Interazioni piante-microrganismi: Risposta trascrizionale di Bacillus Mycoides di essudati di patate

Sommario

L'obiettivo del protocollo presentato qui è quello di studiare la risposta di trascrittomica di endosphere-isolato Bacillus mycoides di essudati di patata. Questo metodo facilita l'identificazione di importanti geni batterici coinvolti nelle interazioni piante-microrganismi ed è in linea di principio applicabile ad altri endofiti e piante, con piccoli aggiustamenti.

Abstract

Batteri benefici associati pianta giocano un ruolo importante nel promuovere la crescita e prevenire la malattia in piante. L'applicazione della pianta dipromozione rhizobacteria (PGPR) come agenti di biocontrollo e concime biologico è diventato una valida alternativa all'uso di fertilizzanti convenzionali e può aumentare la produttività delle colture a basso costo. Interazioni piante-microrganismi dipendono da segnali di pianta-secreto di host e una reazione hereon dai loro batteri associati. Tuttavia, i meccanismi molecolari di batteri benefici come rispondono a loro associati pianta-derivati segnali completamente non sono capiti. Valutazione della risposta di trascrittomica di batteri di essudati radicali è un approccio potente per determinare l'espressione di gene batterico e regolamento alle condizioni rizosferici. Tale conoscenza è necessaria comprendere i meccanismi coinvolti nelle interazioni piante-microrganismi. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per studiare la risposta di trascrittomica di b. mycoides EC18, uno sforzo isolato dalla endosphere di patata, di essudati di patata. Con l'aiuto di recente tecnologia di sequenziamento ad alta velocità, questo protocollo può essere eseguito in diverse settimane e produrre grandi set di dati. In primo luogo, che raccogliamo gli essudati in condizioni sterili, dopo di che vengono aggiunti al b. mycoides culture. il RNA da queste culture è isolato usando un metodo di fenolo/cloroformio, combinato con un kit commerciale e sottoposti a controllo di qualità di uno strumento automatizzato di elettroforesi. Dopo l'ordinamento, l'analisi dei dati viene eseguita con la pipeline di T-REx basata sul web e viene identificato un gruppo di geni differenzialmente espressi. Questo metodo è uno strumento utile per facilitare nuove scoperte sui geni batterici coinvolti nelle interazioni piante-microrganismi.

Introduzione

Piante possono essudato fino al 20% del carbonio fissato durante la fotosintesi attraverso le radici nella rizosfera¹, vale a dire, la zona stretta del terreno vicino alle radici. A causa di una maggiore disponibilità dei nutrienti, la rizosfera è un habitat adatto per diversi microrganismi, inclusi batteri promuovere crescita di pianta. Gli essudati contengono una gamma di composti inorganici come ioni, acidi inorganici, ossigeno e acqua. Tuttavia, la maggior parte degli essudati radice è formata da materiali organici, che possono essere suddivisi in composti a basso peso molecolare e ad alto peso molecolare, composti. I composti a basso peso molecolare includono gli aminoacidi, acidi organici, zuccheri, composti fenolici, acidi grassi e una matrice di metaboliti secondari. I composti ad alto peso molecolare costituiti da mucillagini e proteine^2,3. Microrganismi della rizosfera possono utilizzare alcuni di questi composti come fonte di energia per la crescita e lo sviluppo. Gli essudati giocano un ruolo importante nel plasmare la comunità di rizobatterica, poiché i composti pianta-prodotta in essudati possono influenzare il comportamento dei batteri associati rizosfera, influenzando l'espressione di specifici geni.

