Articolo metodologico

Singola cella multisala trascrizione inversa Polymerase Chain Reaction dopo Patch-clamp

DOI:

10.3791/57627

⸱

20 giugno 2018

 ,  ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive le fasi critiche e le precauzioni necessarie per eseguire la singola cella multisala trascrizione d'inversione della polimerasi reazione a catena dopo patch clamp. Questa tecnica è un metodo semplice ed efficace per analizzare il profilo di espressione di un insieme predeterminato di geni da una singola cellula caratterizzata da registrazioni di patch-clamp.

Abstract

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La corteccia cerebrale è composto da numerosi tipi di cellule che esibiscono le varie caratteristiche morfologiche, fisiologiche e molecolari. Questa diversità ostacola la facile identificazione e caratterizzazione di questi tipi di cellule, prerequisiti per studiare le loro funzioni specifiche. Questo articolo viene descritto il protocollo multisala singola cella trascrizione d'inversione della polimerasi reazione a catena (RT-PCR), che consente, dopo la registrazione a fette, patch-clamp per rilevare simultaneamente l'espressione di decine di geni in una singola cella. Questo semplice metodo può essere implementato con caratterizzazione morfologica ed è ampiamente applicabile per determinare i tratti fenotipici di vari tipi di cellule e il loro particolare ambiente cellulare, come ad esempio in prossimità di vasi sanguigni. Il principio di questo protocollo è per registrare una cella con la tecnica del patch-clamp, per raccogliere e invertire trascrivere il suo contenuto citoplasmatico, e per rilevare qualitativamente l'espressione di un insieme predefinito di geni di multiplex PCR. Richiede un'attenta progettazione di iniettori di PCR e intracellulare patch clamp soluzione compatibile con RT-PCR. Per garantire una trascrizione selettiva e affidabile rilevamento, questa tecnica richiede anche controlli appropriati dal citoplasma raccolto ai passaggi di amplificazione. Sebbene precauzioni discussi qui devono essere strettamente seguite, praticamente qualsiasi laboratorio elettrofisiologico possibile utilizzare la cella singola multisala tecnica RT-PCR.

Introduzione

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La corteccia cerebrale comprende numerosi tipi cellulari coinvolti in vari processi fisiologici. Loro identificazione e caratterizzazione, un prerequisito per la comprensione delle loro specifiche funzioni, può essere molto difficile data la grande diversità morfologiche, fisiologiche e molecolari che caratterizza di tipi delle cellule corticali1 ,2,3,4.

Cella singola multiplex RT-PCR si basa sulla combinazione di patch-clamp e tecniche di RT-PCR. E ' possibile sondare contemporaneamente l'espressione di predefiniti oltre 30 geni in cellule electrophysiologically identificato5. L'inclusione di un tracciante neuronale in ulteriormente la pipetta di registrazione permette la caratterizzazione morfologica delle cellule registrate dopo la rivelazione istochimica6,7,8,9, 10. è una tecnica molto utile per la classificazione dei tipi neuronali basato sull'analisi multivariata di loro tratti fenotipici5,9,10,11,12 ,13,14. Singola cella RT-PCR multiplex è adatto anche per la caratterizzazione di cellule non neuronali come astrociti15,16,17e può essere applicato praticamente a ogni cervello struttura18, 19,20,21,22,23 e cella tipo, supponendo che essi possono essere registrati nella configurazione di cellule intere.

Questa tecnica è molto conveniente per l'identificazione di fonti cellulari e/o obiettivi di trasmissione sistemi7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, soprattutto quando gli anticorpi specifici sono carenti. Esso si basa su registrazioni di patch-clamp da cellule visivamente identificati29e così permette anche l'ottimizzazione delle cellule in un ambiente cellulare specifico8,15,16. Inoltre poiché la citoarchitettura del tessuto cerebrale è conservato nelle fette del cervello, questo approccio consente inoltre studio dei rapporti anatomici delle cellule caratterizzate con elementi neuronali e non neuronali7,8 , 18.

Poiché questa tecnica è limitata dalla quantità di citoplasma raccolto e dall'efficienza della RT, il rilevamento del mRNA espresso al numero basso di copia può essere difficile. Anche se altri approcci basati sulla tecnologia di RNaseq permettono di analizzare l'intero trascrittoma di singole cellule3,4,30,31, hanno bisogno di alto-rendimento costoso sequencer non necessariamente disponibile per ogni laboratorio. Poiché la tecnica di RT-PCR multiplex singola cella utilizza PCR end-point, richiede solo thermocyclers ampiamente disponibili. Esso può essere facilmente sviluppata nei laboratori attrezzati con allestimenti elettrofisiologici e non richiede costose attrezzature. E ' in grado di fornire, entro un giorno, un'analisi qualitativa dell'espressione di un insieme predefinito di geni. Così, questo approccio offre un facile accesso per la caratterizzazione molecolare delle singole cellule in modo rapido.

