Tecniche di coltivazione microbiche in loco di arricchimento o in situ possono facilitare l'isolamento dei taxa microbici difficile-a-cultura, soprattutto da ambienti basso-biomassa o geochimico estremi. Qui, descriviamo un assetto elettrochimico senza l'utilizzo di un alimentatore esterno per arricchire i ceppi microbici che sono capaci di trasporto dell'elettrone extracellulare (EET).
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Articolo metodologico
Set-up elettrochimico autoportanti per arricchire i batteri respiring anodo in loco
In questo articolo
Sommario
Abstract
Respirazione anaerobica accoppiato con trasporto di elettroni ai minerali insolubili (denominato extracellulare trasporto dell'elettrone [EET]) è pensato per essere critico per la produzione di energia microbica e persistenza in molti ambienti di sottosuolo, soprattutto quelli difettando di accettori terminali solubile. Mentre EET-capace microbi sono stati correttamente isolati da vari ambienti, la diversità di batteri capaci di EET è ancora poco capito, soprattutto nel difficile a campione, bassa energia o ambienti estremi, come molti di sottosuolo ecosistemi. Qui, descriviamo un sistema elettrochimico in loco per arricchire EET-capace batteri utilizzando un anodo come un accettore di elettroni terminale respiratoria. Questo anodo è collegato al catodo capace di catalizzare la riduzione dell'ossigeno abiotici. Paragonando questo approccio electrocultivation metodi che utilizzano un potenziostato per rettilineo il potenziale di elettrodo, il sistema del due-elettrodo non richiede un'alimentazione esterna. Presentiamo un esempio del nostro arricchimento in loco utilizzato in un stagno alcalino al Cedars, un sito di serpentinizzazione terrestre nella California del Nord. Precedenti tentativi di coltivare batteri riducendo minerali erano infruttuosi, che è probabilmente dovuto la natura di basso-biomassa di questo sito e/o l'abbondanza relativa bassa di metallo riducendo i microbi. Prima di implementare il nostro arricchimento di due elettrodi, abbiamo misurato il profilo verticale della concentrazione di ossigeno disciolto. Questo ci ha permesso di posizionare il carbonio feltro carbonio placcato platino e anodo catodo a profondità che sosterrebbe anaerobico ed aerobico elabora, rispettivamente. A seguito di incubazione in loco, abbiamo ulteriormente arricchito l'elettrodo anodico in laboratorio e confermato una comunità microbica distinta rispetto alla superficie associata o biofilm comunità normalmente osservate presso il Cedars. Questo arricchimento successivamente ha condotto all'isolamento del primo elettrogenico microbo da cedri. Questo metodo di arricchimento microbico in loco ha il potenziale per migliorare notevolmente l'isolamento di batteri EET-capace da biomassa bassa o difficili da habitat di campione.
Introduzione
Diversi microbi riduzione del minerale sono stati indicati per utilizzare fase solida minerali come accettori terminali, dai processi di trasporto dell'elettrone extracellulare (EET) che conducono elettroni all'esterno della cella via redox enzimi1. EET è fondamentale, non solo per processi di microbo-minerale ma anche energia applicata e tecnologie ambientali, ad esempio celle a combustibile microbico2, elettrodo sintesi3e bioremediation4. EET-capaci nuovi batteri sono molto ricercati e sono state ampiamente studiati da un punto di vista fondamentale o applicata5. Tuttavia, abbiamo solo limitato spaccato il significato ecologico o biogeochimico di questi batteri. La maggior parte dei microbi EET-capace è stata isolata dopo arricchimento da aqua, sedimenti o digestori anaerobici utilizzando accettori solido come MnO2, Fe2O3 o elettrodi bilico in laboratorio6, 7 , 8. Tuttavia, questi metodi spesso producono simili consorzi e potenzialmente perdere taxa più sensibili che può dominare basso consumo energetico o sistemi a biomassa bassa, polarizzare la capacità di questi microbi di adattarsi al laboratorio o coltura axenica ambiente9 . Solitamente per gli ambienti di biomassa basso, grandi quantità di acqua da un sito vengono filtrati per concentrare le cellule batteriche. Tuttavia, batteri in grado EET esibiscono spesso metabolismi anaerobici e pertanto esposizione all'ossigeno potrebbe ulteriormente inibire o impedire la loro coltivazione. Metodologie alternative in loco per concentrare le cellule senza esporli a ossigeno potrebbero facilitare l'isolamento dei batteri EET-capace. Qui, segnaliamo i dettagli di installazione per una tecnica elettrochimica in loco arricchire microbo EET-capace per un lungo periodo di tempo senza la necessità di un alimentatore esterno.