Comprensione della risposta batterica alla essudati è un passo fondamentale nel decifrare i meccanismi di interazione pianta-microbo. Come la risposta batterica alle interazioni piante-microrganismi è il prodotto dell'espressione genica, possono essere studiato mediante analisi del trascrittoma. Utilizzando questo metodo, gli studi precedenti identificati diversi importanti geni coinvolti nelle interazioni piante-microrganismi. In Pseudomonas aeruginosa, geni coinvolti nel metabolismo, chemiotassi e tipo di secrezione di II sono stati indicati per rispondere a barbabietola da zucchero radice essudati⁴. Ventilatore et al. ⁵ ha studiato la profilazione di trascrittomica di b. amyloliquefaciens FZB42 in risposta a mais essudati. I risultati ottenuti mostrano che, dei geni fortemente indotti dagli essudati, diversi gruppi sono coinvolti nelle vie metaboliche relative all'utilizzazione dei nutrienti, chemiotassi, motilità e non-ribosomal sintesi di peptidi antimicrobici e polichetidi.

La precisione di questi studi si basa sulla raccolta di essudati radicali. Anche se diversi metodi sono descritti la raccolta di essudati radicali per scopi diversi, richiedono strumenti sofisticati o non vengono eseguiti in condizioni ben controllate^6,7,8. Inoltre, inibendo la rizosfera microrganismi possono influenzare composizione principale dell'essudato che interessano le permeabilità della membrana cellulare di pianta e danneggiare i tessuti della radice, particolarmente nel caso di consorzi di microrganismi⁹. Quando si esamina la risposta microbica di essudati radicali, è importante utilizzare condizioni ben definite al fine di evitare l'alterazione dei composti da altri microrganismi¹⁰. Inoltre, RNA di alta qualità è necessario per RNA-seq basati su studi di trascrittoma. Tuttavia, quando si tratta di ceppi non modello-batteriche, i protocolli standard o kit commerciali di solito hanno una bassa efficienza a causa di fattori sconosciuti o proprietà speciale di crescita.

Il protocollo descritto qui è stato verificato utilizzando b. mycoides, che è un batterio gram-positivo, sporigeni del phylum Firmicute. È onnipresente nella rizosfera di varie specie vegetali. Diverse proprietà di promuovere crescita pianta sono state segnalate per questa specie, tra cui l'induzione di resistenza sistematica (ISR) nella barbabietola da zucchero¹¹, inibizione del attenuante-fuori patogeno Pythium per cetriolo¹², così come azoto fissazione del girasole rizosfera¹³. Tuttavia, i meccanismi molecolari della sua interazione con una pianta ospite non sono ben studiati.

L'obiettivo degli esperimenti presentati qui è quello di studiare la risposta di trascrittomica di endosphere-isolato b. mycoides di essudati di patata. In breve, il protocollo prevede i passaggi seguenti: in primo luogo, raccogliere essudati di patata in condizioni sterili. Quindi, estrarre RNA di alta qualità da cellule batteriche trattate con essudati. Il passo finale è l'analisi dei dati utilizzando il web-based T-REx pipeline¹⁴. Questo protocollo è stato usato per identificare i geni di b. mycoides che mostrano un cambiamento nei livelli di espressione al contatto con essudati radicali- e quindi potrebbero giocare un ruolo importante nelle interazioni piante-microrganismi.

Protocollo

1. patate in condizioni sterili di germinazione

1. Sciacquare la superficie di patate con acqua sterile. Fare il bagno la patata in etanolo al 70% e poi in 3% di ipoclorito di sodio, per 5 minuti ciascuno. Risciacquare con acqua sterile per rimuovere qualsiasi residuo di ipoclorito di sodio.
2. Preparare i materiali necessari per germinare e crescere di tuberi di patata; sterilizzare i vasi di plastica, cesti di attecchimento, vermiculite e acqua in autoclave a 121 ° C per 20 min.
   Nota: Assicurarsi che tutti i materiali utilizzati sono autoclavabili. In caso contrario, utilizzare altri metodi di sterilizzazione.
3. Mettere la patata di superficie-sterilizzato nel cesto attecchimento e questo posto in una pentola in autoclave con vermiculite umida.
4. Mantenere il piatto in una camera climatica a 24 ° C per tre settimane. Impostarlo su cicli di 16 h di luce (120 µmol m^-2s^-1) e 8 ore di buio. Per evitare contaminazioni microbiche, è possibile utilizzare una casella di fibra di vetro di grandi dimensioni per coprire la pentola.

