Qui, presentiamo un protocollo per promuovere l'integrazione del transgene e produzione di topi transgenici fondatore con alta efficacia mediante una semplice iniezione di un vettore lentivirale nello spazio perivitellino di un ovocita fecondato.
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Articolo metodologico
Produzione di topi transgenici mediata lentivirali: un metodo semplice ed altamente efficiente per uno studio diretto dei fondatori
In questo articolo
Sommario
Abstract
Per quasi 40 anni, pronuclei iniezione di DNA rappresenta il metodo standard per generare topi transgenici con integrazione casuale dei transgeni. Una procedura di routine è largamente utilizzata in tutto il mondo e il suo limite principale risiede nella scarsa efficacia di integrazione del transgene, risultante in una bassa resa di animali fondatore. Solo qualche punto percentuale di animali nati dopo l'impianto di iniezione ovociti fecondati hanno integrato il transgene. Al contrario, vettori lentivirali sono potenti strumenti per il trasferimento genico integrativa e il loro utilizzo di trasdurre ovociti fecondati permette una produzione altamente efficiente del fondatore topi transgenici con un rendimento medio superiore al 70%. Inoltre, tutto lo sforzo del mouse può essere utilizzato per la produzione di animali transgenici e la penetranza di espressione del transgene è estremamente elevata, superiore all'80% con vettori lentivirali transgenesi mediata rispetto alla microiniezione di DNA. La dimensione del frammento del DNA che può essere carico di vettore lentivirale è limitata a 10 kb e rappresenta la maggiore limitazione di questo metodo. Utilizzando un semplice e facile da eseguire la procedura di iniezione sotto la zona pellucida degli ovociti fecondati, più di 50 animali fondatore possono essere prodotto in una singola sessione di microiniezione. Tale metodo è altamente adattato per eseguire, direttamente in animali fondatore, rapido guadagno e la perdita di studi di funzione o di regioni di DNA genomiche di schermo per la loro capacità di controllare e regolare espressione genica in vivo.
Introduzione
Il lavoro pionieristico di Gordon et nel 1980 hanno mostrato che dopo l'impianto in pseudopregnant topi, l'iniezione di DNA del plasmide nel maschio pronuclei di ovociti fecondati può produrre la produzione di animali transgenici che integrano la plasmide DNA1. La dimostrazione che possono essere generati mammiferi transgenici ha avuto un enorme impatto sulle scienze della vita globale, aprendo la strada a nuovi campi di ricerca sia per le scienze di base e traslazionale scienze biomediche. Negli ultimi quattro decenni, microiniezione di DNA è diventata una pratica di routine. Anche se è stati prodotti un numero enorme di topi....
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Protocollo
Tutte le procedure che includono lavoro animale hanno ottenuto l'approvazione etica e sono state autorizzate dal Ministero francese della ricerca e dell'istruzione sotto il numero APAFIS n. 5094-20 16032916219274 v6 e 05311.02. La struttura animale ICM PHENOPARC è stato accreditato dal Ministero francese dell'agricoltura sotto il numero di accreditamento B75 13 19. Il protocollo generale richiede l'esecuzione di ogni procedura entro un lasso di tempo preciso riepilogati nella Figura 1.
1. animale acquisto e preparazione di composti basici
- Acquisto degli animali
- Ordine di 25 maschi vasectomia B....
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Risultati
Gli animali transgenici sono stati generati utilizzando il protocollo presentato qui. Rappresentante risultati sia onnipresente ed espressione del transgene specifico tipo cella sono illustrati.
Espressione costitutiva di transgeni
Onnipresenti promotori sono strumenti di ricerca di base per esprimere transgeni in maniera duratura ed efficiente. Tali p.......
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Discussione
L'iniezione di perivitellino di vettori lentivirali in ovociti fecondati qui descritti ha provocato la produzione di embrioni transgenici che ha reso più del 70% degli embrioni transgenici rispetto al numero totale di embrioni raccolti. Questo risultato è coerenza con i rapporti precedenti ed esemplifica la specificità della procedura2,7,10,11,12. Quando si co.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi di divulgare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Magali Dumont e Rolando Meloni per lettura critica del manoscritto e la iVector e Phenoparc ICM core per l'assistenza tecnica nella produzione del vettore lentivirale e animale alloggiamento rispettivamente. Questo lavoro è stato supportato dal Translationnelles Institut Hospitalo-Universitaire de neuroscienze de Parigi, IHU-A-ICM, Investissements d'Avenir ANR-10-IAIHU-06. P.R. ha ricevuto finanziamenti per l'associazione de Langue Française pour l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) e un comune JDRF / INSERM grant.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| PMSG 50UI | Sigma | G4527 | |
| hCG 5000UI | Sigma | CG5-1VL | |
| NaCl | Sigma | 7982 | |
| Piastra di Petri da 100 mm | Dutsher | 353003 | |
| 4 pozzetti Piastra Nunc | Dutsher | 56469 | Piastra IVF |
| M2 media | Sigma | M7167 | |
| M16 media | Sigma | M7292 | |
| 0,22 µ m Filtro per siringa | Dutsher | 146611 | |
| Enzima ialuronidasi 30mg | Sigma | H4272 | embrione di topo testato |
| Insulina serynge | VWR | 613-3867 | Terumo Myjector |
| Pinza curva | Moria | 2183 | |
| Forbici curve | Moria | MC26 | |
| Gruppi di tubi aspiratore per pipette microcapillari calibrate | Sigma | A5177-5EA | |
| Capillari in vetro borosilicato | Apparecchio Harvard | GC 100-10 | |
| Estrattore per micropipette orizzontale | Narishige | PN-30 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Microscopio invertito | Nikon | Transferman NK2 5188 | Hoffman è richiesta |
| l'illuminazione a contrasto a modulazioneMicromanipolatore | Eppendorf | Celltram aria | |
| Controllore di tenuta pipetta | Eppendorf | Femtojet | |
| Olio minerale | Sigma | M8410 | embrione di topo testato |
| Microiniettore | Eppendorf | Femtojet | Può essere utilizzato per iniettare DNA o vettori virali Dumont |
| # 5 pinze | Moria | MC 40 | |
| vannas micro forbici | Moria | 9600 | |
| Isoflurano | centravet | ISO005 | ISO-VET 100% 250ml |
| ocrygel | centravet | OCR002 | |
| Povidone iodure | centravet | VET001 | vetedine 120ml |
| Buprenorfina | centravet | BUP002 | Buprecare 0,3Mg/ml 10ml |
| Tris-HCl | Sigma | T5941 | Trizma cloridrato |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| SDS | Sigma | 436143 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | proteinasi in polvere |
| K | Sigma | P2308 | |
| kit oneTaq | NEB | M0480L | |
| Primer | Eurogentec | ||
| Striscia di 8 provette PCR | 4titude | 4ti-0781 | |
| Termociclatore a 96 pozzetti | Applied Biosystems | 4375786 | Veriti |
| Genomic DNA mini kit | invitrogen | K1820-02 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| qPCR Master mix | Roche | 4887352001 | SYBR Green |
| Piastra multipozzetto 384 | Roche | 5217555001 | |
| strumento qPCR 384 pozzetti | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 |
Riferimenti
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M.
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Ristampe e permessi
