Articolo metodologico

Un modello In Vitro per studiare l'effetto della terapia fotodinamica 5-aminolevulinico-mediata su Staphylococcus aureus Biofilm

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DOI:

10.3791/57604

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16 aprile 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye & ENT Hospital, Shanghai Key Clinical Disciplines of otorhinolaryngology, Fudan University, 2Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, Department of Medical Microbiology and Parasitology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College of Fudan University, 3Department of Dermatology, Huashan Hospital, Fudan University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo manoscritto descrive un protocollo per studiare l'effetto antimicrobico della terapia fotodinamica mediata da acido 5-aminolevulinico (ALA-PDT) su un biofilm di Staphylococcus aureus . Questo protocollo può essere usato per sviluppare un modello in vitro per studiare il trattamento di biofilm batterici con PDT in futuro.

Abstract

Staphylococcus aureus (S. aureus) è un agente patogeno umano comune, che provoca infezioni pyogenic e sistemiche. Le infezioni da S. aureus sono difficili da sradicare non solo causa la comparsa di ceppi resistenti agli antibiotici, ma anche la capacità di forma biofilm. Recentemente, la terapia fotodinamica (PDT) è stata indicata come uno dei potenziali trattamenti per controllare le infezioni biofilm. Tuttavia, ulteriori studi sono richiesti per migliorare la nostra conoscenza del suo effetto sul biofilm batterici, come pure i meccanismi di fondo. Questo manoscritto descrive un modello in vitro di PDT con acido 5-aminolevulinico (5-ALA), un precursore del fotosensibilizzatore effettivo, la protoporfirina IX (PpIX). Maturo, brevemente, lo Staphylococcus aureus biofilm sono stati incubati con ALA e quindi esposti alla luce. Successivamente, l'effetto antibatterico di ALA-PDT il biofilm di S. aureus è stato quantificato calcolando l'unità (CFUs) di formazione di colonie e visualizzata da vitalità fluorescente colorazione tramite laser confocale microscopia (CLSM). Risultati rappresentativi hanno dimostrato un forte effetto antibatterico di ALA-PDT il biofilm di S. aureus . Questo protocollo è semplice e può essere utilizzato per sviluppare un modello in vitro per studiare il trattamento di biofilm di S. aureus con ALA-PDT. In futuro, potrebbe anche fare riferimento a studi di PDT che utilizzano altri fotosensibilizzanti per differenti ceppi batterici con minimo aggiustamento.

Introduzione

S. aureus è un importante patogeno gram-positivo che colonizza la pelle e delle mucose degli umani. Sua capacità di forma biofilm è considerato un aspetto importante della sua patogenesi1. Biofilm batterici sono una comunità di batteri incorporati in una matrice autoprodotta, che è composto di sostanze polimeriche extracellulari, inclusi polisaccaride, DNA e proteine. Questa matrice gioca un ruolo significativo nella persistenza di infezioni batteriche, che contribuiscono ad un alto grado di resistenza per il sistema immunitario umano e attuale terapie anti-microbica2. Gli antibiotici sono ancora il principale trattamento per biofilm infezioni, anche se gli effetti degli antibiotici il biofilm sono limitati. Ha dimostrato in precedenza che le cellule nei biofilm sono 10 - 1.000 volte più resistente agli antibiotici rispetto ai loro omologhi planctonici3. Così, sono necessarie strategie alternative per conquistare questo problema.

PDT, un trattamento alternativo per le infezioni batteriche, usa la luce di una lunghezza d'onda appropriata per attivare fotosensibilizzanti. Questo porta alla produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), che sono letali per le cellule bersaglio di perturbare la parete cellulare, enzimi inattivanti e danneggiare il DNA4. Questa caratteristica multi-target rende difficile per i batteri di sviluppare resistenza al trattamento PDT.