2. raccolta di essudati di patate

1. Quando i germogli germoglio, trasferimento il cestello con la patata intera in un becher sterilizzato riempito con 150 mL di acqua deionizzata in autoclave, con la patata tuberi posizionati appena sopra la superficie dell'acqua e le radici immerse nell'acqua (Vedi Figura 1). Tenere la piantina della camera climatica e utilizzare le stesse impostazioni come prima [24 ° C; cicli di 16 h di luce (120 µmol m^-2s^-1), 8 h delle tenebre].
2. Dal secondo giorno, raccogliere l'acqua contenente gli essudati e riempire il becher con acqua deionizzata sterile. Eseguire il campionamento ogni giorno fino al settimo giorno dopo il trasferimento il semenzale.
3. Conservare ogni campione separatamente a 4 ° C. Per ogni campione, diffondere 100 µ l su una Luria-Bertani (LB; tryptone di 1%, 0,5% di Estratto di lievito, 0.5% NaCl) piastra di agar per verificare contaminazioni microbiche. Scartare i campioni contaminati.
4. Combinare i campioni raccolti di una piantina e concentrarle di liofilizzazione li a-40 ° C ad un volume finale di 150 mL.

3. aumento dei batteri

1. Inoculare un ceppo di b. mycoides da uno stock di glicerolo di-80 ° C su una piastra di agar LB ed incubare la piastra a 30 ° C durante la notte.
2. Inoculare un terreno liquido LB con una singola Colonia dalla piastra e far crescere la cultura in un incubatore d'agitazione a 200 giri/min durante la notte a 30 ° C.

4. trattamento e campionamento dei batteri

1. Per confrontare la curva di crescita dei batteri trattati con essudati radicali di un controllo negativo, preparare una serie di recipienti contenenti 50 mL di terreno liquido LB. Aggiungere 0,5 mL di coltura batterica durante la notte per tutte le beute e aggiungere 0%, 5%, 10%, o essudato radice 15% (v/v) o acqua deionizzata sterile al medium, rispettivamente.
2. Utilizzare una lingua con acqua deionizzata invece di essudati radicali come controllo. Misurare la densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) ogni 1h in seguito. Generare una curva di crescita tracciando i valori di₆₀₀ OD rispetto al tempo.
   Nota: Abbiamo visto che il 10% degli essudati radice non ha influito la crescita di b. mycoides (Vedi Figura 2); Questo rapporto è stato usato per esperimenti di RNA-seq.
3. Diluire una cultura b. mycoides pernottamento con 90 mL di pre-riscaldato LB medium per l'iniziale OD₆₀₀ di ~ 0.05 in un matraccio da 300 mL. Aggiungere 10 mL di essudati radicali alla cultura e incubare a 30 ° C per 1 h.
4. Utilizzare un trattamento di 10 mL di acqua deionizzata sterile come un controllo. Raccogliere le cellule dalla coltura mediante centrifugazione a 9.000 x g per 2 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e immediatamente congelare il pellet in azoto liquido, quindi conservare a-80 ° C fino all'utilizzo.

5. isolamento di RNA

Nota: Prima di iniziare l'isolamento, preparare il banco da lavoro, scaffali e pipette di pulirli con una soluzione di decontaminazione di RNAsi (Vedi Tabella materiali). Indossare guanti in ogni momento e assicurarsi che tutti i tubi, suggerimenti e soluzioni sono RNAsi-libera. Tenere sempre i campioni su ghiaccio quando possibile.

