Qui, descriviamo l'induzione della sindrome nefrotica sperimentale nei topi di 129S1/SvImJ di iniezione rapida retrobulbar di doxorubicina. Trattiamo anche topi nefrosica con pellet di rilascio prolungato contenenti aprotinina per inibire l'attività della proteasi della serina urinaria e prevenire la ritenzione di sodio.
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Articolo metodologico
Induzione della sindrome nefrotica in topi da iniezione Retrobulbar di doxorubicina e prevenzione della ritenzione di Volume di rilascio prolungato aprotinina
In questo articolo
Sommario
Abstract
La sindrome nefrotica è la manifestazione più estrema della malattia renale proteinuric e caratterizzata da proteinuria pesante, ipoalbuminemia ed edema a causa di ritenzione di sodio e l'iperlipidemia. Per studiare la fisiopatologia di questa sindrome, roditore sono stati sviluppati modelli basato sull'iniezione di sostanze tossiche quali doxorubicina provocando danni Podocita. In topi, solo alcuni ceppi sono sensibili a questo modello. Nei topi selvatici 129S1/SvImJ, la somministrazione di doxorubicina tramite iniezione endovenosa rapida al seno retrobulbar induce la sindrome nefrotica sperimentale che caratterizza tutti i sintomi della malattia umana, compreso l'edema e ritenzione di sodio. Dopo l'inizio della proteinuria, topi esposizione aumentata attività della proteasi della serina urinaria che conduce all'attivazione del canale epiteliale del sodio (ENaC) e ritenzione di sodio. L'inibizione farmacologica della proteasi della serina urinaria dal trattamento con rilascio prolungato aprotinina abroga l'attivazione ENaC e previene la ritenzione di sodio. Questo modello è ideale per studiare la fisiopatologia della proteasuria, cioè., l'escrezione delle proteasi della serina attivo che causano l'attivazione di ENaC di proteolisi di sua subunità γ. Questo può essere considerato come il meccanismo principale di attivazione di ENaC e ritenzione di sodio nella malattia renale proteinuric.
Introduzione
La sindrome nefrosica è caratterizzata da iperlipidemia, ipoalbuminemia, edema e proteinuria pesante e può essere considerata come la manifestazione più estrema della malattia renale proteinuric. Nei roditori, sindrome nefrotica sperimentale può essere indotta da una singola iniezione di antracicline o con puromicina che conduce a danno del Podocita e somiglia malattia minima del cambiamento umano e glomerulosclerosis segmentale focale (FSGS)1. Dopo la sua prima descrizione nel 1955 da Frenk et al. 2, nefrosi di nucleosidici con puromicina (PAN) in ratti sono diventato un modello standard per studiare la fisiopatologia della sindrome nefrotica in numerosi studi3,4,5,6. Nei topi, il modello corrispondente può essere indotta da antraciclina doxorubicina7. Tuttavia, c'è una forte dipendenza ceppo geneticamente determinato da almeno due loci genetici8. Inoltre, ci sono differenze nella risposta proteinuric e nel corso della sindrome nefrotica9,10. Mediante iniezione endovenosa rapida di doxorubicina e topi 129S1/SvImJ via il seno retrobulbar, risposte a proteinuria raggiungono valori che sono sufficienti per indurre le caratteristiche tipiche della sindrome nefrosica, in particolare ritenzione di volume caratterizzato da ascite e quasi privo di sodio dell'urina7. Ritenzione di sodio nella sindrome nefrosica sperimentale è stata presunta per essere il risultato dell'attivazione del canale epiteliale del sodio (ENaC) nel tubulo distale da proteasi della serina aberrante filtrata come la plasmina causando proteolisi della sua subunità γ4 ,11,12. Recentemente, questo concetto è stato dimostrato in topi nefrotico che erano protetti da attivazione proteolitica di ENaC e ritenzione di sodio dal trattamento con la serina proteasi inibitore aprotinina che era ugualmente efficace come l'ENaC blocker amiloride13. Per assicurare la fornitura continua di tubulo distale, aprotinina è stato amministrato tramite rilascio prolungato impiantato sottocute pellet. Gli studi futuri sono necessarie per identificare le proteasi della serina che sono responsabili per l'attivazione proteolitica di ENaC nella sindrome nefrosica, che è pensata per la situazione umana in parallelo. Per questo scopo, sindrome nefrotica indotta da doxorubicina è un modello prezioso che può essere utilizzato nei topi wild-type o ampliato a topi geneticamente modificati. I vantaggi includono basso costo del farmaco, minore complessità di gestione e buona riproducibilità14.
