Questo protocollo descrive le fasi critiche e le precauzioni necessarie per eseguire la singola cella multisala trascrizione d'inversione della polimerasi reazione a catena dopo patch clamp. Questa tecnica è un metodo semplice ed efficace per analizzare il profilo di espressione di un insieme predeterminato di geni da una singola cellula caratterizzata da registrazioni di patch-clamp.
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Articolo metodologico
Singola cella multisala trascrizione inversa Polymerase Chain Reaction dopo Patch-clamp
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La corteccia cerebrale è composto da numerosi tipi di cellule che esibiscono le varie caratteristiche morfologiche, fisiologiche e molecolari. Questa diversità ostacola la facile identificazione e caratterizzazione di questi tipi di cellule, prerequisiti per studiare le loro funzioni specifiche. Questo articolo viene descritto il protocollo multisala singola cella trascrizione d'inversione della polimerasi reazione a catena (RT-PCR), che consente, dopo la registrazione a fette, patch-clamp per rilevare simultaneamente l'espressione di decine di geni in una singola cella. Questo semplice metodo può essere implementato con caratterizzazione morfologica ed è ampiamente applicabile per determinare i tratti fenotipici di vari tipi di cellule e il loro particolare ambiente cellulare, come ad esempio in prossimità di vasi sanguigni. Il principio di questo protocollo è per registrare una cella con la tecnica del patch-clamp, per raccogliere e invertire trascrivere il suo contenuto citoplasmatico, e per rilevare qualitativamente l'espressione di un insieme predefinito di geni di multiplex PCR. Richiede un'attenta progettazione di iniettori di PCR e intracellulare patch clamp soluzione compatibile con RT-PCR. Per garantire una trascrizione selettiva e affidabile rilevamento, questa tecnica richiede anche controlli appropriati dal citoplasma raccolto ai passaggi di amplificazione. Sebbene precauzioni discussi qui devono essere strettamente seguite, praticamente qualsiasi laboratorio elettrofisiologico possibile utilizzare la cella singola multisala tecnica RT-PCR.
Introduzione
La corteccia cerebrale comprende numerosi tipi cellulari coinvolti in vari processi fisiologici. Loro identificazione e caratterizzazione, un prerequisito per la comprensione delle loro specifiche funzioni, può essere molto difficile data la grande diversità morfologiche, fisiologiche e molecolari che caratterizza di tipi delle cellule corticali1 ,2,3,4.
Cella singola multiplex RT-PCR si basa sulla combinazione di patch-clamp e tecniche di RT-PCR. E ' possibile sondare contemporaneamente l'espressione di predefin....
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali utilizzando animali sono state eseguite in stretta conformità con norme francesi (codice rurale R214/87 R214/130) e conforme alle linee guida etiche di Comunità economica europea (86/609/CEE) e la carta nazionale francese sull'etica della sperimentazione animale. Tutti i protocolli sono stati approvati dal comitato etico di Charles Darwin e presentati al Ministero francese dell'educazione e della ricerca (approvazione 2015 061011367540). La struttura animale IBPS è accreditata dalle autorità francesi (A75-05-24).
1. Considerazioni preliminari
Nota: Per evitare contaminazioni, sono co....
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Risultati
Una rappresentanza convalida di RT-PCR multiplex è illustrata nella Figura 3. Il protocollo è stato progettato per sondare contemporaneamente l'espressione di 12 geni diversi. Il vGluT1 del trasportatore vescicolare del glutammato è stato preso come un controllo positivo di neuroni glutamatergici42. Il GABA sintetizzare gli enzimi (GAD65 e GAD 67), Neuropeptide Y (NPY) e somatostatina (SOM) sono stati usati come indicatori di GABAergic.......
