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Articolo metodologico

Produzione di topi transgenici mediata lentivirali: un metodo semplice ed altamente efficiente per uno studio diretto dei fondatori

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DOI:

10.3791/57609

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7 ottobre 2018

 ,  ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, INSERM U1127, CNRS UMR 7225, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, Sorbonne Universités, 2UPMC Univ Paris 06, INSERM UMRS1166, Institute of Cardiometabolism and Nutrition, Sorbonne Universités

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per promuovere l'integrazione del transgene e produzione di topi transgenici fondatore con alta efficacia mediante una semplice iniezione di un vettore lentivirale nello spazio perivitellino di un ovocita fecondato.

Abstract

Per quasi 40 anni, pronuclei iniezione di DNA rappresenta il metodo standard per generare topi transgenici con integrazione casuale dei transgeni. Una procedura di routine è largamente utilizzata in tutto il mondo e il suo limite principale risiede nella scarsa efficacia di integrazione del transgene, risultante in una bassa resa di animali fondatore. Solo qualche punto percentuale di animali nati dopo l'impianto di iniezione ovociti fecondati hanno integrato il transgene. Al contrario, vettori lentivirali sono potenti strumenti per il trasferimento genico integrativa e il loro utilizzo di trasdurre ovociti fecondati permette una produzione altamente efficiente del fondatore topi transgenici con un rendimento medio superiore al 70%. Inoltre, tutto lo sforzo del mouse può essere utilizzato per la produzione di animali transgenici e la penetranza di espressione del transgene è estremamente elevata, superiore all'80% con vettori lentivirali transgenesi mediata rispetto alla microiniezione di DNA. La dimensione del frammento del DNA che può essere carico di vettore lentivirale è limitata a 10 kb e rappresenta la maggiore limitazione di questo metodo. Utilizzando un semplice e facile da eseguire la procedura di iniezione sotto la zona pellucida degli ovociti fecondati, più di 50 animali fondatore possono essere prodotto in una singola sessione di microiniezione. Tale metodo è altamente adattato per eseguire, direttamente in animali fondatore, rapido guadagno e la perdita di studi di funzione o di regioni di DNA genomiche di schermo per la loro capacità di controllare e regolare espressione genica in vivo.

Introduzione

Il lavoro pionieristico di Gordon et nel 1980 hanno mostrato che dopo l'impianto in pseudopregnant topi, l'iniezione di DNA del plasmide nel maschio pronuclei di ovociti fecondati può produrre la produzione di animali transgenici che integrano la plasmide DNA1. La dimostrazione che possono essere generati mammiferi transgenici ha avuto un enorme impatto sulle scienze della vita globale, aprendo la strada a nuovi campi di ricerca sia per le scienze di base e traslazionale scienze biomediche. Negli ultimi quattro decenni, microiniezione di DNA è diventata una pratica di routine. Anche se è stati prodotti un numero enorme di topi transgenici, il metodo standard non è pienamente utilizzabile per tutti i ceppi di topi e richiede molto tempo reincroci2,3. Sua applicazione ad altre specie rimane impegnativo4 e il rendimento generale di integrazione del transgene è limitato a qualche percentuale di animali nati5. Inoltre, l'efficacia dell'integrazione del transgene rappresenta il fattore limitante che spiega la scarsa resa dei pronuclei iniezione di DNA. A questo proposito, vettori virali integranti sono gli strumenti più efficienti per carico e integrano transgeni e così potrebbero fornire nuovi mezzi per aumentare significativamente la resa di integrazione, l'unica limitazione è che la dimensione del transgene che non può superare i 10 kb6 .

Vettori lentivirali pseudo-tipizzati con la proteina di busta del Virus della stomatite vescicolare (VSV) sono strumenti di trasferimento del gene PANTROPICO e altamente integrativa e possono essere utilizzati per trasdurre ovociti fecondati7. La zona pellucida che circonda gli ovociti è una barriera naturale virus e deve essere passato per consentire di trasduzione con i vettori lentivirali. Gli animali transgenici sono stati generati da transducing ovociti fecondati dopo micro-foratura o la rimozione della zona pellucida8,9. Tuttavia, iniezione sotto la zona pellucida nello spazio perivitellino sembra essere il metodo più semplice di trasdurre le uova fecondate come inizialmente descritto da Lois e colleghi7.

