Articolo metodologico

Metodo di coltura organotypic per studiare lo sviluppo dei tessuti embrionali di pollo

DOI:

10.3791/57619

⸱

25 agosto 2018

 , 
1Department of Biology, Mount Saint Vincent University

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un organotipiche coltura protocollo per crescere organi embrionali di pollo in vitro. Utilizzando questo metodo, lo sviluppo del tessuto embrionale pollo può essere studiato, pur mantenendo un elevato grado di controllo dell'ambiente di cultura.

Abstract

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Il pollo embrionale è comunemente utilizzato come organismo modello affidabile per lo sviluppo dei vertebrati. L'accessibilità e l'incubazione breve periodo lo rende ideale per la sperimentazione. Attualmente, lo studio di queste vie inerenti allo sviluppo nell'embrione di pollo è condotto applicando inibitori e farmaci presso siti localizzati e alle concentrazioni basse utilizzando una varietà di metodi. La coltura in vitro del tessuto è una tecnica che consente lo studio dei tessuti separati dall'organismo ospite, evitando contemporaneamente molte delle limitazioni fisiche presenti quando si lavora con interi embrioni, come la suscettibilità degli embrioni per alte dosi di sostanze chimiche potenzialmente letale. Qui, presentiamo un organotipiche coltura protocollo per coltura l'embrionale pollo mezza testa in vitro, che presenta nuove opportunità per l'esame dei processi di sviluppo oltre i metodi attualmente stabiliti.

Introduzione

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Il pollo embrionale (Gallus gallus) è un organismo di modello eccellente comunemente utilizzato nel campo della biologia. Il periodo di incubazione è di circa 21 giorni e molte uova possono essere incubate contemporaneamente, rendendo sperimentazione rapido ed efficiente. Forse la cosa più importante, l'embrione è anche facilmente manipolabili, consentendo il vasto studio chiavi dei processi di sviluppo e dei geni e proteine che guidano questi processi.

L'occhio di pollo embrionale è un organo complesso che si sviluppa attraverso l'interazione di un numero di diversi tessuti simili a molti altri sistemi del corpo. Questo metodo consente lo studio dello sviluppo di questi tessuti, specialmente nelle fasi avanzate di sviluppo. Ad esempio, la retina a più strati può essere di particolare interesse per coloro che studiano lo sviluppo del sistema nervoso. Metodi alternativi che permettono lo studio di altri tessuti dell'occhio come la cornea, il corpo vitreal, la lente, la sclera e le palpebre sono di beneficio ai ricercatori. L'occhio embrionali di pollo contiene anche una serie di ossa piatte, gli ossicini sclerali, che possono essere utilizzati come un modello per lo studio di induzione dell'osso intramembranous e ossificazione in vertebrati1.

Attualmente, ci sono una serie di metodi utilizzati per studiare lo sviluppo embrionale. Microiniezioni di anticorpi inibitori o altre molecole inibitorie2,3, impiantato chirurgicamente microsfere imbevuto di inibitore4, e5 di elettroporazione sono tutti metodi che possono essere utilizzato per downregulate geni o le proteine di interesse in un embrione. Metodi simili vengono utilizzati per aumentare il proteine. Questi metodi non sono senza loro limitazioni. Ad esempio, quando si utilizza sostanze chimiche per alterare lo sviluppo embrionale, devono essere valutati gli effetti letali sull'embrione, e questo limita l'utilizzo di metodi di cui sopra per siti localizzati di applicazione a dosi sufficientemente basse per garantire la sopravvivenza della dell'embrione.

La coltura in vitro del tessuto è stata utilizzata in una vasta gamma di organismi nello studio dello sviluppo e può essere utilizzata per ignorare alcune delle limitazioni di cui sopra. Ad esempio, i femori6, piuma germogli7,8e membra9 del pollo sono tutti stati studiati usando il tessuto di coltura metodi, come hanno i testicoli dei mouse10 e le radici e gambi di piante11. Questi metodi concedono gli scienziati un alto grado di controllo sullo sviluppo dei tessuti, come la possibilità di variare la temperatura e alterare la disponibilità di nutrienti. L'isolamento del tessuto dall'embrione intero rende anche molto meno sensibili agli effetti letali di sostanze chimiche, consentendo in tal modo gli studi di manipolazione su scala globale a concentrazioni più elevate. Un altro notevole vantaggio di in vitro coltura è la conservazione dell'ambiente cellulare del tessuto; la disposizione dei tessuti rimane relativamente invariata, rendendo possibile lo studio delle interazioni tra tessuto differenti tipi9. Così, in vitro coltura apre le porte a ulteriori sperimentale si avvicina non è disponibile in modelli in vivo o in ovo .