L'effetto antimicrobico di PDT il biofilm batterici e fungini, con più fotosensibilizzanti, come il blu di toluidina, verde malachite, blu di metilene, cloro e6 e porfirine, è stato studiato in precedenti relazioni5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, un profarmaco del fotosensibilizzatore effettivo, PpIX, è caratterizzato dal suo peso molecolare e uno sdoganamento rapido12,14. Questi vantaggi danno potenziale principali ALA-PDT come un'applicazione terapeutica. Anche se l'effetto di ALA-PDT sui batteri planctonici è stato studiato da molti gruppi12, l'effetto antimicrobico di ALA-PDT il biofilm batterici non è stata ancora chiarita. Nel frattempo, è difficile confrontare i risultati tra gli studi precedenti. Uno dei motivi è che i diversi protocolli vengono utilizzati da gruppi diversi. Così, questo protocollo descrive un modello in vitro di un sistema di ALA-PDT basato sul nostro lavoro precedente15. L'effetto di questo modello è stata confermata da calcolo CFU e vitalità colorazione con CLSM.

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Protocollo

1. di biofilm

  1. Formazione di biofilm a 96 pozzetti
    1. Recuperare il ceppo di Staphylococcus aureus USA300 e 3 che formano biofilm ceppi clinici (C1 - C3) conservati a-80 ° C.
      Nota: La capacità dei ceppi clinici per formare biofilm è stato determinato mediante l'analisi del piatto di microtitolo descritta precedentemente15.
    2. Inoculare il batterio nel mezzo di 5ml tryptone soya brodo (TSB) e coltivare in un incubatore con agitazione a 37 ° C durante la notte per la fase stazionaria.
    3. Centrifugare la coltura batterica durante la notte a 4.000 x g per 10 min a 25 ° C e quindi scartare il surnatante. Risospendere il pellet in tampone fosfato salino (PBS) ad una concentrazione finale di 2.0 x 109 CFU/mL.
      Nota: La concentrazione dei batteri è stata stimata misurando la densità ottica e ulteriormente determinata da piastra contare16, rivelando quello OD 1600 di sospensione contenuta 1.5 x 108 UFC/mL.
    4. Diluire la sospensione batterica a 1: 200 (1.0 x 107 CFU/mL) in mezzo TSB contenente 0.5% di glucosio. Inoculare 200 µ l di sospensione batterica in ciascun pozzetto di una micropiastra a 96 pozzetti polistirolo cellulare-cultura-trattati.
    5. Incubare la micropiastra staticamente a 37 ° C per 24 h in un ambiente ben ossigenato.
      Nota: Il tempo di incubazione per la formazione di biofilm maturi può variare per diversi ceppi batterici; Questo dovrebbe essere determinato prima di sperimentare la PDT15.
    6. Scartare i media nei pozzetti e lavare i pozzetti di micropiastra delicatamente con PBS tre volte e poi scartare il surnatante.
      Nota: Il passo dovrebbe essere effettuato molto delicatamente per evitare di disturbare i biofilm formati.
  2. Formazione di biofilm in piatti
    1. Inoculare il ceppo di Staphylococcus aureus USA300 in 5 mL di terreno TSB e coltivare in un incubatore con agitazione a 37 ° C durante la notte per la fase stazionaria.
    2. Centrifugare la coltura batterica durante la notte a 4.000 x g per 10 min a 25 ° C e quindi scartare il surnatante. Risospendere il pellet in PBS a una concentrazione finale di 2.0 x 109 CFU/mL. Quindi, diluire la sospensione batterica a 1: 200 (1.0 x 107 CFU/mL) in mezzo TSB contenente 0.5% di glucosio. Inoculare 2 mL di sospensione batterica in una piastra di coltura delle cellule di qualità ottica 35 mm vetro inferiore e incubare staticamente a 37 ° C per 24 h.
      Nota: La concentrazione dei batteri è stata stimata misurando la densità ottica.
    3. Aspirare i media con una pipetta e poi sciacquare il biofilm nel piatto delicatamente con PBS tre volte e quindi, scartare il surnatante con attenzione.
      Nota: Evitare di toccare la punta della pipetta sul fondo del piatto. Il passo 2.2 deve essere eseguito immediatamente dopo questo passo per evitare l'essiccazione del biofilm formati.