L'iniezione di perivitellino di vettori lentivirali permette rendimenti elevati nella produzione di animali transgenici che sono sopra il 70% degli animali nati. Tale rendimento è oltre 10 volte superiore rispetto al rendimento migliore che può essere raggiunto utilizzando standard pronuclei DNA iniezione7,10,11. In questo contesto, una singola sessione di iniezioni genererà almeno 50 transgenici fondatori (F0). Il gran numero di fondatori è, pertanto, compatibile con fenotipizzazione del transgene effetto possono essere effettuata direttamente su F0 topi senza la necessità di generare linee di topi transgenici. Questo vantaggio permette per screening rapido dell'effetto del transgene ed è stato adattato da eseguire in vivo guadagno e la perdita della funzione studia in settimane. Inoltre, elementi regolatori del DNA possono anche essere rapidamente schermati per mappa esaltatori e DNA motivi vincolati dalla trascrizione fattori11,12. Con iniezioni di pronuclei, transgeni integrano solitamente come più copie di un unico locus. Con vettori lentivirali, integrazione si verifica in luoghi multipli come una singola copia per locus10,13. Pertanto, la molteplicità di loci integrati è probabilmente associati alla penetranza di altissima espressione osservata nei fondatori transgenici, che rende più robusto il nuovo modello generato.

Cosa importante, quando si utilizza pronuclei iniezione del DNA, visualizzazione dei pronuclei durante la procedura è assolutamente necessaria. Questa limitazione tecnica impedisce l'utilizzo di ovociti fecondati provenienti da una grande varietà di ceppi di topi. Di conseguenza, la produzione di un modello transgenico in uno specifico ceppo per cui pronuclei sono invisibili richiede la produzione di animali in un ceppo permissivo seguita da almeno 10 successive reincroci per trasferire il transgene nel topo desiderata ceppo. Con le iniezioni di vettore lentivirale, spazio perivitellino è sempre visibile e l'iniezione non richiede competenze altamente specifiche. Ad esempio, topi transgenici NOD/SCID che non sono appropriati per l'iniezione di pronuclei sono stati ottenuti con il vettore virale iniezioni14.

Qui, un protocollo completo viene visualizzato per consentire la semplice produzione di topi transgenici con iniezioni di vettore lentivirale nello spazio perivitellino di un embrione di fase di una cella. Controllata sia con l'espressione del transgene onnipresente o promotori specifici delle cellule è descritto in dettaglio.

La spina dorsale di vettori lentivirali di ΔU3 pTrip è stata utilizzata in questo studio15. Questo vettore permette per la produzione di vettori lentivirali difettoso di replica in cui la sequenza di U3 è stato parzialmente eliminata per rimuovere l'attività del promotore U3 e generare un self-inattivazione di vettore (SIN)16. Scorte di vettore lentivirale sono state prodotte da transitori di transfezione delle cellule HEK 293T con il p8.91 incapsulamento plasmide (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G codifica la stomatite vescicolare (VSV) virus glicoproteina-G17e il ΔU3 di pTRIP vettore ricombinante. La procedura dettagliata di produzione viene fornita come metodi supplementari.

Produzione delle scorte di vettore lentivirale alto titolo viene eseguita in condizioni di biosicurezza livello II (BSL-2). Questo è vero per la maggior parte dei transgeni ad eccezione di oncogeni che devono essere prodotti in BSL-3. Di conseguenza, la produzione in condizioni di BSL-2 per la maggior parte dei casi è sufficiente. Inoltre, l'uso e la produzione sono solitamente disconnesso per la maggior parte delle agenzie di regolamentazione nazionale, a che fare con organismi geneticamente modificati (OGM). Quantità limitate di vettori lentivirali di peccato incompetenti di replica (sotto 2 µ g di proteina del capside p24) può essere utilizzato in condizioni di BSL-1 come descritto dall'Agenzia francese OGM in accordo con le raccomandazioni dell'Unione europea.

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Protocollo

Tutte le procedure che includono lavoro animale hanno ottenuto l'approvazione etica e sono state autorizzate dal Ministero francese della ricerca e dell'istruzione sotto il numero APAFIS n. 5094-20 16032916219274 v6 e 05311.02. La struttura animale ICM PHENOPARC è stato accreditato dal Ministero francese dell'agricoltura sotto il numero di accreditamento B75 13 19. Il protocollo generale richiede l'esecuzione di ogni procedura entro un lasso di tempo preciso riepilogati nella Figura 1.