Utilizzando i nostri esperimenti di electrocultivation da una sorgente altamente alcalina nel nord della California, i cedri10, descriviamo questa tecnica elettrochimica in loco. La geochimica delle sorgenti presso The Cedars sono risentito di serpentinizzazione nel sottosuolo. Le molle sono altamente riduttive, con concentrazioni di ossigeno inferiore al limite di rilevazione sotto l'interfaccia di acqua aria mettendo in evidenza il potenziale di produzione di energia microbica attraverso EET in questo ambiente funzionalmente anossico11. Tuttavia, non vi è alcuna prova a sostegno di microbi EET-capace da cedri (in 16S rRNA o analisi metagenomica). Anche se questo ambiente è stato caratterizzato come accettore di elettroni limitato, il potenziale per l'utilizzo di minerali insolubili come accettori terminali, compreso i minerali come il ferro che scopre minerali che derivano da serpentinizzazione (vale a dire, magnetite), non è stato estesamente esaminatori12. Abbiamo, pertanto, distribuito il nostro sistema elettrochimico al campeggio Spring, una sorgente di pH elevato ai cedri, per arricchire per EET-capace di microbi (Figura1)13.
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Protocollo
1. costruzione di un sistema di due elettrodi per incubazione ambientale
-
Preparazione del materiale dell'anodo e trattamento di carbonio sentivo elettrodo (Figura 2).
- Tagliare il carbonio sentivo di dimensioni pari a seconda di arricchimento di biomassa desiderata. Immergere ogni elettrodo in etanolo al 90% per 30 minuti, poi sciacquare almeno 8 volte con acqua deionizzata, sonicating per 1 min dopo ogni risciacquo.
- Lavare gli elettrodi due volte in 1 M HCl, mescolando per un minimo di 12 ore per ogni lavaggio.
- Asciugare gli elettrodi in forno caldo (37 ° C) per 6 – 12 h o fino a quando è libero di liquido.
- Collegare gli elettrodi al filo di titanio utilizzando resina epossidica di grafite secondo il protocollo del produttore su una zolla di politetrafluoroetilene (superficie antiaderente).
Nota: Abbiamo usato un filo di titanio a causa della sua elevata tolleranza alla corrosione aerobica. - Cuocere l'elettrodo a 120 ° C per 6 h.
- Testare la resistenza tra filo di titanio e carbonio sentito con un ohmmetro e confermare che la resistenza tra il filo e feltro elettrodi è inferiore a 5 ohm.
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Electroplation di platino sul carbonio sentivo elettrodo per la preparazione del materiale catodico
- Immergere gli elettrodi feltro di carbonio, preparati al punto 1.1, a 2 M di KOH per un minimo di 12 ore in un contenitore di vetro.
- Per la pulizia elettrochimica, posizionare l'elettrodo come elettrodo (noi) di lavoro in un reattore di tre elettrodi, che ospita anche un riferimento (RE) e il controelettrodo (CE). Collegare noi, RE e CE per il potenziostato di morsetti a coccodrillo. Confermare tutte le connessioni con un ohmmetro.
Nota: Abbiamo usato un Ag/AgCl (KCl saturata) elettrodo e un platino filo come RE ed il CE, rispettivamente. - Portamento dell'elettrodo a 1.0 V vs. Ag/AgCl per 600 s in soluzione elettrolitica contenente 2 M KOH (usando una quantità sufficiente per immergere l'elettrodo tutta). Estrarre l'elettrodo dal reattore elettrochimico (che è fatta di vetro). Sciacquare l'elettrodo in acqua deionizzata almeno 8 volte, sonicating per 1 min dopo ogni risciacquo. Elettrodi a secco a 100 ° C per almeno 12 ore.