In questo articolo, dimostriamo l'induzione della sindrome nefrotica sperimentale di iniezione endovenosa rapida di doxorubicina al seno retrobulbar e l'impianto di pellet a rilascio prolungato contenenti aprotinina per inibire la proteasi della serina urinaria attività come misurato con un test cromogenico.
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Protocollo
Tutti i metodi sono stati condotti secondo l'istituti nazionali di salute Guida per la cura e uso di animali da laboratorio e la legge tedesca per il benessere degli animali, e sono stati approvati dalle autorità locali (Regierungspräsidium Tübingen).
1. induzione della sindrome nefrotica sperimentale di doxorubicina iniezione al seno Retrobulbar
- Preparare una siringa da 0,5 mL con una cannula di 30G montato contrassegnando la posizione di arresto del pistone.
- Calcolare il volume di iniezione di doxorubicina per uomo (7,25 µ l/g del peso corporeo (bw) uguale a doxorubicina bw 14,5 µ g/g) e topi femminili (6,9 µ l/g bw pari a 13,8 doxorubicina di bw µ g/g) in base al peso del corpo dalla mattina.
Nota: La data dose è appropriata per l'induzione della sindrome nefrotica. Piccole modifiche nel dosaggio conducono ad un corso diverso cruciale della nefropatia raggiungendo da malattia renale cronica lieve con solo piccoli cambiamenti nel tasso di filtrazione glomerulare (doxorubicina bw di 12,6 µ g/g) a renale acuta insufficienza (doxorubicina bw di 15,4 µ g/g)7, 15. - Riscaldare la quantità calcolata di soluzione di doxorubicina (2 µ g / µ l) in una camera calda a 37 ° C.
Attenzione: La doxorubicina è nocivo se ingerito e può causare il cancro. Sempre indossare guanti se lavorando con doxorubicina ed evitare qualsiasi contatto con la pelle. - Riempire la siringa con la soluzione di doxorubicina fino al punto di marcatura e impostare il saldo a zero. Riempire la siringa con il volume di iniezione e controllare il volume pesando la siringa.
- Narcotize il mouse profondamente con 5 vol % isoflurane utilizzando un vaporizzatore e il flusso di ossigeno di 2 L/min.
- Non usare pomata per gli occhi prima dell'iniezione. L'operatore ha bisogno di una visione chiara della cavita ' orbitale per l'esecuzione di un'iniezione retrobulbar sicuro e di successo.
- Valutare il livello di anestesia di pedale reflex ed eventualmente regolare consegna anestetica prima di iniziare ad iniezione.
- Posizionate il mouse a un decubito laterale di destra con dorso rivolto verso il corpo dell'operatore e la testa di fronte a mano iniezione dell'operatore.
Nota: La procedura è descritta per una persona di mano destra, per persone mancine eseguire l'iniezione con la mano sinistra è più facile fare la posizione e iniezione invertita destra a sinistra. - Attentamente sporgono dalla cavità oculare bulbo oculare sinistro del mouse applicando pressione delicata per la pelle, dorsale e ventrale per l'occhio.
- Puntura del seno di sinistra retrobulbar dall'angolo interno dell'occhio (commissura palpebrale mediale). Evitare il contatto con il bulbo oculare di mouse´s.
- Leggermente inclinate la siringa e iniettare l'intero volume in una sola volta. Assicurarsi che il volume viene iniettato senza resistenza e senza segni di stravaso come exopthalmus o perdite dal sito di iniezione.