Attualmente, studiare lo sviluppo dell'occhio embrionale pollo usando i prodotti chimici è particolarmente impegnativo. Una serie di Membrane Extraembrionali copertina l'embrione, che lo rende difficile applicare microsfere o prodotti chimici; l'embrione è anche molto attivo all'interno l'uovo come esso invecchia, complicando ulteriormente un metodo già difficile. Questo protocollo consente un facile accesso all'occhio e relativi tessuti circostanti, eliminando queste barriere, fornendo nel contempo nuove opportunità per esaminare i processi inerenti allo sviluppo all'interno dell'occhio. Questo protocollo è stato istituito per studiare l'induzione dei ossicles scleral all'interno dell'occhio embrionale.

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Protocollo

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Nota: Per le fasi di embrione, utilizzano l'Hamburger e Hamilton12 (HH) tabella di gestione temporanea.

1. embrione incubazione

  1. Incubare uova di gallina fertilizzate in un'incubatrice sterile, termostatato a 37 ° C ± 1 ° C e ~ 40% di umidità.
  2. Girare le uova 1 x al giorno e consentire loro di incubare a HH34 (post-fecondazione 8 giorni).

2. preparazione e sterilizzazione dei materiali

  1. Per 12 embrioni, autoclave 2 L di acqua distillata, 1 L di soluzione salina allo 0,85% pulcino, 12 pipette in vetro, 1 scatola di carta velina, 24 2,5 x 2,5 cm quadrati di carta da filtro semi-porosa e piazze 24 2,5 x 2,5 cm di filo d'acciaio della maglia con i bordi curvi verso il basso. Per sterilizzare i materiali, autoclave a 121 ° C per almeno 15 min.
    Nota: La sterilizzazione in autoclave dei materiali può essere fatto in anticipo.
  2. Sterilizzare l'incubatrice con etanolo al 70% pulendo i fianchi, mensole e porta. Posto 2 contenitori di plastica contenenti in autoclave acqua distillata acqua all'interno dell'incubatrice per mantenere l'umidità. Preriscaldare l'incubatore di coltura a 37 ° C ± 1 ° C e circa il 40% di umidità. Garantire che l'incubatrice è completamente buia; Se la porta è trasparente, coprire con carta stagnola.
  3. Preriscaldare 100 mL di terreno nutritivo e 1 mL di penicillina inserendoli nell'incubatrice cultura.
  4. Coprire l'area di lavoro con un tovagliolo di carta e sterilizzare la panchina spruzzando con etanolo al 70%. Sterilizzare 2 paia di pinze, forbici di dissezione, una lama di rasoio e un cucchiaio di plastica con etanolo al 70% in un modo simile.
  5. Capsule di Petri sterili 100 mm posto 12 e 24 capsule di Petri sterile 35 mm sul banco per l'uso. Garantire che i piatti rimangono in un sacchetto sterile fino all'utilizzo.

3. embrione preparazione

Nota: Da questo punto in poi, indossare una maschera protettiva polvere per evitare di contaminare le culture. Un'infezione batterica o fungina rovinerà la cultura e c'è il rischio che si sta diffondendo rapidamente a tutte le culture nell'incubatrice.

  1. Crack aprire l'uovo e trasferimento dell'embrione in una capsula Petri 100 mm contenente soluzione fisiologica allo 0,85% pulcino. Fase dell'embrione secondo le caratteristiche anatomiche descritte in Hamburger e Hamilton stadiazione linee guida12 e confermare l'embrione è a HH34.
  2. Tagliare il collo e poi bisecare la testa dell'embrione al midline usando una lama di rasoio sterilizzata. Utilizzando pinze sterili, rimuovere il cervello. Lasciare intatto il becco.

4. cultura Setup

  1. Posto 2 dei piatti Petri 35 mm all'interno di una capsula di Petri di 100 mm.
  2. Collocare una rete metallica in acciaio all'interno di ogni scatola di Petri 35 mm.
  3. Usando il forcipe, trasferire 1 delle teste diviso in due per un pezzo di carta da filtro semi-porosa 2,5 x 2,5 cm con l'occhio rivolto verso l'alto. Garantire il tessuto è sicuro e non scivolare inclinando leggermente.
  4. Usando il forcipe, collocare attentamente tessuto oculare e il filtro di carta sopra la maglia di filo di acciaio in 1 il 35mm piastre Petri, creando un palcoscenico rialzato con il tessuto dell'occhio sulla parte superiore.
  5. Ripetere i passaggi da 4.3 e 4.4 con l'altra metà testa.
  6. Utilizzando una pipetta di vetro sterile, aggiungere cautamente mezzo nutritivo direttamente in ogni capsula di Petri 35 mm fino a quando non raggiunge il livello della carta da filtro. Non immergere la testa mezza in mezzo nutritivo.
  7. Aggiungere 50 µ l di 10.000 U/mL penicillina-streptomicina per il terreno di coltura in ogni capsula di Petri.
  8. Piegare un pezzo di carta velina in una piccola piazza e posizionarlo all'interno il 100mm di Petri. Inumidire con acqua distillata in autoclave.
  9. Inserire la piastra di coltura sterile, scuro incubatore a 37 ° C ± 1 ° C e circa il 40% di umidità per fino a 4 giorni.
  10. Ripetere i passaggi 3 e 4 per ciascun embrione.
    Nota: Il numero di embrioni necessari dipenderà l'esperimento specifico; qui, descriviamo il protocollo per 12 embrioni.