1. Aggiungere 0,1% (v/v) di pirocarbonato dietilico (DEPC) per acqua ultrapura (100 µ l di DEPC per 100 mL di soluzione), mescolare bene e tenerlo a temperatura ambiente durante la notte. Sterilizzare in autoclave la miscela per inattivare il DEPC dopo trattamento durante la notte. Utilizzare questa acqua ultrapura trattata con DEPC per preparare il buffer di TE [10 mM Tris-HCl (pH = 8); 1 mM EDTA] e una soluzione di 10% SDS (w/v).
2. Scongelare il pellet cellulare sul ghiaccio e sospendere ciascuno in 400 µ l di tampone di TE (DEPC). Trasferire le sospensioni in provette 2 mL tappo a vite.
3. Premix 300 µ l di cloroformio-alcool isoamilico (24:1 v/v) e 300 µ l di fenolo (acido fenolo, grado di RNA) e lasciar riposare per 5 min. Prendere 500 µ l di fase organica superiore per aggiungere a cellule del sedimento. Quindi aggiungere 50 µ l di 10% SDS e 0,5 g di perle di vetro (0,5 µm) nella provetta.
4. Chiudere saldamente il tappo e inserire il tubo in un omogeneizzatore del branello-mulino (Vedi Tabella materiali). Eseguire un'omogeneizzazione di impulso di s 3 × 45 con un intervallo di 1 min sul ghiaccio.
5. Centrifugare i campioni per 10 min a 11.000 x g (4 ° C) e trasferire la fase superiore in una nuova provetta.
6. Aggiungere 500 µ l di cloroformio-alcool isoamilico (24:1) per la fase superiore dal passaggio 5.5 e centrifugare la miscela per 5 min a 11.000 x g (4 ° C).
   Nota: I passaggi seguenti sono stati modificati da istruzioni del fabbricante, di un isolamento di RNA basati sui filtri di vetro commerciale fibra kit (Vedi Tabella materiali).
7. Trasferire 500 µ l della fase superiore in una nuova provetta, aggiungere 2 volumi (1 mL) di un buffer di lisi/associazione e mescolare pipettando su e giù.
8. Combinare i tubi filtro e raccolta (dal kit di isolamento del RNA) e dispensare la miscela dal punto 5.7 al tubo filtro. Centrifugare le provette per 15 s a 8.000 x g e scartare il flusso continuo.
9. Preparare 1,5 mL microcentrifuga con 100 µ l di tampone di DNasi, 10 µ l di dnasi I e 5 µ l di un inibitore di RNAsi (Vedi Tabella materiali). Aggiungere il mix di soluzione preparata sul filtro del tubo filtro e incubare per 20-30 minuti a 15-25 ° C.
10. Eseguire la procedura di lavaggio secondo le istruzioni del fabbricante. Utilizzare 50 µ l di un tampone di eluizione per eluire il RNA.
11. Salvare il RNA eluito a-80 ° C e mettere una pellicola di plastica paraffina intorno ad esso. Allo stesso tempo, è possibile trasferire pochi microlitri di campione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per eseguire un controllo di qualità.

6. sequenziamento e controllo di qualità RNA

1. Verifica il RNA con uno spettrofotometro di microvolume.
   Nota: Il rapporto di assorbanza a 260/280 dovrebbe essere sopra 1.8, e rapporti a 260/230 dovrebbero essere sopra almeno 1.8, preferibilmente sopra 2.0.
2. Esegui il RNA purificato in uno strumento di elettroforesi automatizzata utilizzando l'analisi del RNA di raccomandare kit (Vedi Tabella materiali); il numero di integrità di RNA (RIN) deve essere almeno superiore a 7 per procedere.
3. Utilizzare un importo complessivo di 3 µ g di RNA per campione per generare librerie con una preparazione di RNA-Seq libreria kit (Vedi Tabella materiali) seguendo le raccomandazioni del produttore.
   Nota: Le preparazioni di libreria sono state sequenziate su una piattaforma di sequenziamento ad alta produttività e fine accoppiato letture sono state generate.