1. animale acquisto e preparazione di composti basici

  1. Acquisto degli animali
    1. Ordine di 25 maschi vasectomia B6CBAF1/JRj che sono 8 settimane di età (generazione F1 da originale attraversa tra ♀C57Bl/6JRj e ♂CBA/JRj).
      Nota: Isolare i maschi all'arrivo. Vasectomia maschi possono essere riutilizzati per almeno un anno.
      Cambiare le gabbie ogni 3 settimane.
    2. Ordine di 50 B6CBAF1/JRj femmine che sono 10 settimane di età e di mantenere un pool di almeno 50 animali.
    3. Ordine di 10-15 C57BL/6JRj maschi fertili che sono 8 settimane di età.
    4. Ordinare 30 femmine C57BL/6JRj che sono 4 settimane di età.
  2. L'anestesia e l'eutanasia
    1. L'anestesia viene eseguita utilizzando un volume di 300μL chetamina/xilazina mix, iniettato intraperitonealmente (ketamina ad una dose del peso corporeo di 150μg/g, xilazina ad una dose di 0.15μg / g di peso corporeo). Gli animali sono posti sotto il termoforo per regolare la temperatura corporea. Controllare i riflessi pizzicando la coda dell'animale prima dell'inizio della procedura.
    2. L'eutanasia è stata eseguita da dislocazione cervicale. Decapitazione era inclusa come un metodo secondario per confermare la morte dell'animale. L'eutanasia degli embrioni è stata eseguita per decapitazione.
      Nota: All'arrivo, gli animali ammessi un minimo di 1 settimana a habituate all'alloggio (nessuna manipolazione o accoppiamento). Cosa importante, qualsiasi ceppi murini comprese linee transgeniche possono essere utilizzate come fertili maschi e femmine fertili per superovulazione. La scelta di sforzo dovrebbe essere fatto secondo i requisiti della questione scientifica.
  3. Preparazione dell'ormone
    1. Aggiungere 910 µ l di tampone PSMG (incinta Mare siero gonadotropina) in 1 fiala Liofilizzato di PMSG, rendere aliquote di 100 µ l e conservare a-20 ° C.
      Nota: Ciascuna aliquota contiene 55 UI per 11 topi. Mai tenere PMSG aliquote per più di 2 settimane dopo il primo utilizzo.
    2. Aggiungere liofilizzato 2730 µ l di tampone di hCG (gonadotropina corionica umana) in 1 flaconcino di hCG. Aliquote di 100 µ l di fare e conservare a-20 ° C.
      Nota: Ciascuna aliquota contiene 55 UI per 11 topi.
  4. Preparazione di ialuronidasi
    1. 1 flaconcino di ialuronidasi con 3 mL di terreno di M2 per ottenere un 10 mg/mL soluzione di riserva e rendere aliquote di 50 µ l di ricostituire. Quindi conservare a-20 ° C.
  5. Preparazione all'intervento di strumenti
    1. Sterilizzare tutti gli strumenti di chirurgia utilizzando l'autoclave.

2. superovulazione dei donatori femminile

  1. In una struttura animale utilizzando 12h giorno - cicli di notte, iniettare PMSG al 14 giorno -3. Iniettare hCG alle 12 il giorno -1 e accoppiamento con i maschi fertili appena dopo l'iniezione di hCG.
  2. Il giorno -3, aggiungere 1 mL di soluzione sterile di NaCl 0,9% in 1 aliquota di 100 µ l di PMSG (55 UI). Iniettare 10 C57BL/6JRj femmine con 100 µ l intraperitonealmente usando una siringa senza qualsiasi volume morto.
    Nota: Ogni mouse riceverà 5 UI di PMSG.
  3. Il giorno -1, aggiungere 1 mL di soluzione sterile di NaCl 0,9% in 1 aliquota di 100 µ l di hCG (55 UI). Iniettare i topi che hanno ricevuto l'iniezione di PMSG con 100 µ l di soluzione diluita di hCG (5UI) intraperitonealmente. Utilizzare una siringa senza qualsiasi volume morto. Eseguire l'iniezione lentamente e aspettare prima di rimuovere l'ago in modo che il liquido non ci siano perdite.
    Nota: Ogni mouse riceverà 5 UI di hCG. Iniezione di hCG dovrebbe essere eseguita 46 h dopo PMSG.
  4. Posizionare ogni femmina C57BL/6JRj nella gabbia del maschio stallone direttamente dopo l'iniezione di hCG.
  5. Controllare spine vaginali la mattina del giorno 0 e utilizzare le femmine positive per raccogliere le uova fecondate.

