni di primer preferito in lettere maiuscole e il resto della sequenza in basso caso, selezionare Caso preservare dal menu impostazioni avanzate per questo passaggio.
      Nota: Errori per i passaggi 2 e 3 possono includere: A (1) SNP prossimale bloccando il design di un primer con la soluzione di mascherare con un modello di non base e ordinare un oligo con una base universale come Isonine o, disegnare due primers, uno con ciascuno degli alleli del proxim al SNP, o un primer design con l'allele comune solo. (2) un altro errore comune è l'incapacità di identificare un sito unico per il primer con la soluzione è modificare la lunghezza di amplicon al fine di individuare un unico sito. Nello strumento utilizzato per questa carta, il valore predefinito è 80-120 bp. Questo può essere modificato da bp 60-400 nella finestra di dialogo Impostazioni avanzate sotto le impostazioni di lunghezza di Amplicon in "3. Identificare le aree di Primer ottimale"e anche sotto la scheda di Amplicon di"4. Saggi di design." Assicurarsi che entrambi sono cambiati. Tuttavia, dovrebbe essere notato che l'aumento della lunghezza del amplicon quando usando degradata del DNA non è raccomandato.
   8. Attendono il completamento del passaggio di progettazione del test (strumento "passaggio 4" del design), qui lo strumento mira a fornire pass ottimale separazione tra i primer di estensione e gli alleli di tutti gli SNPs nei disegni multiplexati. Dopo avere completato questo passaggio, è necessario esportare il file di Oligo ordine, che è stato formattato per ordinare in modo semplice attraverso un oligo ordine fornitore di scelta.
      Nota: Il primer di amplificazione (in avanti (F) e retro (R)) sono progettati per produrre una dimensione ottimale amplicon di 80-120 bp. Il primer di amplificazione massa deve differire da quella del primer di estensione e il suo prodotto per evitare risultati contraddittori nello spettro di massa e per le prestazioni complessive di PCR. Il primer estensione dovrebbe essere 15-30 nucleotidi lunghi (Da 4.500-9.000), progettati in modo che l'estremità 3' attribuirà direttamente adiacente al luogo del polimorfismo. Tutte queste impostazioni vengono impostate automaticamente nello strumento utilizzato per generare i risultati rappresentativi.
3. Esportare il disegno dai primer tool e ordine selezionati da un provider di oligomero: 25 nmol di ciascuno dei primer PCR (avanti e indietro) e 100 nmol di ciascuno dei primer estensione. Vedere la tabella 1 per i primers utilizzati per generare i risultati rappresentativi.

2. genotipizzazione (1-2 giorni)

1. Preparare i primer di amplificazione.
   1. Se primer liofilizzato sono state ordinate, ricostituire con acqua grado molecolare. Utilizzare una concentrazione di 100 μM/μL per primer forward e reverse e 500 μM/μL per estensione.
   2. Piscina avanti & indietro gli iniettori per ogni dosaggio multiplex in un mix di primer d'archivio, contenente ogni primer ad una concentrazione di 0,5 mM.
      Nota: per esempio, una piscina di primer 400 μL per 400 reazioni:
      