7. analisi dei dati utilizzando il Web-Based Pipeline T-REx

1. Eseguire un filtro di qualità usando il FASTX-Toolkit versione 0.0.13 (Phred punteggi di qualità di > 20). Tagliare le letture di RNA-Seq crude delle sequenze di adattatore con lo strumento Trimmomatic.
   Nota: Tutte le analisi a valle erano basate su dati puliti con alta qualità.
2. Scaricare il database di genoma di b. mycoides ATCC 6462 NCBI (adesione NCBI Nr.: CP009692.1) e usarlo come un genoma di riferimento per il mapping la pulito letture utilizzando Bowtie2/2.2.3.
3. Uso HTSeq v0.6.1 per contare il numero di letture mappato ogni gene e le letture al kilobase di trascrizione per letture mappate milioni (RPKM) di ciascun gene basato sulla lunghezza del gene e letture conteggio mappato a questo gene.
4. Per l'analisi dei dati tramite la pipeline di T-REx, utilizzare la tabella RPKM come input, nonché tre file descrittivi: (i) un fascicolo di fattori per descrivere l'esperimento in fattori, (ii) un fascicolo di contrasti per definire quali fattori saranno confrontati per espressione genica differenziale e (iii) un file di classe per descrivere gruppi di geni di interesse.
   Nota: I file descrittivi sono formato in. txt. Esempi possono essere trovati sul sito del T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). Istruzioni precise per l'analisi dei dati utilizzando il T-REx può essere trovato in una precedente pubblicazione di de Jong et al. ¹⁴.

Risultati

Pianta-collegato microrganismi possono influenzare positivamente la crescita delle piante e la salute. Tuttavia, i meccanismi delle complesse interazioni tra piante e loro simbionti microbici non sono completamente capiti. Essudati giocano un ruolo importante nella regolazione del comportamento e dell'attività rizobatterica, e generalmente è postulato che la colonizzazione microbica delle radici si avvia con l'attrazione di microbi di essudati radicali. Lo scopo di questo lavoro era di st...

Discussione

Interazioni piante-microrganismi sono stati supposti per essere determinato da un equilibrio finemente sintonizzato tra batteri e piante. Tali interazioni sono molto complesse e difficili da studiare in un sistema naturale, che comprende diverse specie microbiche, potenzialmente funge da consorzi. Questo articolo descrive un protocollo semplificato per studiare la risposta batterica di essudati in condizioni ben controllate. Il profilo di trascrittoma di rizobatteri, sopra l'esposizione di essudati radicali, fornisce inf...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ipoclorito di sodio	Sigma	CAS: 7681-52-9	10-15%  di cloro attivo
Incubatore di brodo
	Spettrofotometro New Brunswick Scientific	Innova 4000
	Thermo Fisher Scientific Genesys	20
di vetro di azoto
	Sigma	G8893	0.5 &; m
Provetta da 2,0 ml con tappo			Senza RNasi
1,5 ml e provetta			Senza RNasi
Omogeneizzatore per mulino di perline	BioSpec	607	Centrifuga Mini_beadbeater
	Eppendorf	5430
Pirocarbonato di dietil (DEPC)	sigma	CAS: 1609-47-8
Sodio dodecil solfato (SDS)	sigma	CAS: 151-21-3	Soluzione al 10% preparata con acqua MQ trattata con DEPC
tampone			10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8
fenolo	Sigma	RNA grado
			preparare 24:1 di cloroformio:alcol isoamilico, conservare a temperatura ambiente
Kit di isolamento dell'RNA ad alta purezza	Roche	11828665001
Soluzione di decontaminazione con RNasi	Invitrogen	AM9780	RNase-Zap
Strumento automatizzato per elettroforesi Bioanalizzatore	Agilent	2100
Spettrofotometro per microvolumi	Thermo Fisher Scientific	dell'RNA Nanodrop ND-1000
	Kit Agilent	RNA 6000 Nano.
Inibitore della RNasi	Thermo Fisher Scientific	RiboLock
Kit di preparazione della libreria di RNA direzionale	NEB	Ultra	per Illumina

Luria-Bertani (LB) perle liquido a vite Eppendorf da 2,0 ml TE cloroformio-alcol isoamilico di grado SigmaKit di analisi della qualità