2. luce irradiazione

  1. Negozio 5-ALA in un frigorifero a 4 ° C. Prima dell'esperimento, diluire 5-ALA con PBS a 10 mM.
    Nota: 5-ALA soluzione deve essere preparata prima dell'esperimento.
  2. Nel gruppo sperimentale, aggiungere 200 µ l di 10 mM ALA in ciascun pozzetto della micropiastra o 2 mL per piastra di coltura. Coprire il piatto/piatto con carta stagnola e incubare per 1 h. Quindi, irradiare il piatto/piatto con un diodo luminoso (LED) con un'intensità di luce di 100 mW/cm2 per 1 h per raggiungere una dose leggera di 360 J/cm2 a una maggiore lunghezza d'onda di 633 ± 10 nm17.
    Nota: Al fine di lasciare che l'energia della luce in modo efficace e altrettanto consegnati per il biofilm in tutti i pozzetti/piatti, fissare la distanza tra il picco della sorgente luminosa e il pozzetto a 6,0 cm e limitare l'area sperimentale alla zona centrale di irradiazione (10 cm x 8 cm). per garantire che i risultati sono riproducibili, gli esperimenti devono essere eseguiti a temperatura ambiente stessa.
    Nel passaggio di irradiazione di LED, per evitare l'esposizione diretta della piastra per altre sorgenti luminose, quali luce solare, illuminazione della stanza o lamplight, il LED è stato acceso prima di spostare il piatto/piatto alla zona di irradiazione e la luce era abbastanza luminosa per completare l'operazione.
  3. Impostare i gruppi di controllo (controllo a tre gruppi sono stati istituiti nel nostro esperimento).
    1. Per il primo controllo gruppo (ALA - LED-), aggiungere 200 µ l di PBS in ciascun pozzetto della micropiastra o 2 mL per piastra di coltura. Coprire il piatto/piatto con carta stagnola e incubare per 2 h.
    2. Per il secondo gruppo di controllo (ALA + LED-), aggiungere 200 µ l di 10 mM ALA in ciascun pozzetto della micropiastra o 2 mL per piastra di coltura. Coprire il piatto/piatto con carta stagnola e incubare per 2 h.
    3. Per il terzo gruppo di controllo (ALA-LED +), aggiungere 200 µ l di PBS in ciascun pozzetto della micropiastra o 2 mL per piastra di coltura. Coprire il piatto/piatto con carta stagnola e incubare per 1 h. Quindi esporre la piastra al LED con 360 J/cm2 irradiazione di luce ad una maggiore lunghezza d'onda di 633 ± 10 nm17.
      Nota: Nel passaggio irradiazione LED, evitare l'esposizione diretta della piastra per altre sorgenti luminose, quali luce solare, illuminazione della stanza o lamplight.

3. determinazione dell'efficacia del trattamento PDT

Nota: Per confermare l'effetto di ALA-PDT sul biofilm di S. aureus , la vitalità delle cellule con o senza ALA-PDT è stata valutata contando CFU, così come dalla macchiatura di attuabilità.

  1. Determinazione delle cellule batteriche vitali restanti
    1. Dopo il trattamento ALA-PDT, scartare i media nei pozzetti e lavare i pozzetti con PBS tre volte per rimuovere tutte le cellule non aderenti per entrambi sperimentali e gruppi di controllo.
      Nota: Questo passaggio deve essere effettuato molto delicatamente.
    2. Raschiare le cellule aderenti batteri accuratamente dai pozzi con la punta della pipetta e raccogliere le cellule in provette coniche.
    3. Centrifugare la sospensione batterica a 4.000 x g per 10 min a 4 ° C, quindi eliminare il supernatante.
    4. Risospendere i batteri in 1 mL di enzima di pancreatina 0,25% in PBS e incubare a 37 ° C per 1,5 ore.
    5. Centrifugare a 4.000 x g per 10 min; scartare il surnatante e risospendere il pellet in 200 µ l di PBS.
    6. Effettuare 01:10 diluizioni seriali della soluzione cella con PBS; quindi, aggiungere 5 µ l di ciascun campione diluizione seriale sulla piastra tryptone soya agar (TSA). Incubare la piastra TSA a 37 ° C per 16 h; quindi, contare (ad occhio nudo) il numero di colonie batteriche (CFU/mL).
  2. Osservazione di biofilm di S. aureus da CLSM
    1. Dopo irradiazione di luce, lavare il biofilm nella piastra di coltura con PBS tre volte.
      Nota: Questo passaggio deve essere effettuato molto delicatamente.
    2. Aggiungere 1 mL di 1 µM verde-fluorescente nucleare e macchia di cromosoma che è permeabile per le membrane delle cellule procariote (ad esempio, SYTO9) e 1 mL di ioduro di propidio 1 µM (PI) per 20 min a macchiare il biofilm così come le cellule morte.
    3. Osservare le cellule vitali (verde fluorescenza, Ex / Em 485 nm/530 nm) e le cellule morte (fluorescenza rossa, Ex / Em 485 nm/630nm) sotto un CLSM con una lente dell'obiettivo d'immersione in olio 63 X 1.4-NA.
    4. Generare immagini usando il software di microscopia.