      2 μL di ogni primer, ad una concentrazione di 100 μM/μL, è richiesto per il pool di riserva primer. Per un dosaggio di 30-plex con 60 primer forward e reverse, un totale di 120 µ l di primer sarebbe necessaria (la piscina di primer concentrato). 280 μL grado molecolare acqua sarebbe poi essere aggiunto per rendere un volume finale di 400 µ l di primer mix.
2. Amplificazione mediante reazione a catena della polimerasi (PCR)
   1. Fare un mix master per la PCR contenente 100 nM del mix primer sopraelencati, 500 μM di dNTPs, 2 mM di MgCl₂e 0,5 U di un enzima DNA polimerasi. È necessario per maggiore di 26-plex saggi 1 U. Riferimento alla tabella 2.
   2. Aggiungere 4 μL di questo mix in ciascun pozzetto della piastra PCR 384 pozzetti, insieme con 1 μL di DNA genomic ad una concentrazione di 5-10 ng/μL.
      Nota: controlli di qualità devono essere inclusi anche sul piatto, ad esempio un controllo non template e un controllo positivo che ha precedentemente eseguito bene con il dosaggio (durante l'esecuzione di un test). Se in esecuzione piastre multiple, multiple DNA campioni dalle altre piastre, ad es., in triplice copia, deve essere eseguito come controlli tecnici per variabilità inter-supporto.
   3. Centrifugare la piastra a 200 x g per 1 min a temperatura ambiente con una piastra di copertura per garantire tutto il liquido è contenuto nella parte inferiore dei pozzetti della piastra.
   4. Eseguire la PCR con le seguenti condizioni di thermocycler: incubazione di 4 min a 94 ° C per attivare la polimerasi del DNA; 45 cicli dei seguenti (denaturazione a 94 ° C per 20 s, ricottura a 56 ° C per 30 s e l'estensione a 72 ° C per 1 min) e quindi un'estensione finale a 72 ° C per 3 min. fare riferimento al programma PCR nella tabella 3.
   5. Eseguire l'elettroforesi del gel dell'agarosi per garantire che l'amplificazione del DNA è successo. Utilizzare 1 µ l di prodotto di PCR (con 3 µ l di tampone di caricamento) su un gel di agarosio 2% (p/v), fatto mescolando la polvere di agarosio e 0,5% tampone Tris Borato EDTA (TBE) ed eseguire per 45 min a 100 V.
3. Fase di purificazione della fosfatasi alcalina (SAP) di gamberetti
   Nota: Questo passaggio viene utilizzato per rimuovere nucleotidi non incorporate. L'enzima SAP si unirà gruppi fosfato per impedire non incorporata dNTP e primer in eccesso di interferire nella reazione imminente estensione.
   1. Fare un master mix contenente 1.7 unità/μL di enzima fosfatasi alcalina gamberetti (SAP), 10 x SAP buffer e portare a volume con acqua grado molecolare. Riferimento alla tabella 4.
   2. Aggiungere 2 μL di appena fatte a SAP master mix in ciascun pozzetto della piastra, già contenenti 5 μL dalla reazione di PCR. Centrifugare brevemente e tornare al termociclatore a 37 ° C per 40 min e poi a 85 ° C per 5 min per inattivazione enzimatica. Fare riferimento alla tabella 5.
4. Reazione di estensione di primer
   Nota: La concentrazione dei primer estensione nel mix primer estensione deve essere regolata dimensioni (regolazione lineare Primer – LPA). Questo è perché c'è una relazione inversa in intensità di picco (su spettri di massa) e prodotto massa. Regolazione della concentrazione di primer estensione corregge questo rapporto di produrre picchi di uguale intensità. Regolato il primer usati per generare il rappresentante i risultati sono riportati nelle tabelle 6 e 7. I volumi sono forniti per generare 1,5 mL di miscela di primer di estensione.
   1. Calcolare i fattori di diluizione per ciascun primer utilizzando un algoritmo di sfumato, disponibile da Agena Biosciences ('Primer regolazione lineare'), che regola per la massa e la concentrazione di primer e il numero totale degli iniettori nella reazione multiplex (Vedi Nelle tabelle 6 e 7). Inserire la massa UEP per ciascun primer nel campo UEP_MASS della scheda di regolazione lineare del Primer.
      Nota: La concentrazione di massa rettificata per il primer sarà calcolata automaticamente nella cella con il testo di intestazione "Concentrazione di reazione Target (µM)." Il volume di primer per essere aggiunto al pool di primer verrà realizzato nella cella sotto il testo dell'intestazione "Volume Stock Primer da aggiungere al Pool (µ l)." Il volume di acqua da aggiungere al pool di primer per compensare le concentrazioni calcolate è uscito nella cella accanto al testo "Volume di PCR Grade RNasi free H₂O essere aggiunto Primer Pool (µ l)."