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Protocollo

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Tutte le procedure sperimentali utilizzando animali sono state eseguite in stretta conformità con norme francesi (codice rurale R214/87 R214/130) e conforme alle linee guida etiche di Comunità economica europea (86/609/CEE) e la carta nazionale francese sull'etica della sperimentazione animale. Tutti i protocolli sono stati approvati dal comitato etico di Charles Darwin e presentati al Ministero francese dell'educazione e della ricerca (approvazione 2015 061011367540). La struttura animale IBPS è accreditata dalle autorità francesi (A75-05-24).

1. Considerazioni preliminari

Nota: Per evitare contaminazioni, sono conformi alle seguenti raccomandazioni prima cella singola impresa RT-PCR dopo patch clamp.

  1. Non utilizzare plasmidi contenenti geni di interesse in laboratorio, in quanto sono una potenziale fonte di contaminazione.
  2. Riserviamo un banco di laboratorio lontano dalla camera di elettroforesi del gel per preparare PCRs.
  3. Dedicare una serie di pipette e puntali con filtro anti aerosol di manipolare il DNA e RNA a concentrazioni inferiori a 1 ng / µ l. Mai utilizzare questi per analizzare i prodotti di PCR.
  4. Sempre utilizzare prodotti privo di DNasi e RNasi e indossare i guanti.
  5. Usare prodotti chimici dedicati per la preparazione di soluzioni interne patch clamp. Mai usare una spatola, ma piuttosto di pesatura carta per pesare polveri.
  6. Utilizzare un elettrodo pH dedicato e soluzioni standard di pH, come possono essere una fonte di contaminazione (ad es., RNasi).
  7. Tubi capillari in vetro borosilicato negozio; Punte lunghe, sottili e flessibili di 20 µ l; una micropipetta di 20 µ l; un espulsore fatta in casa (patch-clamp pipetta supporto attaccato ad una siringa da 10 mL); Provette per PCR 500 µ l; Puntali con filtro anti aerosol 10 µ l; e sottili marcatori permanenti in un box dedicato (Figura 1).

2. primer Design

Nota: Multiplex RT-PCR si basa su due passaggi di amplificazione. Durante la PCR prima, tutti i geni di interesse co-sono amplificati da mescolare insieme tutti gli iniettori di PCR. Per rilevare in modo affidabile le trascrizioni da singole cellule, è essenziale per la progettazione efficienti e selettivi degli iniettori PCR. L'uso degli iniettori (interni) nidificati per il secondo round della PCR migliora sia la specificità e l'efficienza dell'amplificazione.