3. preparare le femmine Pseudopregnant B6CBAF1/jRj

  1. Accoppiare un maschio vasectomia il giorno prima della raccolta delle uova (giorno -1) con 2 B6CBAF1/JRj femmine alle 17.
    Nota: È molto importante per accoppiarsi con le femmine che sono provenienti da gabbie diverse per evitare la sincronizzazione dei cicli femminili. Ciò consentirà di aumentare il rendimento di ottenere spine vaginali. Inoltre, non aggiungere una femmina a una gabbia maschio che è stata modificata negli ultimi 2 giorni. Efficacia del comportamento riproduttivo nei maschi è aumentata quando la gabbia è sporca.

4. fecondati collezione

  1. Preparazione
    1. µ L 1450 di M2 per soluzione di riserva di ialuronidasi per preparare la soluzione di lavoro di ialuronidasi.
    2. Depositare una goccia di 100 µ l di soluzione di lavoro di ialuronidasi per femmina utilizzata per produrre le uova fecondate in un 100mm di Petri e conservare a temperatura ambiente.
    3. Aggiungere 500 µ l di M16 in lastre di 4 pozzi. Utilizzare 2 pozzi per ogni tipo di vettori lentivirali che verrà iniettato: uno ben conterrà le uova iniettate e l'altro quelli non-iniettato. Posizionare le piastre di bene 4 nell'incubatore a 37 ° C con un 5% CO2 ambiente.
  2. Preparare pipette per la raccolta ed il trattamento degli embrioni.
    1. Ammorbidire i capillari di vetro dell'ematocrito (75 mm/60 µ l) ruotando il centro del tubo capillare di vetro duro nella fiamma.
    2. Togliere i capillari dal fuoco nel minor tempo possibile e tirare per ottenere un tubo con diametro interno di circa 300 µm. Pull sul tubo raffreddato per ottenere una pausa ordinata.
  3. Raccogliere ovidotti.
    1. Eutanasia C57BL/6JRj femmine di dislocazione cervicale alle 9 il giorno 0. Morte è confermata dalla decapitazione.
      Nota: Questo metodo di eutanasia è stato approvato dal IACUC e segue le raccomandazioni europee.
    2. Eseguire una grande incisione orizzontale per aprire la cavità addominale con le forbici. Ovidotto è situato tra l'utero e l'ovaia.
    3. Rimuovere il Mesometrio e la membrana che trasportano vasi sanguigni prominenti con forcipe curvo.
    4. Separare l'ovidotto dall'ovaia con forcipe curvo.
    5. Utilizzare forcipe curvo come guida per tagliare l'ovidotto dall'ovaia usando forbici curve.
    6. Tirare l'ovidotto e tagliare dall'utero con forbici curve.
      Attenzione: Non toccare il ampulla gonfio che contiene le uova fecondate. Eseguire l'intera procedura utilizzando strumenti sterili.
    7. Posto ovidotti tutti raccolti nel terreno di M2 (piastra di coltura di 35 mm) a temperatura ambiente
    8. Posto 2 ovidotti nello stesso calo di 100 µ l di soluzione di lavoro di ialuronidasi (0,3 mg/mL).
  4. Rimuovere le cellule del cumulo da uova fecondate.
    1. Sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare 2 siringhe da insulina: il primo a tenere l'ovidotto e quello secondo per strappare il ampulla e disperdere fecondato uova in soluzione di lavoro di ialuronidasi.
    2. Prendere la pipetta di vetro preparato per la raccolta uova e collegarlo al tubo e un filtro di 0,22 μm montato sul boccaglio per aspirare tutte le uova. Raccogliere tutte le uova e lavarli dal successivo passaggio in 6 diverse gocce di 100 µ l di terreno di M2.
    3. Posto lavato le uova fecondate in incubatrice umidificata 37 ° C con un'atmosfera di 5% CO2 nel mezzo di M16.