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Discussione
Singola cella RT-PCR multiplex dopo patch-clamp può sondare contemporaneamente e in modo affidabile l'espressione di più di 30 geni in cellule electrophysiologically identificato5. L'analisi di espressione genica a livello di singola cellula richiede gli iniettori di PCR altamente efficienti. Uno dei passi più limitanti è la raccolta del contenuto della cella. Sua efficienza dipende dal diametro del puntale della pipetta patch, deve essere più grande possibile, mentre le dimensioni della cella di .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il dottor Alexandre Mourot per i suoi commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 01 003; ANR-15-CE16-0010 e ANR-17-CE37-0010-03), BLG è supportato da fellowship dal Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Ringraziamo la struttura animale di IBPS (Parigi, Francia).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| MACAW v.2.0.5 | NCBI | Allineamento multiplo per la progettazione di primer | |
| Ditiotreitolo | VWR | 443852A | |
| RT Primer casuali | Sigma-Aldrich (Merck) | 11034731001 | RT |
| dNTP GE | Healthcare Life Sciences | 28-4065-52 | RT e PCR |
| Inibitori della RNasina ribonucleasi | Promega | N2511 | RT |
| SuperScript II Trascrittasi inversa | Invitrogen | 18064014 | RT |
| Taq DNA polimerasi | Qiagen | 201205 | PCR |
| Olio minerale | Sigma-Aldrich (Merck) | M5904-5ML | PCR |
| Primer PCR | Sigma-Aldrich (Merck) | PCR / desalinizzato e diluito a 200 &; Provette M | |
| , 0,5 mL, tappo piatto | ThermoFisher Scientific | AB0350 | RT e PCR |
| Serie BT10 - 10 &; L Puntale Filtrante | Neptune Scientific | BT10 | RT e PCR |
| Serie BT20 - 20 &; micro; L Puntale Filtrante | Neptune Scientific | BT20 | RT e PCR |
| Serie BT200 - 200 &; L Puntale Filtrante | Neptune Scientific | BT200 | RT e PCR |
| Serie BT1000 - 1000 &; L Punta del filtro | Neptune Scientific | BT1000.96 | RT e PCR |
| DNA Cilindro termico | Perkin Elmer Cetus | PCR | |
| Bromuro di etidio | Sigma-Aldrich (Merck) | E1510-10ML | Elettroforesi su gel di agarosio tampone |
| Tris-Borato-EDTA | Sigma-Aldrich (Merck) | T4415-1L | Elettroforesi su gel di agarosio |
| UltraPure | Agarose Life Technologies | 16500-500 | Elettroforesi su gel di agarosio |
| Φ X174 DNA-Hae III Digest | NEB (New England BioLabs) | N3026S | Elettroforesi su gel di agarosio |
| EDA 290 | Elettroforesi su gel di agarosio | Kodak | |
| Elettroforesi Alimentatore EPS 3500 | Pharmacia Biotech | Elettroforesi su gel di agarosio | |
| Unità di elettroforesi orizzontale Midi Modello SHU13 | Sigma-Aldrich (Merck) | Elettroforesi su gel di agarosio | |
| Carta liscia con aspetto satinato | Fisherbrand | 1748B | Soluzione interna del morsetto patch |
| Idrossido di potassio | Sigma-Aldrich (Merck) | 60377 | Soluzione interna del morsetto patch |
| Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N′,Acido N&primo;-tetraacetico | Sigma-Aldrich (Merck) | E3889 | Soluzione interna del morsetto patch |
| HEPES | Sigma-Aldrich (Merck) | H4034 | Soluzione interna del patch clamp |
| D-gluconato di potassio | Sigma-Aldrich (Merck) | G4500 | Soluzione interna del patch clamp |
| Soluzione di cloruro di magnesio | Sigma-Aldrich (Merck) | M1028 | Soluzione interna del patch clamp |
| 5500 Osmometro a pressione di vapore | Wescor | Soluzione interna del patch clamp | |
| Biocitina | Sigma-Aldrich (Merck) | B4261 | Soluzione interna del patch clamp |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich (Merck) | S5016 | Preparazione della fetta |
| D-(+)-Glucosio monoidrato | Sigma-Aldrich (Merck) | 49159 | Preparazione della fetta |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich (Merck) | S6191 | Preparazione della fetta |
| Cloruro di potassio | Sigma-Aldrich (Merck) | 60128 | Preparazione della fetta |
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich (Merck) | 31437-M | Preparazione della fetta |
| Fosfato di sodio monobasico | Sigma-Aldrich (Merck) | S5011 | Preparazione della fetta |
| Soluzione di cloruro di magnesio | Sigma-Aldrich (Merck) | 63069 | Preparazione della fetta |
| Soluzione di cloruro di calcio | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | Preparazione |
| Acido chinurenico | Sigma-Aldrich (Merck) | K3375 | Preparazione delle fette |
| Isoflurano | Piramal Healthcare UK | Preparazione delle fette | |
| VT 1000S | Leica Biosystems | 14047235613 | Preparazione delle fette |
| Soluzione di perossido di idrogeno | Sigma-Aldrich (Merck) | H1009 | Patch Clamp set-up pulizia |
| Capillari in vetro a parete sottile con filamento | World Precision Instruments | TW150F-4 | Patch Clamp |
| PP-83 | Narishige | Patch Clamp | |
| Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956003 Patch Clamp | |
| BX51WI Microscopio verticale | Olympus | Patch Clamp | |
| XC-ST70/CE CCD B/N VIDEOCAMERA | Sony | Patch | |
| Clamp Axopatch 200B Amplificatore | Molecular Devices | Patch Clamp | |
| Digidata 1440 | Molecular Devices | Patch Clamp | |
| pCLAMP 10 | di software Molecular Devices | Patch Clamp | |
| Siringa da 10 mL | Terumo | SS-10ES | Espulsione |
| della serie E con corpo dritto (supporto) | Phymep | 64-0997 | Espulsione |
| del fosfato di sodio bibasico | Sigma-Aldrich (Merck) | S7907 | Rivelazione istochimica |
| Fosfato di sodio monobasico | Sigma-Aldrich (Merck) | S8282 | Rivelazione istochimica |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich (Merck) | P6148 | Rivelazione istochimica |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (Merck) | X100 | Rivelazione istochimica |
| Gelatina da pelle | di pesce d'acqua freddaSigma-Aldrich (Merck) | G7041 | Rivelazione istochimica |
| Streptavidina, Alexa Fluor 488 coniugato | ThermoFisher Scientific | S11223 | Rivelazione istochimica |
| Piastra a 24 pozzetti | Greiner Bio-One | 662160 | Rivelazione istochimica |
Riferimenti
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the class....
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Ristampe e permessi