  1. Recuperare le sequenze di mRNA a cura di geni di interesse in NCBI Database di riferimento sequenza32 , nonché quelli della loro famiglia correlato (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).
    1. Immettere il nome di geni e specie di interesse come una query e fare clic sulla sequenza rilevante Estratto.
    2. Per limitare l'analisi di sequenza di codificazione dei geni, fare clic su Invia a (in alto a destra) e selezionare sequenze codificanti e FASTA Nucleotide come formato. Quindi fare clic su Crea File e salvare la sequenza FASTA utilizzando un'estensione di file. "NT".
  2. Utilizzare software MACAW33 (Multiple allineamento costruzione & Analysis Workbench) o qualsiasi altro software di allineamento più per determinare le regioni di omologia.
    1. Fare clic sul File | Nuovo progetto... e selezionare il DNA come il tipo di sequenza. Per importare sequenze del gene, selezionare sequenza | Importa la sequenza... e caricare un file. "NT". Ripetere la procedura per tutte le sequenze correlate.
    2. Fare clic e trascinare tutte le sequenze nella finestra schematico per selezionare intere sequenze.
    3. Le regioni di omologia di ricerca selezionando allineamento | Ricerca per blocchi... (CTRL + S). Nel Metodo di ricerca, selezionare la coppia di segmenti si sovrapporre . Regolare il Pairwise punteggio soglia su un valore relativamente elevato (ad esempio, 1.000) e il minimo seqs. per blocco al numero totale delle sequenze da allineare e fare clic su inizia.
    4. Nella finestra dei Risultati di ricerca che appare, selezionare il risultato con il MP-Punteggio più alto e fare clic sul collegamento. Se nessun risultato è trovato, diminuire il Punteggio Pairwise cutoff e/o il seqs. di min. per ogni blocco.
    5. Per facilitare la visualizzazione delle regioni omologhe, selezionare allineamento | Ombreggiatura | Punteggio medio.
    6. Selezionare scollegati parti delle sequenze e ripetere la procedura 2.2.3–2.2.4 per potenzialmente determinare altre regioni di omologia con un MP-Punteggio più basso.
    7. Per ottenere il primer più specifici, selezionare le regioni con l'omologia di sequenza almeno.
  3. Recuperare le sequenze di tutte le varianti di splicing e ripetere i passi 2.2.1–2.2.6. Selezionare loro regioni comuni per una rilevazione generale. Prendere in considerazione alternative cassette per giuntura dedicato varianti analisi20,34,35,36.
  4. Allineare le sequenze di mRNA sul genoma modello animale utilizzando genomi BLAST37 (base locale Alignment Search Tool) per determinare la struttura introne-esone dei geni (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
    1. Selezionare il genoma di topo BLAST cliccando sul Mouse e caricare la sequenza FASTA Estratto nella sezione Inserisci sequenza di Query . Nella Selezione del programma, selezionare Ottimizza per sequenze altamente simili (megablast), quindi fare clic sul pulsante BLAST .
    2. Nella sezione descrizioni , selezionare l'allineamento con l'identità più alta (fino al 100%). Assicurarsi che corrisponde al gene di interesse come indicato nelle caratteristiche della sezione allineamenti .
    3. Ordinare l'allineamento da posizione iniziale Query nella stessa sezione per ottenere la successione di esoni di sequenza di codificazione. Si notino le posizioni iniziale e finale di tutti i colpi che corrispondono all'incirca alla posizione degli introni sulla sequenza query (Figura 2A).
  5. Selezionare due esoni differenti per i primers senso e antisenso differenziare facilmente cDNA da genomico amplificazione di DNA (gDNA) basato su un criterio di dimensione (Figura 2).
    Nota: L'amplificazione di gDNA può verificarsi a bassa frequenza quando il nucleo è raccolto con il citoplasma. Quindi, è essenziale per la progettazione dell'introne overspanning coppie di primer (Figura 2A). In caso di geni introne-meno, la collezione del nucleo è problematica come può portare a risultati potenzialmente di confusione. Per risolvere questo problema, includere un set di primers puntato amplificando una sequenza intronic per sondare la presenza di gDNA25. Se il controllo genomico è positivo, i risultati per tutti i introne-meno geni devono essere scartati.
  6. Per ottenere un'amplificazione efficiente, selezionare primer generando ampliconi con una lunghezza idealmente compresa tra 200 e 400 paia di basi (Figura 2).
  7. Per amplificare contemporaneamente vari cDNAs durante la fase PCR multiplex, disegnare primers con una lunghezza compresa tra 18 e 24 nucleotidi e una temperatura di fusione (Tm) tra 55 e 60 ° C.
  8. Per ridurre al minimo la formazione di strutture secondarie, che riducono la resa di amplificazione, selezionare senso e antisenso primer con minimo tornante e lunghezze duplex (Figura 2B).
  9. Disegnare primers interna utilizzando gli stessi criteri (passi 2,5 – 2,8).
  10. Verificare la specificità dei primer PCR allineando i primer su Database di sequenza di RNA di riferimento dell'organismo di interesse utilizzando un nucleotide BLAST.
    1. BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), fare clic su nucleotide BLAST. Incollare la sequenza di un primer nella Sequenza invio di Query.
    2. Nella sezione Scegliere ricerca insieme , fare clic su altri (nr ecc.), selezionare sequenze di RNA di riferimento (refseq_rna) l'opzione di Database e specificare l'organismo (ad es., Mus musculus (taxid:10090) ) per limitare l'analisi alla specie desiderata.
    3. Nella Selezione del programma selezionare Ottimizza per sequenze alquanto simili (blastn). Nella sezione parametri dell'algoritmo ridurre la dimensione della parola fino alla 7 per aumentare la possibilità di ottenere successi.
  11. Per disegnare primers selettiva, mantenere solo quelli la cui sequenza ha almeno 3 mancate corrispondenze con i cDNAs indesiderati quando possibile.
  12. Ordinare dissalate primer ad una concentrazione relativamente alta (ad es., 200 µM) per garantire che tutti i primer esterni possono essere mescolati insieme ad una concentrazione finale di 1 µM.