- Per preparare la soluzione di placcatura, aggiungere 100 g di acido citrico, 5 g di solfato di sodio e 2 g di diidrogeno esacloroplatinato (IV) esaidrato a 1 L di acido solforico 2M.
- Pesare puliti e asciugati elettrodi come preparato in passaggi 1.2.1–1.2.2 e poi copertina l'elettrodo in una soluzione di placcatura come preparata al punto 1.2.3. Sottoporre ad ultrasuoni l'elettrodo nella soluzione di placcatura tre volte per 30 s ciascuno.
- Placcare gli elettrodi da rettilineo il potenziale di elettrodo a -0,2 V vs Ag/AgCl per 460 s in soluzione di placcatura. Sciacquare gli elettrodi due volte in acqua deionizzata e gettare i rifiuti platino.
- Risciacquare gli elettrodi in acqua deionizzata almeno 3 volte, sonicating per 20 s dopo ogni risciacquo. Risciacquare senza sonicazione almeno tre volte di più.
- Elettrodi a secco a 100 ° C per almeno 12 h. pesare elettrodo per quantificare il platino elettrolitico sul carbonio sentivo elettrodo.
2. costruzione e installazione del sistema di due elettrodi
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Indagine del sito di installazione per ciascun elettrodo nell'ambiente naturale.
- Calcolare la concentrazione di ossigeno mediante una sonda di ossigeno disciolto (DO).
- Controllare il profilo di profondità di DO nel sito.
Nota: Le condizioni ambientali desiderate per l'anodo sono anossia e idratazione costante. Se lo si desidera, è possibile rimuovere l'influenza della fotosintesi oxygenic proteggendo l'anodo dalla luce. Le condizioni ideali per il posizionamento di catodo sono costantemente idratate e vicino a superficie acque essere ossica. Se necessario, allegare galleggianti per mantenere la superficie di contatto nel catodo.
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Costruzione del sistema di incubazione di 2 elettrodi di celle a combustibile tipo
- Collegare il filo isolato della lunghezza desiderata e una cavo di filo di titanio dagli elettrodi (un anodo e un catodo placcata platino) ruotando le due linee. Coprire le connessioni con la cera resistente all'acqua e proteggere ulteriormente utilizzando guaine termorestringenti grado marino.
- Collegare due fili con un catodo e un anodo di un resistore di resistenza conosciuta.
Nota: Per sistemi biologici, resistenze inferiore (da 10 a 1.000 Ω) risultato nell'attività biologica più coerente. Se lo si desidera, una resistenza ad alta resistenza impedirà l'attività biologica, come controllo negativo. Per evitare una corrosione di tutte le connessioni tra resistenza e cavi, li abbiamo protetti con guaine termorestringenti.
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Misura di tensione e registrazione di temperatura nel tempo.
- Controllare la tensione tra le estremità del resistore per la stima della produzione attuale dalla reazione di cella a combustibile.
- Misurare la differenza di tensione nel tempo utilizzando un voltmetro di registrazione di dati con le connessioni appropriate verso l'anodo e il catodo (Vedi il protocollo del produttore).
Nota: La registrazione di temperatura simultaneo dei dati è facoltativa, ma queste informazioni consentono di correlare modifiche in corrente a abiotici rispetto a fluttuazioni biologiche.
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Protezione dei data logger e collegamenti elettrici
- Utilizzare un sacchetto stazionario e/o plastica per proteggere il logger e tutti i collegamenti elettrici dalla pioggia.
- Fissare il sacchetto di plastica e cavi strettamente per proteggere dal vento forte. Un esempio è illustrato nella Figura 1.
3. raccolta del campione elettrodo dall'ambiente naturale
- Per impedire che la qualità del campione anodo viene danneggiato a causa di contaminazione di ossigeno, raccogliere l'elettrodo in condizioni anaerobiche.
- Almeno 30 min prima della raccolta del campione di elettrodo, mettere una provetta in posizione anaerobica. Ad esempio, mettere la provetta e il coperchio separatamente nella parte inferiore dello stagno per rendere la bottiglia all'interno anaerobica.
- Tagliare il cavo di titanio dall'elettrodo con un cutter filo, raccogliere il campione di elettrodo nella provetta delicatamente e sigillarlo in zona anaerobica acqua. Per mantenere il campione fresco, conservare il campione a 4 ° C immediatamente dopo la raccolta del campione.