5. fare iniezione pipette

  1. Utilizzare tubazione capillare di vetro sottili (10-15 cm di lunghezza) con un diametro esterno di 1 mm e fissare questo capillare nel estrattore orizzontale micropipetta.
    Nota: In pullers pipetta più orizzontale, 3 parametri possono essere regolati: potenza termica, tirando forza e tempo di ritardo tra riscaldamento e tirando. Modificare questi parametri per ottenere pipette d'iniezione simile a quello presentato nella Figura 2A. Per gli utenti che eseguono regolarmente la microiniezione di DNA, utilizzare le impostazioni standard e regolare il ritardo tra riscaldamento e tirando per modificare la forma globale della punta della pipetta.

6. fare Holding pipette

  1. Utilizzare una pipetta di iniezione per preparare la pipetta di supporto.
  2. Allegare una pipetta di iniezione per un microforge. Tagliare la pipetta con il microforge per ottenere una punta affilata simmetrica di 80-100 µm di diametro. Lucidare la punta con calore su microforge per ottenere una forma rotonda simmetrica senza siepi taglienti.

7. preparazione della pipetta di iniezione che contiene il vettore lentivirale

  1. Centrifugare la sospensione di vettore lentivirale a 160 x g per 2 min a pellet detriti spesso presenti negli stock di vettori lentivirali congelati.
  2. Recuperare il supernatante e trasferirlo in una nuova provetta 0,5 mL in una classe di sicurezza II gabinetto.
  3. Trasferire 1 µ l di supernatante di una pipetta di iniezione preparata come descritto nel passaggio 5 utilizzando un Micro-loader.
  4. Impostare la pipetta di iniezione il possessore dello strumento del micromanipolatore giusto. Collegare la pipetta che tiene il micromanipolatore di sinistra.
    Nota: Il titolo di trasduzione del vettore lentivirale sarà direttamente correlato con l'efficacia della produzione del fondatore. Per alta efficienza (> 70%), utilizzare vettori virali con un titolo nella gamma di 100 ng di p24 del capsid proteina / µ l. Quando il titolo è espresso in unità di trasduzione (TU), il titolo dovrebbe essere superiore a 109 TU/mL. Scorte di vettore lentivirale devono essere prodotta mediante trasfezione transiente di cellule 293T con il plasmide encapsidation p8.91, pHCMV-G, codifica la stomatite vescicolare (VSV) virus glicoproteina-G come descritto in metodi supplementari18.

8. micro-iniezione

  1. Erogare 8 µ l di terreno di M2 nel centro di una diapositiva di depressione e coprire con olio di paraffina leggera (embrione testato) per evitare l'evaporazione.
  2. Posto 20 uova nella goccia come meno disperse come possibile.
    Attenzione: Non fare bolle al momento del deposito degli embrioni.
  3. Assicurarsi che la punta della pipetta di iniezione è aperta. In caso contrario, toccare la pipetta di iniezione con la pipetta di supporto.
  4. Impostare il microinjector per un tempo di iniezione di 20 s.
    Nota: La viscosità della sospensione virale permette la chiara visualizzazione della dispersione del vettore virale nello spazio perivitellino. La pressione di iniezione deve essere regolata al fine di riempire tutto lo spazio all'interno di 20 s di iniezione, che rappresenta un volume di 10-100 PL. Pressione di iniezione non deve superare 600 hPa.
  5. Aspirare un uovo fertilizzato che contiene 2 nuclei pro e 2 corpi polari con la pipetta di supporto sotto lo stereomicroscopio.
  6. Iniettare l'uovo con il microinjector usando le impostazioni descritte in 8.4, nello spazio perivitellino.
    Attenzione: Non toccare la membrana plasmatica con pipetta di iniezione.
  7. Iniettare tutto fecondate uova disponibili in lotti di 20 uova e sistemate le uova iniettate immediatamente in pre-riscaldato M16 medio nell'incubatrice umidificata 37 ° C con un'atmosfera di 5% CO2.
    Nota: Incubare le uova iniettate per un minimo di 30 minuti dopo l'iniezione prima di trasferimenti di embrioni.