3. preparazione dei reagenti RT

  1. 5 x RT-mix: preparare in acqua RNAsi-libera 400 µ l di soluzione di mix di RT (5x) contenente primer casuale 25 µm e dNTP a 2,5 mM ogni di lavoro. Memorizzare questo mix di lavoro come le aliquote in tubi di 500 µ l 20-µ l.
  2. 20 x ditiotreitolo (DTT): preparare 1 mL di 0,2 M DTT in RNAsi-libera acqua e conservarla come aliquote di 50 µ l.
  3. È possibile memorizzare 2.500 U dell'inibitore di RNAsi (40 U / µ l) e 10.000 U della trascrittasi inversa (RTase, 200 U / µ l) come 5 aliquote µ l.
  4. Per garantire una qualità ottimale dei reagenti RT, conservare le aliquote a-80 ° C. Utilizzarli per fino a 10 celle e solo per un giorno.

4. PCR convalida

  1. Preparare i cDNAs effettuando una trascrizione inversa su una quantità relativamente grande di totale RNA (in genere 1 µ g) Estratto38 dalla struttura di interesse.
    1. Non utilizzare le pipette dedicate per singola cella RT-PCR per questi passaggi preliminari, ma utilizzare le pipette RNAsi-libera. Diluire il RNA totale fino a 1 µ g / µ l.
    2. In un tubo PCR 500 µ l, aggiungere 1 µ l di RNA totale diluito e 8 µ l di acqua RNAsi-libera. Denaturare a 95 ° C per 1 min e raffreddare il tubo sul ghiaccio.
    3. Aggiungere 4 µ l di tampone di 5x RT forniti dal produttore, 4 µ l di soluzione mix RT, 1 µ l di RTase, 1 µ l di inibitore di RNAsi e 1 µ l di 200 mM DTT (Vedi sezione 3).
    4. Scorri il tubo, lo spin e incubare per una notte a 37 ° C.
    5. Memorizzare i cDNA a-80 ° C per fino a parecchi anni. Preparare un'aliquota del cDNA diluiti a 1 ng / µ l di equivalenti di RNA totali.
  2. Mescolare e diluire ogni coppia di primer a 1 µM con le pipette dedicate a singola cella RT-PCR. Utilizzare 20 µ l di ogni mix di primer per 100 µ l PCRs.
  3. Su ghiaccio, preparare per ogni coppia di primer di una premiscela contenente: acqua (q.b., 80 µ l), 10 µ l di tampone, 1 µ l di 100 x dNTPs (50 µM), 500 – 1.000 pg di cDNA diluito a 1 ng / µ l e 0,5 µ l (2,5 U, 5 U / µ l) di Taq polimerasi: 10x.
  4. Utilizzare tubi PCR che corrispondono strettamente i pozzetti della macchina PCR per un controllo ottimale della temperatura. Aggiungere 2 gocce (~ 100 µ l) di olio minerale per la premiscela senza toccare il muro o il tappo della provetta PCR.
  5. Per ridurre al minimo la formazione di dimeri dell'iniettore, eseguire un avvio a caldo inserendo i tubi PCR nel termociclatore pre-riscaldato a 95 ° C. Dopo 30 s, espellere rapidamente 20 µ l di mix di primer in cima l'olio.
  6. Dopo 3 min a 95 ° C, 40 cicli di esecuzione (95 ° C, 30 s; 60 ° C, 30 s; 72 ° C, 35 s) seguita da una fase di allungamento finale a 72 ° C per 5 min.
  7. Analizzare 10 µ l di ogni prodotti di PCR di agarosio gel elettroforesi (2%, peso/volume)39. Se alcuni prodotti PCR non hanno le dimensioni previste, ri-progettare altri primer (Vedi sezione 2).
    Attenzione: Il bromuro di etidio è un intercalante chimico che può indurre mutazioni del DNA. Consultare l'ufficio di sicurezza locali prima di utilizzarlo. Indossare sempre i guanti durante la manipolazione di esso. Utilizzare una soluzione commercialmente disponibile della soluzione di etidio bromuro (10 mg/mL) invece di polvere per ridurre al minimo il rischio di inalazione. Allo stesso modo, la luce UV può essere nocivo, quindi assicuratevi di indossare occhiali di sicurezza protezione UV o una maschera. Ritirare il gel sporchi, consigli, guanti e buffer in contenitori dedicati ai rifiuti di etidio.
  8. Una volta che tutte le coppie di primer sono state convalidate individualmente, testare il protocollo multiplex (Figura 3).
    1. Mescolare e diluire tutti i primer esterni insieme a 1 µM. Store i primer multiplex mescolano a-20 ° C per fino a parecchie settimane.
    2. Su ghiaccio, preparare una premiscela contenente: acqua (q.b., 80 µ l), 10 µ l di tampone, 1 µ l di 100 x dNTPs (50 µM di ciascuno), 500 – 1.000 pg dei cDNAs diluito a 1 ng / µ l e 0,5 µ l (2,5 U, 5 U / µ l) di Taq polimerasi: 10x.
    3. Scorri la provetta PCR, girarla e aggiungere due gocce (~ 100 µ l) di olio minerale.
    4. Eseguire un avvio a caldo come descritto nel passaggio 4.5 con 20 µ l di miscela primer multiplex. Dopo 3 min a 95 ° C, eseguire 20 cicli di PCR identiche a quelle del punto 4.6.
    5. Preparare un numero di provette per PCR identici al numero di geni per analizzare. Preparare una premiscela come passaggio 4.8.2, ma con 1 µ l del primo prodotto PCR per il gene come modello. Regolare tutti i volumi in base al numero di geni per analizzare e considerare l'utilizzo di 10% del volume supplementare per compensare errori di pipettaggio.
    6. Agitare delicatamente, girare il tubo, spedizione 80 µ l di premiscela in ciascuna provetta PCR e aggiungere due gocce (~ 100 µ l) di olio minerale per tubo senza toccare il muro o il tappo delle provette.
    7. Eseguire un caldo avviare (vedere punto 4.5) espulsione 20 µ l della miscela primer interno preparata al punto 4.2. Eseguire 35 cicli PCR identico al punto 4.6.
    8. Analizzare i prodotti PCR secondo mediante elettroforesi su gel di agarosio. Assicurarsi che ogni seconda PCR genera un amplicone della dimensione prevista. In caso di amplificazioni inefficiente o non specifici, ri-progettare nuovi primer (passaggi 2.5 – 2,12) e convalidarli (passi 4.2 – 4,8).