Nota: In alternativa, gli elettrodi possono essere trasferiti direttamente su anossico (N.2 ha eliminato l'inceppo) medio. Abbiamo usato un mezzo di cedri (descritto da Suzuki et al. 11) che è stato progettato dalla geochimica acquosa misurata presso il sito e modificato per fornire nutrienti sufficienti per la crescita microbica. Questo supporto è stato modificato per esperimenti di laboratorio diversi.
4. laboratorio conferma per produzione corrente e l'analisi del DNA
-
Elettrochimica conferma per capacità di produzione corrente di consorzi microbici allegare all'elettrodo.
- Costruire un reattore elettrochimico14,15 con l'elettrodo campionata, un filo di platino e un Ag/AgCl (KCl saturata) elettrodo come noi, CE e RE, rispettivamente, in una camera anaerobica. Riempire il reattore elettrochimico con cedri mezzo contenente i donatori dell'elettrone di carboidrati solubili.
- Equilibrio il potenziale di elettrodo a + 0,2 V vs Ag/AgCl e misura la produzione corrente.
-
Estrazione del DNA dal campione elettrodo utilizzando un DNA microbico kit (Vedi tabella materiali).
- Pulire l'interno del portaoggetti anaerobica con etanolo al 70% e mettere un piatto sterilizzato su foglio di alluminio.
Nota: Camera anaerobica mantiene la concentrazione di ossigeno inferiore a 1 ppm di mantenere un'atmosfera di idrogeno intorno al ~ 2 – 3% a consuma ossigeno in presenza di un catalizzatore al Palladio. - Aprire il reattore elettrochimico in glove box, mettere l'elettrodo di campione sul piatto e tagliare a una dimensione a misura il tubo utilizzato nel kit del DNA. Procedere con il protocollo del produttore.
- Pulire l'interno del portaoggetti anaerobica con etanolo al 70% e mettere un piatto sterilizzato su foglio di alluminio.
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Risultati
Produzione attuale è stata misurata con successo per circa 3 mesi, utilizzando un registratore di dati di tensione come mostrato nella Figura 3. Questa volta è stato scelto perché era il più lungo periodo di incubazione stabile per la primavera, a causa di forte caduta piogge che interessano la primavera. Un periodo più breve potrebbe essere sufficiente, anche se un periodo più lungo potrebbe fornire più forte arricchimento della biomassa. Abbiamo confermato ...
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Discussione
Nello studio descritto, vi mostriamo l'arricchimento di un consorzio microbico, collegato con la produzione di corrente in situ . I modelli osservati in corrente supporto attività microbica in questo sistema nel breve e lungo tempo scale. Il passaggio fondamentale per la costruzione di un sistema funzionale del due-elettrodo (tipo di cella a combustibile) è identificando ed utilizzando una posizione con una scuderia di livello dell'acqua e la concentrazione di ossigeno nell'ambiente. Il catodo è esposto all'ossi...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo riconoscere Roger Raiche e David McCrory per consulenza su posizioni per l'incubazione di lungo termine e che ci permette di raggiungere i cedri. Ringraziamo anche la squadra del campo Cedars durante la stagione 2013-2014: Shino Suzuki, Shunichi Ishii, Greg Wanger, Grayson Chadwick, Bonita Lam e Matthew Schechter. Additional grazie Shino Suzuki e Gijs Kuenen per ricerca penetrante e la coltura di supporto. Questo lavoro è stato finanziato attraverso una sovvenzione per giovani scienziati A e B della Japan Society per la promozione della scienza (JSPS) KAKENHI concessione numero 17H 04969 e 26810085, rispettivamente e l'Agenzia giapponese per la ricerca medica e lo sviluppo (17gm6010002h0002). Finanziamento degli Stati Uniti fornito da noi Office di Global Naval Research (N62909-17-1-2038) e il centro per indagini di Dark Energy della biosfera (C-DEBI) (OCE0939564) e l'Istituto di Astrobiologia della NASA - vita metropolitana (NAI-LU) (NNA13AA92A). Parte di questo lavoro è stato condotto come parte di una società del Giappone per la promozione delle scienze: a breve termine postdoctoral fellowship per Annette Rowe (PE15019) presso l'Università di Tokyo nel laboratorio di Kazuhito Hashimoto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Foglio di feltro di carbonio | n/a | n/a | Utilizzato per anodo e catodo |