9. trasferimento di embrioni in femmine Pseudopregnant B6CBAF1/JRj

  1. Controllare la spina di copulazione 16 h dopo l'accoppiamento le femmine B6CBAF1/JRj con i maschi B6CBAF1/JRj vasectomia. Farlo appena prima di iniziare la raccolta delle uova.
  2. Prepararsi pipette l'impianto dell'embrione iniettato.
    1. Fare pipette di impianto degli embrioni come descritto per il prelievo e la manipolazione di embrioni (punto 4.2). Selezionare pipette con diametro interno di circa 150 µm con una parte più stretta circa 4-5 cm di lunghezza.
      Nota: La punta dovrebbe essere fiamma lucidata, al fine di ridurre i possibili danni per le uova o ovidotto.
      1. Riempire con olio di paraffina leggera (embrione testato) appena sopra la spalla di pipetta.
      2. Aspirare una piccola bolla d'aria, poi M2 medium, e infine una seconda bolla d'aria.
      3. Redige gli embrioni uno dietro l'altro per ridurre al minimo il volume totale del mezzo che verrà iniettato nell'ovidotto insieme con gli embrioni.
      4. Finitura caricando una molto piccola goccia di olio di paraffina leggera (embrione testato) della larghezza di circa un embrione.
        Attenzione: Siate gentili mentre si maneggia la pipetta.
  3. Trasferimento dell'embrione.
    1. Sterilizzare tutti gli strumenti.
    2. Anestetizzare la femmina usando un'iniezione intraperitoneale di 300 μL di soluzione sterile di 0,9% di NaCl contenente 150 μg / g del peso corporeo di ketamina e 0,15 μg / g del peso corporeo di xilazina.
    3. Verificare la profondità dell'anestesia pizzicando la coda dell'animale con il forcipe e iniettare subcutaneouly 0,1 mg/kg di analgesico (buprenorfina) prima dell'inizio della procedura.
    4. Barba di 2 cm su entrambi i lati della parte posteriore lungo il midollo spinale al livello dell'ultima costola.
    5. Posizionare il mouse femmina su un rilievo di riscaldamento e di un campo sterile. Tagliare una finestra di 2 x 2 cm al centro della schiena del mouse.
    6. Applicare una soluzione antisettica (10% di ioduro di Povidone) sulla pelle e fare un'incisione trasversale di 1 cm con le forbici, quindi far scorrere la pelle lateralmente fino a quando l'ovario (colore arancione) è visibile attraverso la parete del corpo.
    7. Fare un'incisione di 5 mm nella parete del corpo appena sopra l'ovaia con le forbici bene sotto un microscopio operatorio binoculare.
    8. Pick up il cuscinetto di grasso con un morsetto di bulldog atraumatiche e tirare fuori l'ovaia, l'ovidotto e la parte superiore dell'utero.
    9. Visualizzare il ampulla e fare un hemisection con le forbici di Allerød sul segmento ovidotto che collega l'ovaio al ampulla.
    10. Introdurre la pipetta per l'embrione e consegnare le uova nel ampulla, fermandosi presso la bolla d'aria prima della pipetta di impianto.
    11. Ripetere la procedura sul secondo ovidotto.
    12. Chiuda la pelle con clip di ferita.
    13. Posto l'animale nel recupero dell'alloggiamento (39 ° C, 30-60 min) fino a quando è completamente sveglio.
    14. Ripetere l'iniezione di analgesici dopo 12 ore e 48 ore in caso di segni di dolore o angoscia.
    15. Rimuovere le graffe di ferita 7-10 giorni dopo la chirurgia.
    16. Verifica le femmine impiantate per gravidanza seguendo la loro curva di peso ogni 3 giorni dopo l'impianto. Un aumento di peso significativo può essere osservato da 10 a 12 giorni dopo l'impianto e sarà indicativo per la gravidanza.
      Nota: Tutti gli embrioni che si svilupperanno qui volontà rappresentano presunti fondatori transgenici. Il fenotipo di questi fondatori possa essere analizzato durante le fasi di sviluppo o dopo la nascita secondo la domanda scientifica legata alla generazione di questi animali transgenici.