5. preparazione e validazione della soluzione intracellulare di Patch-clamp

Nota: Il seguente protocollo descrive la preparazione e validazione di un /gluconate K+basato soluzione interna, ma praticamente qualsiasi tipo di soluzione di patch-clamp può essere utilizzato, purché non ostacolare l'efficienza del RT-PCR. Indossare guanti è obbligatorio per ottenere una soluzione interna RNAsi-libera.

  1. 60 ml di soluzione di registrazione interno patch-clamp, preparare estemporaneamente 10 mL di 0,1 M di KOH.
  2. Sciogliere 11,4 mg di EGTA (0,5 mM finale) in 0,9 mL di 0,1 M di KOH.
  3. Aggiungere 40 mL RNAsi-libera di acqua e sciogliere 2,02 g di K-gluconato (144 mM finale), 143 mg di HEPES (finale 10 mM) e 180 µ l di 1 M MgCl2 (finale 3 mM).
  4. Aggiustare il pH a 7,2 con l'aggiunta di ~ 6 mL di 0,1 M di KOH.
  5. Regolare l'osmolarità a 295 mOsm con ~ 13 mL di acqua RNAsi-libera.
  6. Poiché la soluzione interna è utilizzata anche come un buffer per la trascrizione d'inversione, controllare attentamente la concentrazione di Mg2 + . Compensare una bassa concentrazione2 + Mg nella soluzione interna con l'aggiunta di MgCl2 in seguito per raggiungere una concentrazione finale di 2 mM nella reazione di RT.
  7. Per etichettare la cella raccolta dopo patch-clamp registrazione, aggiungere 2 – 5 mg/mL di biocitina RNAsi-libera alla soluzione interna descritta sopra (punti 5.1-5.5).
  8. La soluzione interna del filtro (porosità, 0,22 µm) e conservare a-80 ° C le aliquote come 100 – 250 µ l.
  9. Per convalidare l'uso della soluzione interna per cella singola RT-PCR, aggiungere 0,5 µ l di RNA totale diluito a 1 ng / µ l a 6 µ l di soluzione di patch-clamp e lasciarlo in panchina per circa 30 min.
  10. Con una micropipetta di 2 µ l, aggiungere 2 µ l di 5 x RT-mix, 0,5 µ l di 20x DDT, inibitore di RNAsi 0,5 µ l e 0,5 µ l RTase e incubare per una notte a 37 ° C.
  11. Girare il tubo. Il ghiaccio aggiungere acqua (q.b., 80 µ l), 10 µ l di tampone 10x e 0,5 µ l (2,5 U, 5 U / µ l) di Taq polimerasi.
  12. Eseguire 40 cicli di PCR utilizzando un set di primer convalidato (passaggi 4.4 – 4.6).
  13. Analizzare i prodotti PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio (Vedi punto 4.7) e verificare che essi hanno la dimensione prevista.
    Nota: Se si omette il 0,5 µ l di RNA totale e sostituendola con acqua RNAsi-libera di 0,5 µ l garantirà che la soluzione interna sia privo di contaminazioni di RNA o DNA.