   2. Prendere il volume di ogni primer come specificato nel file di regolazione lineare di Primer e costituiscono un pool di primer. Aggiungere il volume di acqua calcolato dall'algoritmo di diluire la piscina di primer come determinato al punto 2.4.1.
      Nota: Se il metodo di algoritmo sfumatura non è disponibile, un altro metodo è dividere i primer in massa bassa e alta massa e aggiungere il doppio della concentrazione dei primer massa alta rispetto al gruppo basso di massa. Gruppi di tre o quattro possono essere richiesti per un dosaggio alto-plex (vale a dire più di 19 SNPs). Tuttavia, questo metodo non produrrà come tassi di chiamata ottimale come il metodo di algoritmo sfumatura.
   3. Assemblare il mix master estensione. Per il dosaggio di plex basso (1-18 plex), aggiungere 0,2 μL di tampone, 0,1 μL di miscela di terminazione, 0.94 μL di mix di primer LPA regolata e 0.0205 μL di enzima (preparato sul ghiaccio). Per il dosaggio di plex alta (19-36 plex), aggiungere doppia concentrazione del mix di terminazione e degli enzimi (terminazione mix 0,2 μL e iPLEX enzima 0,041 μL). Fare riferimento alla tabella 8.
   4. Aggiungere 2 μL del mix master di reazione di estensione alla piastra dalla reazione precedente, ora portando il volume totale a 9 μL per pozzetto. Centrifugare brevemente e posto nel termociclatore: 94 ° C per un'incubazione iniziale di 30 s, 40 cicli di 1 x 94 ° C per 5 s con 5x (52 ° C per 5 s, seguita da 80 ° C per 5 s) e poi a 72 ° C per 3 min. fare riferimento alla tabella 9.
5. Purificazione di resina.
   Nota: I sali in eccesso possono essere rimosso ora dalla reazione con l'uso di resina.
   1. Aggiungere 16 μL di acqua deionizzata per i pozzetti della piastra Estratto, portando il volume della piastra fino a 25 μL.
   2. Applicare la resina, solitamente 6 mg di resina piastra (acquistato separatamente), in modo uniforme a tutta la piastra. Lasciare la resina ad asciugare nella piastra di resina per 20 min a temperatura ambiente prima di applicare la piastra di reazione. Dopo l'aggiunta della resina, ruotare la piastra per 5 min a temperatura ambiente o a mano o con un miscelatore di sospensione a bassa velocità (ad es., 7,5 giri/min).
      Nota: Prima di caricare l'analita di genotipizzazione sul chip genotipizzazione, i campioni e il layout di dosaggio devono essere input nell'interfaccia del software. Ciò può essere ottenuto utilizzando il file di riepilogo Design dallo strumento di progettazione di dosaggio.
6. Misura su una piattaforma di spettrometria di massa.
   1. Centrifugare la piastra a 3.200 x g per 5 min evitare l'applicazione di resina per il chip di spettri di massa.
   2. Caricare il layout di piastra di campioni di interfaccia del software del sistema prima della fuga.
      Nota: Passaggio 2.6.3 dovrebbe essere eseguita solo da personale addestrato.
   3. Applicare la miscela di analita di genotipizzazione dalla piastra al chip genotipizzazione con un sistema di erogazione. Successivamente, caricare il chip sul sistema MALDI-TOF per generare gli spettri di massa dalla miscela dell'analita, che può quindi essere interpretata con l'ausilio dell'interfaccia software della piattaforma.
      Nota: Il sistema genera gli spettri di massa di dirigere i brevi impulsi di luce UV a ogni 'pad', corrispondente a un singolo pozzetto della piastra di genotipizzazione, del chip spettri di massa. Questo impulso si traduce in desorbimento e ionizzazione dell'analita. Questi ionizzato DNA molecole sono azionati quindi alla parte superiore del tubo a vuoto di un campo elettrostatico ad alta tensione, separare gli ioni più leggeri, che viaggiano più velocemente e raggiungono il rivelatore in primo luogo, dagli ioni più pesanti. Il "tempo di volo" di questi analiti è registrato dal sistema, da cui la massa di ogni frammento di DNA può essere determinata e così si può dedurre la base del nucleotide presente presso il Parco nazionale svizzero.