- Poiché la doxorubicina è una sostanza altamente tossica, controllare benessere almeno una volta al giorno utilizzando un foglio di punteggio secondo Morton e Griffiths et al. 16 e prestare speciale attenzione al sito di iniezione. Se eventuali segni di stravaso come exopthalmus, la chiusura della palpebra alterata o segni di necrosi come occure lesioni della pelle o gonfiore dopo l'iniezione o nei giorni successivi, il mouse dovrebbe essere euthanized.
2. l'impianto di pellet a rilascio prolungato contenenti aprotinina
- Pellet di ordine con la dose desiderata per durata giorno e rilascio in anticipo. In caso di aprotinina, scegliere una dose di 1 mg al giorno per essere rilasciato in 10 giorni.
Nota: In questo studio, i pellet di aprotinina contengono una dose di 10 mg.- Conservare i pellet in luogo asciutto ed evitare qualsiasi esposizione all'umidità.
- Preparare gli elementi richiesti per la chirurgia, tra cui un paio di forbici per capelli, un paio di forbici di preparazione della pelle, un bisturi, pinzette chirurgiche, due paia di pinzette di tessuto, un porta-aghi e 15cm monofile sutura non riassorbibile.
- Sterilizzare gli strumenti utilizzando uno sterilizzatore calore per 5 min a 240 ° C. Prima di utilizzare gli strumenti, attendere 5 min fino a quando non raggiungono la temperatura ambiente.
- Evitare il contatto dei consigli strumento sterilizzato per superfici non sterili.
- Per evitare ustioni cutanee caldi strumenti.
- Sterilizzare gli strumenti utilizzando uno sterilizzatore calore per 5 min a 240 ° C. Prima di utilizzare gli strumenti, attendere 5 min fino a quando non raggiungono la temperatura ambiente.
- Narcotize del mouse con isoflurano 5 vol % seguita da 1,5 vol % utilizzando un vaporizzatore e ossigeno flusso di 2 L/min.
- Posizionare il mouse in posizione prona su un dispositivo per riscaldare coperto con uno strato di garza per evitare lesioni termiche al mouse. Temperatura in superficie è di circa 37 ° C.
- Proteggere gli occhi con l'unguento.
- Rimuovere i peli in mezzo torna in un'area di circa 0,5 cm2 con le forbici o un tagliacapelli e disinfettare la pelle senza peli con un disinfettante adatto per la disinfezione della pelle. Rimuovere come capelli meno possibile così rimane più difficile per il mouse raggiungere la ferita e thread termina più tardi e per mantenere la temperatura corporea.
- Incidere la pelle senza peli con un bisturi in direzione cranio-caudale di una lunghezza di circa 5 mm. Prepare un sacchetto laterale sinistro di circa 1 cm di profondità nel tessuto connettivo sottocutaneo usando una preparazione smussata.
- Valutare il livello di anestesia di pedale reflex ed eventualmente regolare consegna anestetica prima di iniziare l'intervento chirurgico.
- Inserire un 10-giorno rilascio pellet il sacchetto laterale sinistro preparato utilizzando pinzette sterili per tessuti. Lasciare la pallina nella parte inferiore del sacchetto in posizione planare.
- Evitare il contatto del pellet di liquido e umidità fino a inserito nella busta di preparato.
- Chiudere la pelle con 2-3 punti di sutura. Lasciare solo le estremità del filo molto breve per rendere più difficile per il mouse per aprire le suture di rosicchiamento.
- Posizionare i topi singolarmente per ridurre il disagio postoperatorio e per prevenire l'apertura delle suture di rosicchiamento. Tenere il mouse in vista fino a quando ha riacquistato sufficiente coscienza dopo narcosi.
Nota: non c'è nessuna necessità di trattamento del dolore postoperatorio poiché questo intervento è ben tollerato senza alcun segno di disagio o dolore. In alternativa si consiglia di analgesici topici, ad es. una goccia di bupivacaine sull'incisione prima della chiusura che fornirebbe fino a 8 h di analgesia.
3. valutazione modello induzione, segni della sindrome nefrotica e benessere
- Raccogliere le urine del mattino (8:00) in una tazza di reazione (1,5 mL) ogni giorno dal giorno iniezione massaggiando la vescica.