6. acuta fetta preparazione

Nota: Il presente protocollo descrive la procedura per affettare per giovanile (cioè, meno di 28 giorni postnatali) topi maschi e femmine. Altre soluzioni di taglio, come base di saccarosio di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) sono anche utilizzabili40.

  1. Preparare 2 L di aCSF contenente (in mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 glucosio e saccarosio 15. Per ridurre l'attività di glutamatergic durante la preparazione della fetta, preparare una soluzione di taglio con l'aggiunta di 1 millimetro di acido chinurenico.
  2. Prima di affettare, preparare un kit di dissezione contenente forbici chirurgiche, forbici iris bene, due spatole, pinze, un disco di carta filtro e colla del cianoacrilato.
  3. Utilizzare la soluzione di taglio ghiacciata saturata di O2Co2 (95% / 5%) e raffreddare la camera di taglio a-20 ° C.
  4. Anestetizzare il mouse con un tovagliolo di carta piccolo imbevuto con isoflurano. Dopo ~ 2 min, assicurarsi che il mouse sia sotto anestesia profonda verificando l'assenza di risposta a zampa pizzico.
  5. Rapidamente di decapitare il mouse. Rimuovere il cuoio capelluto e aprire il cranio. Estrarre con cautela il cervello e posizionarlo in un piccolo bicchiere riempito con ghiaccio freddo (~ 4 ° C) taglio soluzione ossigenata con O2Co2.
  6. Rimuovere la camera di taglio da-20 ° C condizioni e rimuovere l'umidità con un tovagliolo di carta.
  7. Accuratamente sezionare il cervello per isolare l'area di interesse, incollatelo sulla camera di taglio e aggiungere la soluzione di taglio ghiacciata ossigenato con O2Co2.
  8. Tagliare fette spesse di 300 µm utilizzando un vibratomo. Trasferirli a temperatura ambiente in una camera di riposa riempita con soluzione di taglio ossigenato e consentire loro di recuperare per almeno 0,5 h.

7. singola cella RT-PCR dopo la registrazione di Patch-clamp

  1. Il sistema di perfusione regolarmente con ~ 100 mL della soluzione di 30% H2O2 e sciacquare estesamente con ~ 500 mL di acqua distillata per evitare la crescita di batteri, in quanto è una fonte trascurata di contaminazione RNasi.
  2. Il filamento di cloro con una pipetta patch riempita con candeggina concentrata ogni giorno di raccolta. Non utilizzare una micropipetta per riempire la pipetta patch ma piuttosto una 20 µ l lunga, fine, flessibile punta collegato a una siringa da 1 mL. Quindi, sciacquare estesamente con RNasi free acqua e asciugare con uno straccio di gas.
  3. Preparare una piccola scatola di ghiaccio contenente 5 x RT-mix e 20 x DTT aliquote. Conservare le aliquote di inibitore RTase e RNasi a-20 ° C in un dispositivo di raffreddamento di benchtop.
  4. Trasferire una fetta nella camera di registrazione irrorata a 1 – 2 mL/min con aCSF ossigenato.
  5. Tirare pipette di patch (1 – 2 µm aprire diametro della punta, MΩ di 3 – 5) da vetro borosilicato indossando guanti e riempire uno di loro con 8 μL di soluzione interna. Tenete a mente che le manopole dell'estrattore della pipetta sono una fonte di contaminazione RNasi.
  6. Posizionare la pipetta nel supporto pipetta mentre indossando guanti nuovi e non toccando il filamento con le dita.
  7. Approccio la pipetta patch con una pressione positiva ed eseguire la registrazione della intero-cellula per caratterizzare la cella di destinazione (Figura 4).
  8. Al fine di preservare i mRNAs, limitare il tempo nella configurazione di cellule intere a 20 min41.
  9. Al termine della registrazione, preparare una provetta PCR 500 µ l riempita con 2 µ l di 5 x RT Mix e 0,5 µ l di 20 x DTT, lo spin e lo memorizza sul ghiaccio.
  10. Raccogliere il citoplasma cellulare applicando una leggera pressione negativa (Figura 4). Visivamente il controllo che il contenuto della cella viene dentro la pipetta pur mantenendo una perfetta tenuta.
    1. Evitare per quanto possibile, raccogliendo il nucleo se alcuni geni introne-di meno sono considerati. In tal caso includere sempre un set di primers puntato amplificando gDNA per sondare per contaminazione genomica.
    2. Se il nucleo è venuta vicino alla punta della pipetta, rilasciare la pressione negativa e spostare la pipetta dal nucleo. Verificare che venga mantenuta la tenuta ermetica e riavviare per raccogliere il citoplasma presso la nuova sede di pipetta.
  11. Interrompere la raccolta quando nessun altro materiale è in arrivo e/o prima di perdere la tenuta.
  12. Ritirare la pipetta delicatamente per formare una patch esterno-out di limitare la contaminazione da detriti extracellulari (Figura 4) e favorire la chiusura della membrana delle cellule per la successiva analisi istochimiche.
  13. Tenete a mente che manopole, micromanipolatori, tastiera del computer, o mouse del computer sono potenziali fonti di contaminazione RNasi. Se essi sono stati toccati durante la registrazione, cambiare i guanti.
  14. Allegare la pipetta per l'espulsore ed espellere il suo contenuto nella provetta PCR applicando una pressione positiva (Figura 1).
  15. Rompere la punta della pipetta nella provetta PCR per aiutare l'insieme del suo contenuto.
  16. Brevemente Centrifugare la provetta, aggiungere 0,5 µ l di inibitore di RNAsi e 0,5 µ l di RTase, mescolare delicatamente, centrifugare nuovamente e incubare per una notte a 37 ° C.
  17. Girare il tubo e conservare a-80 ° C per fino a parecchi mesi fino all'analisi PCR.
  18. Eseguire il primo passaggio di amplificazione direttamente nella provetta contenente il ~ 10 µ l di prodotti RT aggiungendo acqua (q.b., 80 µ l), 10 µ l di tampone 10x 10 e 0,5 µ l (2,5 U) della Taq polimerasi. Quindi, seguire le istruzioni descritte nella procedura 4.8.2–4.8.8.