5. cultura manutenzione

  1. Una volta al giorno, rabboccare i contenitori di plastica nell'incubatrice con acqua distillata in autoclave.
  2. Controllo quotidiano di tutte le culture per infezioni batteriche o fungine. Culture che hanno disintegrato o in cui il mezzo ha cambiato colore sono infettate. Scarta tutte le culture che si sono infettate.

6. fissazione

  1. Dopo coltura, rimuovere tutti i piatti dall'incubatrice.
  2. Utilizzando un paio di pinze, rimuovere delicatamente l'occhio dalla carta da filtro, facendo attenzione a non per strappare il tessuto.
  3. Difficoltà tessuto oculare in paraformaldeide al 4% in tampone fosfato salino durante la notte a 4 ° C: 1x o in formalina neutra tamponata al 10% durante la notte a temperatura ambiente.
  4. Conservare il tessuto a 4 ° C in 1x tampone fosfato salino.

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Risultati

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Utilizzando questo metodo, un occhio di pollo embrionali possa essere coltivato dal giorno 8 del suo sviluppo (HH34) in vitro per 4 giorni. Quattro giorni di sviluppo in ovo corrisponde a HH38.

Questo metodo di coltura supporta lo sviluppo di germogli di piuma che circondano l'occhio e sulle palpebre (Figura 1B). Questi germogli di piume non sono presenti in ovo a HH34 pri...

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Discussione

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Questo protocollo si avvale del tessuto consolidato tecniche di coltura per ottenere la crescita di un occhio di pollo da embrionale giorno 8 (HH34) in vitro per 4 giorni. Questo metodo di coltura griglia fu originariamente descritto da Trowell15. Abbiamo ottimizzato un protocollo da Pinto e di Hall 1991 Studio16 utilizzando una membrana semi-porosa con griglia per studiare segnali induttivi tra strati di tessuto separati del pollo embrionale occhio

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori vorrei ringraziare Gregory Haller (Mount Saint Vincent University) per il suo lavoro preliminare nello sviluppo del protocollo. Gli autori inoltre vorrei ringraziare Nicholas Jones (Mount Saint Vincent University) per la sua competenza tecnica e assistenza con le riprese e la produzione della parte audio/visivo del manoscritto. Daniel Andrews è stato sostenuto da finanziamenti da MSVU e scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC) tramite un Undergraduate Student Research Award. Tamara A. Franz-Odendaal è sostenuta da una sovvenzione di scoperta di NSERC.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre di Petri per colture cellulari da 35 mmCorning353001di facile presa, polistirene, non pirogena
Piastre di Petri per colture cellulari da 100 mmCorning353003piatto per colture tissutali, polistirene, carta apirogena
Kimtech34155Tergicristalli per attività di marca Kimtech Science, 280 per rete
metallicadi cartone n/an/arete metallica in acciaio inossidabile (dimensione della griglia 0,7 mm)
pipette in vetro monousoVWR14673-010Vetro borosilicato monouso 5 3/4"
terreno nutritivoGibco12591-038Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutammina con rosso fenolo (BGJB)
penicillina-streptomicinaSigma-AldrichP445810000 unità/mL penicillina streptomicina soluzione filtro stabilizzato
cartada filtro semiporosa Whatman1454 09090mm
uova di gallina fecondateDalhousie University Agricultural Collegen/apuò essere ottenuto da aziende agricole locali
cloruro di sodio (NaCl)EMDSX0420-3cristalli di cloruro di sodio, reagente grado
1 L bottiglia di vetroVWR89000-2401 L pyrex bottiglia di vetro autoclavabile
etanoloFisher Scientific BP8201170%
tupperwaren/an/a acquistatiin negozio e sterilizzati con
lamette da barba usa e gettaEtOH VWR55411-050lame da barba industriali a bordo singolo (acciaio al carbonio chirurgico)
cucchiai di plastican/an/a acquistatiin negozio e sterilizzati con maschera antipolvere EtOH
3Mn/a3M 8500 Comfort Mask
paraformaldeideSigma-AldrichP6148paraformaldeide, grado reagente,
formalina cristallina tamponata neutraFisher Scientific7221010% formalina tamponata neutra
fosfato soluzione salina tamponata (PBS)n/an/aSoluzione salina tamponata con fosfato 10X pH 7,4 (137mM NaCl, 2,5mM KCl, 4,3mM Na2HPO4, 1,4mM KH2PO4)15
ml provette per centrifugapresterilizzateVWR21008-216
PinzeFSTn/apinze fini soluzione
salina per pulcini n/an/a 0,85% NaCl
carta stagnolan/an/a
tovagliolo di cartaacquistato in negozio n/an/aacquistato in negozio
Piastra di Petri per colture cellulari contenitori di biologia molecolare

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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