Identificazione di varianti genetiche che contribuiscono alla malattia umana complessa permette di identificare nuovi meccanismi. Qui, dimostriamo un approccio di genotipizzazione multisala di geni candidati o analisi dei percorsi gene che massimizza la copertura a basso costo ed è favorevole agli studi di coorte.
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Articolo metodologico
Gene candidato test negli studi clinici di coorte con genotipizzazione multiplex e spettrometria di massa
In questo articolo
Sommario
Abstract
Malattie complesse sono spesso sostenuti dalla più comuni varianti genetiche che contribuiscono alla suscettibilità di malattia. Qui, descriviamo un approccio di polimorfismo (SNP) di singolo nucleotide conveniente tag usando un'analisi di genotipizzazione multiplex con spettrometria di massa, per studiare gene via associazioni in coorti cliniche. Studiamo il luogo del candidato allergia alimentare Interleukin13 (IL13) come esempio. Questo metodo, in modo efficiente, massimizza la copertura approfittando di squilibrio condivisa (LD) all'interno di una regione. Selezionato LD SNPs sono quindi progettati in un'analisi multiplex, consentendo fino a 40 diversi SNPs essere analizzati simultaneamente, aumentando la redditività. Reazione a catena della polimerasi (PCR) viene utilizzata per amplificare i loci di destinazione, seguiti dall'estensione di singolo nucleotide, e gli ampliconi sono quindi valutati con matrix-assisted laser desorption/ionizzazione-tempo di spettrometria di massa flight(MALDI-TOF). L'uscita raw viene analizzata con il genotipo di chiamare un software, utilizzando le definizioni di controllo di qualità rigoroso e cut-off, e genotipi di alta probabilità sono determinati e output per l'analisi dei dati.
Introduzione
Nella malattia umana complessa, varianti genetiche contribuiscono alla suscettibilità di malattia e quantificare queste varianti possono essere utili per la patogenesi di comprensione, identificare gruppi di pazienti ad alto rischio e trattamento risponditori. Infatti, la promessa della medicina di precisione dipende che utilizzano informazioni genomiche per identificare sottogruppi di pazienti1. Purtroppo, all'interno dello spazio di biologia della malattia complessa, dove i fenotipi di malattia sono sostenuti dalla sostanziale eterogeneità genetica, bassa penetranza ed espressività variabile, coorte dimensioni requisiti per approcci di genoma....
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Protocollo
Il materiale genetico utilizzato nel presente documento eticamente è stato approvato per l'uso da parte dell'ufficio per bambini HREC (Comitato etica di ricerca umano) (CDF/07/492), il dipartimento di servizi umani HREC (10/07) e Hospital (RCH dei bambini Royal) HREC (27047).
1. progettazione l'analisi multiplex
- Preparare una lista SNP per progetto assay.
- Ingresso della regione di destinazione nella funzione tagger di Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Utilizzare il LD (correlazione, r2) fra SNPs che attraversa la regione di destinazione per generare un elenco di SNPs, che fornisce u....
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Risultati
Con il protocollo descritto in precedenza, abbiamo genotipizzati tag SNPs attraverso il gene immune Th2 IL13 in una coorte di cibo allergia casi e controlli9. Abbiamo applicato l'analisi di regressione logistica, regolato per l'ascendenza e altri potenziali covariate verificare se le varianti genetiche all'interno della regione di interesse aumentato rischio di allergia alimentare. Tabella 10 9 dimostra che una vari.......
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Discussione
Qui, dimostriamo che il metodo di genotipizzazione multiplex utilizzando la spettrometria di massa. I risultati rappresentativi sono stati generati usando la PCR abbinata a spettrometria di massa4 con chimica analisi elencati nella Tabella materiali13MALDI-TOF. Con questa piattaforma, abbiamo generato un totale di 11.295 genotipi su 1.255 individui per 9 SNPs all'interno di 40 h in laboratorio.
Vi illustriamo l'utilità della tecn.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori non hanno nessun ringraziamenti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DNA genomico | - | - | 1 μ L a una concentrazione di 5-10 ng/μ L |
| Primer: amplificazione ed estensione diretta e inversa | IDT | - | vedi sezione 1.2.1 del manoscritto sulla progettazione di primer |
| Acqua deionizzata | Ad esempio, l'acqua Milli-Q | - | deionizzato con 18,2 MΩ. Kit |
| reagenti per genotipizzazione. iPLEX Gold Set di reagenti per la chimica | Agena Bioscience | #10148-2 | include tutti i reagenti per le reazioni in 2.2.1, 2.3.1 e 2.4.2 , chip e |
| piastre PCR in resina (384 pozzetti) | Abgene | #ABGAB-1384 | Per il sistema MassARRAY le piastre di Abgene sono compatibili |
| Micropipette | a singolo e a 8 canali | ||
| Centrifuga | compatibile con piastre a 384 pozzetti | ||
| Termociclatore | compatibile con i programmi PCR come descritto nei punti 2.2.4, 2.3.2 e 2.4.3 | ||
| Piastra in resina punzonata | Agena Bioscience | 6mg, rotatore per piastre a 384 pozzetti | |
| Analizzatore MassARRAY 4 Sistema | Agena Biosciences | MALDI-TOF (desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice – tempo di volo) Spettrometro di massa. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Strumento utilizzato per progettare i saggi di genotipizzazione multiplex | |
| Hot Start Taq | DNA polimerasi enzima | ||
| Resina | Agena Biosciences | Fornito con kit iPLEX |
Riferimenti
- Aronson, S. J., Rehm, H. L. Building the foundation for genomics in precision medicine. Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).
- Ball, R. D. Designing a GWAS: power, sample size, and data structure. Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction....
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Ristampe e permessi