8. la macchiatura istochimica della cella registrata (facoltativo)

  1. In seguito le registrazioni elettrofisiologiche, mantenere la fetta per 20 min in aCSF ossigenato per consentire la diffusione di biocitina nell'albero assonale e dendritica.
  2. Mettete la fetta in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e correzione di esso durante la notte a 4 ° C con 1 mL di paraformaldeide al 4% in 0.1 M tampone fosfato.
  3. Lavare le fette 4 volte, 5 minuti ciascuno, con 1 mL di tampone fosfato salino (PBS).
  4. Nello stesso bene, permeabilize e saturare la fetta durante 1 ora a temperatura ambiente con 1 mL di PBS completati con 0,25% Triton X-100 e lo 0,2% di gelatina dalla pelle di pesce di acqua fredda (PBS-GT).
  5. Incubare per una notte con una fluorescente contrassegnato avidina diluito a 1/400 in 250 – 500 µ l di PBS-GT.
  6. Lavare 5 volte, 5 min ciascuno, con 1 mL di PBS e montare le fette.

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Risultati

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Una rappresentanza convalida di RT-PCR multiplex è illustrata nella Figura 3. Il protocollo è stato progettato per sondare contemporaneamente l'espressione di 12 geni diversi. Il vGluT1 del trasportatore vescicolare del glutammato è stato preso come un controllo positivo di neuroni glutamatergici42. Il GABA sintetizzare gli enzimi (GAD65 e GAD 67), Neuropeptide Y (NPY) e somatostatina (SOM) sono stati usati come indicatori di GABAergic...