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Risultati

La vitalità dei batteri nel biofilm è stata diminuita dopo il trattamento ALA-PDT rispetto ai controlli (ALA - ALA + LED, LED-- e ALA-LED +) sia in USA300 che i tre ceppi clinici (Figura 1).

Per confermare i risultati dal CFU di analisi e osservano l'antibatterico effetto del ALA-PDT lo S. aureus biofilm in situ, il biofilm di USA300 sono state visualizzate da CLSM con vitalità col...

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Discussione

PDT è stata una terapia ben studiata per il trattamento del cancro, quando è stato inventato più di 100 anni fa18. Nell'ultimo decennio, è stata applicata come una strategia antimicrobica e ha indicato l'efficacia contro alcuni batteri patogeni resistenti agli antibiotici12PDT. Rispetto allo stato planctonico, biofilm batterici sembrano essere più resistenti al trattamento antibiotico3, mentre l'effetto di ALA-PDT il biofilm non è stato completamente...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione nazionale di scienza natura della Cina per giovani studiosi (No. 81300810), programma di formazione di Shanghai il giovane dottore (No. 20141057) e National Natural Science Foundation of China (81671982, 81271791 e 81571955). Vorremmo ringraziare LetPub (www.letpub.com) per fornire assistenza linguistica durante la preparazione di questo manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Triptone Brodo di Soia (TSB)OXOIDCM0129B
Triptone Agar di Soia (TSA)OXOIDCM0131
SYTO9Thermo Fisher ScientificL7012The LIVE/DEAD BacLight Kit di vitalità batterica 
Ioduro di propidio (PI)Thermo Fisher ScientificL7012I kit di vitalità batterica LIVE/DEAD BacLight 
PancreatinaSigma-AldrichP3292
acido 5-aminolevulinico (ALA)Fudan Zhangjiang Bio-Pharm3.1
Staphylococcus aureus ceppo USA300//La fonte dei riferimenti USA 300 " Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. settembre 2009; 64(3):441-6".
Staphylococcus aureus ceppi clinici (C1-C3)//Tutti i ceppi clinici sono stati isolati da pazienti con rinosinusite cronica nel Dipartimento di Otorinolaringoiatria-Chirurgia della testa e del collo, Ospedale oculistico e otorinolaringoiatrico dell'Università di Fudan [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627].
Micropiastra a 96 pozzettiCorning Inc3599Micropiastre trasparenti in polistirene a fondo piatto trattate con TC, confezionate singolarmente, con coperchio,
Piastra fluorescenteNEST Biotechnology801001Fondo in vetro, Provette Eppendorf Safe-Lock non pirogene
, 1,5 mLEppendorf
Eppendorf 5417EppendorfZ365998 |  Incubatore SIGMA
Thermo Fisher ScientificSHKE4000MaxQ 4000 Agitatori orbitali da banco
Diodo a emissione di luce (LED)Wuhan Yage Tecnica ottica ed elettronica COLED-IB
Leica TCS SP8 Microscopio a scansione laser confocaleLeica Microsystems
Leica LAS Software AFLeica Microsystems
IMARIS softwareBitplane
sterile Microcentrifuga 0030120086

Riferimenti

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