3. genotipizzazione dati

Nota: controllo di qualità e interpretazione dei dati non sono il focus di questo lavoro di metodologia. Tuttavia, di seguito brevemente coprirà interpretazione degli spettri totali.

1. Controllo manuale e controllo di qualità di spettri di massa.
   Nota: I crudi spettri di massa sono generati dal sistema e analizzati con il software, come elencato nella Tabella materiali. Una miscela gaussiana metodo di clustering è applicata a questa uscita per effettuare chiamate di genotipizzazione probabilistica.
   1. Aprire il software di analisi. Selezionare Analyzer Typer. Dal menu File , selezionare Pozzi aperti da File e selezionare il file xml con i dati dello spettro generati nel passaggio 2.6.3. Il nome del chip per la corsa dovrebbe essere visibile, selezionarlo e verrà visualizzato un riquadro di "semaforo" della piastra 384 pozzetti con un elenco di SNPs in selezionato bene. Da qui, selezionare Chiamata Cluster trame per visualizzare un scatterplot dei punti dati per ogni SNP.
      Nota: È consigliabile che un risultato di 'nessuna chiamata' essere applicata per bassa intensità SNPs. Nel software utilizzato per i risultati rappresentativi, un clustering magnitudo cut-off di 5, che è superiore al valore predefinito, è suggerito per controllo di qualità rigoroso. Questa impostazione può essere regolata nel campo di Cutoff di grandezza sotto i parametri nel riquadro Post Processing cluster . Dalla scheda strumenti per eseguire un'analisi di cluster, selezionare Autocluster .
   2. Eseguire controllo manuale di genotipo chiamate esaminando le piazzole cartesiane nel riquadro Post elaborazione. Nel riquadro di analisi, selezionare il SNP di interesse e fare clic sulla scheda Cluster di post-elaborazione , una trama di cluster con genotipo clustering sarà visibile con ID campione e genotipi corrispondenti per il SNP.
   3. I cluster di chiamata genotipo di esaminare e valutare quanto bene ogni singola chiamata cluster con le altre chiamate per lo SNP. Il software fornisce alcune linee di contorno sulla trama per ciascun genotipo per l'orientamento; vedere l'esempio di un genotipo chiamate cluster plot da un IL13 SNP (Figura 1). Se la chiamata non cluster strettamente con altre chiamate e si trova chiaramente di fuori di un cluster, o se ha un'intensità molto bassa, fare clic destro il datapoint e selezionare Cambia chiamare impostarlo manualmente No chiamare.
   4. Per garantire dati di genotipizzazione di alta qualità sono utilizzati per l'analisi a valle, escludere SNPs e individui con tassi di chiamata sotto una soglia QC, ad esempio il 90%. Dopo aver effettuati gli opportuni adattamenti per i dati della chiamata, è possibile esportare i dati per le applicazioni statistiche. Nel software utilizzato per generare i risultati rappresentativi (elencati nella Tabella materiali) ciò si ottiene con la selezione di Dati di targa dal menu Visualizza e selezionando Salva con nome.

Risultati

Con il protocollo descritto in precedenza, abbiamo genotipizzati tag SNPs attraverso il gene immune Th2 IL13 in una coorte di cibo allergia casi e controlli⁹. Abbiamo applicato l'analisi di regressione logistica, regolato per l'ascendenza e altri potenziali covariate verificare se le varianti genetiche all'interno della regione di interesse aumentato rischio di allergia alimentare. Tabella 10 ⁹ dimostra che una vari...

Discussione

Qui, dimostriamo che il metodo di genotipizzazione multiplex utilizzando la spettrometria di massa. I risultati rappresentativi sono stati generati usando la PCR abbinata a spettrometria di massa⁴ con chimica analisi elencati nella Tabella materiali¹³MALDI-TOF. Con questa piattaforma, abbiamo generato un totale di 11.295 genotipi su 1.255 individui per 9 SNPs all'interno di 40 h in laboratorio.

Vi illustriamo l'utilità della tecn...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DNA genomico	-	-	1 μ L a una concentrazione di 5-10 ng/μ L
Primer: amplificazione ed estensione diretta e inversa	IDT	-	vedi sezione 1.2.1 del manoscritto sulla progettazione di primer
Acqua deionizzata	Ad esempio, l'acqua Milli-Q	-	deionizzato con 18,2 MΩ. Kit
reagenti per genotipizzazione. iPLEX Gold Set di reagenti per la chimica	Agena Bioscience	#10148-2	include tutti i reagenti per le reazioni in 2.2.1, 2.3.1 e 2.4.2 , chip e
piastre PCR in resina (384 pozzetti)	Abgene	#ABGAB-1384	Per il sistema MassARRAY le piastre di Abgene sono compatibili
Micropipette			a singolo e a 8 canali
Centrifuga			compatibile con piastre a 384 pozzetti
Termociclatore			compatibile con i programmi PCR come descritto nei punti 2.2.4, 2.3.2 e 2.4.3
Piastra in resina punzonata	Agena Bioscience		6mg, rotatore per piastre a 384 pozzetti
Analizzatore MassARRAY 4 Sistema	Agena Biosciences		MALDI-TOF (desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice – tempo di volo) Spettrometro di massa.
RS1000 Nanodispenser	Agena Biosciences
Assay Design Suite	Agena Biosciences		Strumento utilizzato per progettare i saggi di genotipizzazione multiplex
Hot Start Taq			DNA polimerasi enzima
Resina	Agena Biosciences		Fornito con kit iPLEX