| Filo di titanio | La Nilaco Cooporation | TI-451485 | Utilizzato per costruire il sistema di celle a combustibile |
| Grafite epossidica | Elettrolitica lnc. | n/a | Utilizzato per collegare gli elettrodi e il filo Ti |
| Forno di essiccazione | Yamato | DY300 | cuocere l'elettrodo per solidificare la grafite conduttiva epossidica |
| Multimetro digitale | Fluke | 616-1454 | per controllare il valore ohmico di resistenza |
| Sonda di ossigeno disciolto | Sper Science | # 850045 | per controllare la concentrazione di ossigeno nel ambienti |
| Resistore | Sodial | Utilizzato per costruire il sistema di celle a combustibile | |
| Filo conduttore | Pico | 81141s | Utilizzato per costruire il sistema di celle a combustibile |
| Voltmetro e registratore di dati | T& D corporation | VR-71 | Utilizzato per la registrazione dei dati |
| Idrogeno Esacloroplatino (IV) Esaidrato | wako | 18497-13-7 | Utilizzato per elettropolazione |
| Acido citrico | Wako | 038-06925 | Utilizzato per elettropolazione |
| Acido solforico | Wako | 192-04696 | Utilizzato per elettropolazione |
| HCl Wako | 083-01095 | Utilizzato per il lavaggio degli elettrodi | |
| Cilindro di vetro | N/A | N/A | Realizzato su misura, utilizzato come |
| coperchio e base in PTFE | elettrochimico N/A | N/A | Realizzato su misura, utilizzato come copertura e fondazione del reattore elettrochimico |
| Gomma butilica | N/A | N/A | Realizzato su misura, inserito tra ogni componente del reattore elettrochimico |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Utilizzato come porta di iniezione del reattore elettrochimico |
| Elettrodo di ossido drogato con stagno di indio (ITO) | GEOMATEC | No.0001 | Utilizzato come elettrodo di lavoro, elettrodo saturo 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Utilizzato come elettrodo di riferimento, Φ |
| Filo di platino | Il Nilaco Cooporation | PT-351325 | Utilizzato come controelettrodo |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Utilizzato per i mezzi di cedro (CMS) |
| CaCO3 | Wako | 030-00385 | Utilizzato per CMS |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Utilizzato per CMS |
| MgCl2 e toro; 6H2O | Wako | 135-00165 | Utilizzato per CMS |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Utilizzato per CMS |
| Na2SO4 | Wako | 194-03355 | Utilizzato per CMS |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | Utilizzato per CMS |
| CABS | SANTA CRUZ | SC-285279 | Utilizzato per CMS |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Utilizzato per la precoltivazione |
| Macchina per autoclave | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Utilizzato per la sterilizzazione del reattore elettrochimico e del fluido |
| Banco pulito | SANYO | MCV-91BNF | Utilizzato per prevenire la contaminazione del reattore elettrochimico e del mezzo con altri microbi Separatore |
| centrifuga | Eppendorf | 5430R | Velocità di rotazione fino a 6000&volte; g è necessario |
| Generatore di azoto gassoso | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | La bombola di azoto può essere utilizzata anche al posto del generatore di gas |
| Spettrometro UV-VIS | SHIMADZU | UV-1800 | Utilizzato per l'ottimizzazione della densità cellulare |
| Potenziostato | BioLogic | VMP3 | Utilizzato per la formazione di biofilm e gli esperimenti sull'effetto isotopico cinetico |
| Circolatore d'acqua termico | AS ONE | TR-1A | Utilizzato per il mantenimento della temperatura del reattore elettrochimico |
| Gabbia di Faraday | HOKUTO DENKO | HS-201S | Utilizzato per esperimenti elettrochimici |
| Camera anaerobica | COY | TypeB (vinile) | TO condurre esperimenti in condizioni anaerobiche |
| Kit di estrazione del DNA Ultraclean | MoBio |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