10. genotipizzazione transgenici fondatori

  1. Preparare il tampone di genotipizzazione contenente 10 mM Tris-HCl, pH 8; 5 mM EDTA, pH 8.0 con 0,2% SDS (w/v), 50 mM NaCl. Sterilizzare il buffer di genotipizzazione attraverso un filtro di 0,22 µm e conservare a temperatura ambiente per diversi mesi.
  2. Messa Membrane Extraembrionali (per gli embrioni) o piccolo pezzo di coda (per gli animali nati) in 500 µ l di filtrato buffer di genotipizzazione e aggiungere 15 µ l di proteinasi K (20 mg/mL). Incubare per una notte a 55 ° C.
  3. Centrifugare il lisato a 15.000 x g per 5 min e quindi utilizzare 1 µ l di supernatante per la reazione di PCR. Lysate può essere memorizzato a 4 ° C per diversi mesi.
  4. Eseguire l'amplificazione di PCR di un frammento del transgene in un 20 µ l di reazione contenente 1 x PCR buffer, 1.5 mM MgCl2, 200 µM di dNTPs, 0,2 µM ciascuna degli iniettori di PCR, 1 UI di Taq DNA polimerasi e 1 µ l di ciascun campione digerito. Come controllo negativo, usare 1 µ l di H2O. Come controllo positivo, è necessario utilizzare DNA dal plasmide vettore lentivirale contenente il transgene.
  5. Per il rilevamento di eGFP descritto uso:
    eGFP Forward Primer: 5' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT 3'
    eGFP Reverse Primer: 5' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT 3'
  6. Eseguire l'amplificazione di PCR in un termociclatore: 4 min a 94 ° C, seguita da 35 cicli di 1 min a 94 ° C, 1 min a 60 ° C e a 2 minuti a 72 ° C.
  7. Caricare il prodotto PCR su un gel di agarosio al 2% al fine di visualizzare un 300 prodotto di PCR eGFP bp come illustrato nella Figura 2B.
    Nota: Tutti gli individui mostrando una band PCR bp 300 hanno integrato il transgene eGFP e possono essere considerati come transgenica.
  8. Analizzare l'espressione del transgene in animali transgenici. Ad esempio, eseguire istologico e immunostaining come illustrato in Figura 3 e Figura 4 e descritta nei metodi supplementari.
    Nota: Sia analisi di espressione del transgene e fenotipo analisi deve essere eseguite utilizzando metodi pertinenti secondo la domanda scientifica globale.

11. quantificazione del numero di copie del Transgene

  1. Preparare i campioni di DNA per PCR quantitativa.
    1. Estrarre il DNA genomico (gDNA) dalla proteinasi K lisato ottenuto nel passaggio 10.3 utilizzando un kit commerciale secondo le istruzioni del produttore.
    2. Quantificare gDNA mediante spettrofotometria a 260 nm.
    3. Diluire ogni campione gDNA a una concentrazione finale di 10 ng / µ l.
    4. Per ogni campione, preparare 5 diluizioni seriali (1:5) in H2O per ottenere 6 tubi alle seguenti concentrazioni: 10 ng / µ l, 2 ng / µ l, 0,4 ng / µ l, 0,08 ng / µ l, 0,016 ng / µ l e 0.0032 ng / µ l
  2. Preparare la miscela di reazione PCR (qPCR) quantitativa.
    1. Preparare il mix di primer per qPCR. Per ogni coppia di primer da utilizzare per qPCR, aggiungere 10 µ l di primer forward (soluzione di riserva di primer 100 µM), 10 µ l di primer reverse (100 µM) e 80 µ l di H2O.
      Nota: Per amplificare eGFP, utilizzare primer Forward TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA e Reverse TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG. Gene CDX2 viene usato come normalizzatore per qPCR (2 copie per genoma). Per Cdx2 normalizzatore utilizzare primer Forward GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG e Reverse GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT
    2. Preparare 2 miscele di qPCR, uno con il mix di primer eGFP e uno con mix di primer Cdx2. Preparare la miscela di qPCR sufficiente per amplificare le 6 diluizioni in duplicati di ogni gDNA. Una reazione di qPCR contiene 3,8 µ l di H2O, 5 µ l di verde fluorescente 2 x mix di reazione e 0,2 µ l di miscela primer.
      Nota: Per ogni animale transgenico testare, verranno eseguite 24 reazioni di qPCR. La miscela di reazione viene fornita per una macchina di qPCR ben 384.
    3. Per ogni animale testare, distribuire: 12 pozzi con 9 µ l di miscela di qPCR eGFP e 12 pozzi con 9 µ l di miscela di qPCR Cdx2. Aggiungere 1 µ l di ciascuna diluizione gDNA a 2 pozzetti contenenti il mix di qPCR eGFP e 2 pozzetti contenenti il mix di qPCR eGFP.
    4. Lasciare 2 pozzetti per ogni qPCR mescolano in cui gDNA era sostituire di H2O come controllo negativo.
  3. Posizionare la piastra ben 384 nella macchina qPCR e applicare il seguente protocollo di esecuzione: 10 min a 95 ° C quindi 50 cicli di 10 s a 95 ° C e 1 min a 60 ° C.
  4. Analizzare i dati. Per ogni gDNA testare, tracciare i valori di Ct come una funzione del Log dell'importo totale gDNA (6 punti in duplicati). Montare la curva di regressione lineare con il metodo di minimi quadrato ed estrapolare il valore Ct corrispondente l'intercetta con l'asse y. Utilizzare i valori di Ct estrapolati per eGFP e il Cdx2 normalizzato per calcolare il numero di copie di eGFP relativo Cdx2 (2 copie) utilizzando il metodo standard 2ΔdCt 11.