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Discussione

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Singola cella RT-PCR multiplex dopo patch-clamp può sondare contemporaneamente e in modo affidabile l'espressione di più di 30 geni in cellule electrophysiologically identificato5. L'analisi di espressione genica a livello di singola cellula richiede gli iniettori di PCR altamente efficienti. Uno dei passi più limitanti è la raccolta del contenuto della cella. Sua efficienza dipende dal diametro del puntale della pipetta patch, deve essere più grande possibile, mentre le dimensioni della cella di ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il dottor Alexandre Mourot per i suoi commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 01 003; ANR-15-CE16-0010 e ANR-17-CE37-0010-03), BLG è supportato da fellowship dal Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Ringraziamo la struttura animale di IBPS (Parigi, Francia).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
MACAW v.2.0.5NCBIAllineamento multiplo per la progettazione di primer
DitiotreitoloVWR443852A
RT Primer casualiSigma-Aldrich (Merck)11034731001RT
dNTP GEHealthcare Life Sciences28-4065-52RT e PCR
Inibitori della RNasina ribonucleasiPromegaN2511RT
SuperScript II Trascrittasi inversaInvitrogen18064014RT
Taq DNA polimerasiQiagen201205PCR
Olio mineraleSigma-Aldrich (Merck)M5904-5MLPCR
Primer PCRSigma-Aldrich (Merck)PCR / desalinizzato e diluito a 200 &; Provette M
, 0,5 mL, tappo piattoThermoFisher ScientificAB0350RT e PCR
Serie BT10 - 10 &; L Puntale FiltranteNeptune ScientificBT10RT e PCR
Serie BT20 - 20 &; micro; L Puntale FiltranteNeptune ScientificBT20RT e PCR
Serie BT200 - 200 &; L Puntale FiltranteNeptune ScientificBT200RT e PCR
Serie BT1000 - 1000 &; L Punta del filtroNeptune ScientificBT1000.96RT e PCR
DNA Cilindro termicoPerkin Elmer CetusPCR
Bromuro di etidioSigma-Aldrich (Merck)E1510-10MLElettroforesi su gel di agarosio tampone
Tris-Borato-EDTASigma-Aldrich (Merck)T4415-1LElettroforesi su gel di agarosio
UltraPureAgarose Life Technologies16500-500Elettroforesi su gel di agarosio
Φ X174 DNA-Hae III DigestNEB (New England BioLabs)N3026SElettroforesi su gel di agarosio
EDA 290Elettroforesi su gel di agarosioKodak
Elettroforesi Alimentatore EPS 3500Pharmacia BiotechElettroforesi su gel di agarosio
Unità di elettroforesi orizzontale Midi Modello SHU13Sigma-Aldrich (Merck)Elettroforesi su gel di agarosio
Carta liscia con aspetto satinatoFisherbrand1748BSoluzione interna del morsetto patch
Idrossido di potassioSigma-Aldrich (Merck)60377Soluzione interna del morsetto patch
Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N′,Acido N&primo;-tetraaceticoSigma-Aldrich (Merck)E3889Soluzione interna del morsetto patch
HEPESSigma-Aldrich (Merck)H4034Soluzione interna del patch clamp
D-gluconato di potassioSigma-Aldrich (Merck)G4500Soluzione interna del patch clamp
Soluzione di cloruro di magnesioSigma-Aldrich (Merck)M1028Soluzione interna del patch clamp
5500 Osmometro a pressione di vaporeWescorSoluzione interna del patch clamp
BiocitinaSigma-Aldrich (Merck)B4261Soluzione interna del patch clamp
SaccarosioSigma-Aldrich (Merck)S5016Preparazione della fetta
D-(+)-Glucosio monoidratoSigma-Aldrich (Merck)49159Preparazione della fetta
Cloruro di sodioSigma-Aldrich (Merck)S6191Preparazione della fetta
Cloruro di potassioSigma-Aldrich (Merck)60128Preparazione della fetta
Bicarbonato di sodioSigma-Aldrich (Merck)31437-MPreparazione della fetta
Fosfato di sodio monobasicoSigma-Aldrich (Merck)S5011Preparazione della fetta
Soluzione di cloruro di magnesioSigma-Aldrich (Merck)63069Preparazione della fetta
Soluzione di cloruro di calcioSigma-Aldrich (Merck)21115Preparazione
Acido chinurenicoSigma-Aldrich (Merck)K3375Preparazione delle fette
IsofluranoPiramal Healthcare UKPreparazione delle fette
VT 1000SLeica Biosystems14047235613Preparazione delle fette
Soluzione di perossido di idrogenoSigma-Aldrich (Merck)H1009Patch Clamp set-up pulizia
Capillari in vetro a parete sottile con filamentoWorld Precision InstrumentsTW150F-4Patch Clamp
PP-83NarishigePatch Clamp
Eppendorf MicroloaderEppendorf5242956003 Patch Clamp
BX51WI Microscopio verticaleOlympusPatch Clamp
XC-ST70/CE CCD B/N VIDEOCAMERASonyPatch
Clamp Axopatch 200B AmplificatoreMolecular DevicesPatch Clamp
Digidata 1440Molecular DevicesPatch Clamp
pCLAMP 10di software Molecular DevicesPatch Clamp
Siringa da 10 mLTerumoSS-10ESEspulsione
della serie E con corpo dritto (supporto)Phymep64-0997Espulsione
del fosfato di sodio bibasicoSigma-Aldrich (Merck)S7907Rivelazione istochimica
Fosfato di sodio monobasicoSigma-Aldrich (Merck)S8282Rivelazione istochimica
ParaformaldeideSigma-Aldrich (Merck)P6148Rivelazione istochimica
Triton X-100Sigma-Aldrich (Merck)X100Rivelazione istochimica
Gelatina da pelledi pesce d'acqua freddaSigma-Aldrich (Merck)G7041Rivelazione istochimica
Streptavidina, Alexa Fluor 488 coniugatoThermoFisher ScientificS11223Rivelazione istochimica
Piastra a 24 pozzettiGreiner Bio-One662160Rivelazione istochimica
della fetta suite

Riferimenti

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