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Risultati

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Discussione

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi di divulgare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Magali Dumont e Rolando Meloni per lettura critica del manoscritto e la iVector e Phenoparc ICM core per l'assistenza tecnica nella produzione del vettore lentivirale e animale alloggiamento rispettivamente. Questo lavoro è stato supportato dal Translationnelles Institut Hospitalo-Universitaire de neuroscienze de Parigi, IHU-A-ICM, Investissements d'Avenir ANR-10-IAIHU-06. P.R. ha ricevuto finanziamenti per l'associazione de Langue Française pour l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) e un comune JDRF / INSERM grant.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
PMSG 50UISigmaG4527
hCG 5000UISigmaCG5-1VL
NaClSigma7982
Piastra di Petri da 100 mmDutsher353003
4 pozzetti Piastra NuncDutsher56469Piastra IVF
M2 mediaSigmaM7167
M16 mediaSigmaM7292
0,22 µ m Filtro per siringaDutsher146611
Enzima ialuronidasi 30mgSigmaH4272embrione di topo testato
Insulina seryngeVWR613-3867Terumo Myjector
Pinza curvaMoria2183
Forbici curveMoriaMC26
Gruppi di tubi aspiratore per pipette microcapillari calibrateSigmaA5177-5EA
Capillari in vetro borosilicatoApparecchio HarvardGC 100-10
Estrattore per micropipette orizzontaleNarishigePN-30
MicroforgeNarishigeMF-900
Microscopio invertitoNikonTransferman NK2 5188Hoffman è richiesta
l'illuminazione a contrasto a modulazioneMicromanipolatoreEppendorfCelltram aria
Controllore di tenuta pipettaEppendorfFemtojet
Olio mineraleSigmaM8410embrione di topo testato
MicroiniettoreEppendorfFemtojetPuò essere utilizzato per iniettare DNA o vettori virali Dumont
# 5 pinzeMoriaMC 40
vannas micro forbiciMoria9600
IsofluranocentravetISO005ISO-VET 100% 250ml
ocrygelcentravetOCR002
Povidone iodurecentravetVET001vetedine 120ml
BuprenorfinacentravetBUP002Buprecare 0,3Mg/ml 10ml
Tris-HClSigmaT5941Trizma cloridrato
EDTASigmaE9884
SDSSigma436143
NaClSigmaS7653proteinasi in polvere
KSigmaP2308 
kit oneTaqNEBM0480L
PrimerEurogentec
Striscia di 8 provette PCR4titude4ti-0781
Termociclatore a 96 pozzettiApplied Biosystems4375786Veriti
Genomic DNA mini kitinvitrogenK1820-02
Nanodrop 2000Thermo ScientificND-2000C 
qPCR Master mixRoche4887352001SYBR Green 
Piastra multipozzetto 384Roche5217555001
strumento qPCR 384 pozzettiRoche5015243001LightCycler 480

Riferimenti

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