- Proteinuria di misure mediante analisi della proteina di Bradford e normalizzare in creatinina.
Nota: Per l'induzione della sindrome nefrotica, proteinuria dovrebbe raggiungere una soglia di creatinina di 120 mg/mg tra 7 e 10 giorno dopo l'iniezione di doxorubicina.
- Proteinuria di misure mediante analisi della proteina di Bradford e normalizzare in creatinina.
- Cercare lo sviluppo di ascite. Verifica per aumento della circonferenza addominale o fianchi sporgenti.
- Pesa il mouse, le palline di cibo e la bottiglia bevente al mattino (8:00) ogni giorno.
- Verifica benessere almeno una volta al giorno utilizzando un foglio di punteggio secondo Morton e Griffiths et al. 16
4. misurazione della proteasi della serina urinaria con un test cromogenico
- Preparare soluzione substrato aggiungendo 15 mL di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS) per una bottiglia di 25 mg di substrato cromogenico liofilizzata S-2251, producendo una concentrazione di 2 mM. Sciogliere aprotinina in PBS per ottenere una soluzione di aprotinina con una concentrazione di 2 mg/mL.
- Memorizzare le soluzioni preparate a-20 ° C. Questo rallenta significativamente la auto-degradazione di S-2251. Non utilizzare soluzioni vecchie con una forte tonalità di giallo.
- Utilizzare la soluzione di lavoro del substrato appena preparata o scongelati e caldo in una camera di calore di 37 ° C.
- Scongelare i campioni di urina a temperatura ambiente.
- Prevenire il degrado della proteasi evitando ripetuto scongelamento e ricongelamento. Conservare i campioni di urina a-20 ° C.
- Utilizzare una piastra microtiter di 96 adatta per misurazione fotometrica. Aggiungere 3 µ l di urina non diluito in ciascuno dei due pozzetti e aggiungere 50 µ l di soluzione di lavoro del substrato con 3 µ l di soluzione PBS o di aprotinina ai pozzetti. Coprire la piastra con un foglio sigillante.
- Incubare la piastra microtiter coperto per 60 min in una camera di calore di 37 ° C.
- Misurare la densità ottica di ciascun pozzetto a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
- Prendere la differenza tra il diametro esterno senza aprotinina e con aprotinina come attività di urinaria aprotinina sensibili serina proteasi.
Nota: Misurazione di un campione accoppiato con e senza aprotinina aumenta la specificità del test poiché il substrato potrebbe anche essere clivato da altre proteasi che non giocano un ruolo fisiopatologico.
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Risultati
Dopo l'induzione della narcosi isoflurano, doxorubicina è stato iniettato rapidamente via il seno sinistro retrobulbar. L'intero volume di 7,25 µ l/g bw è stato iniettato senza alcuna resistenza e lo stravaso dimostrando correggere endovenosa posizione della cannula. Il mouse ha recuperato da narcosi velocemente e ha avuto nessun danno in quel giorno e da allora in poi. In particolare, non c'era alcun segno di danno all'occhio sinistro. Dopo doxorubicina iniezione, cibo e l'assunzione flu...
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Discussione
Qui, dimostriamo che iniezione di doxorubicina tramite iniezione retrobulbar del seno induce la sindrome nefrotica sperimentale nei topi di 129S1/SvImJ con proteinuria, ritenzione di sodio, hypoalbumenia e iperlipidemia. Tuttavia, ci sono due problemi critici che devono essere presi in considerazione quando si utilizza questo modello. In primo luogo, l'induzione del modello è strettamente dipendente dalla dose e deviazioni della dose di doxorubicina piccolo come 0,3 µ g/g di influenzano la risposta dei topi
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, AR 1092/2-1).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| supplies | |||
| BD Micro FINE + U-40 (0,30 mm x 8 mm) | BD Deutschland GmbH, Heidelberg, Germania | PZN: 07468060 | siringhe |
| ETHILON*II (5/0, 16 mm, 3/8c, 45 cm) | Johnson& Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germania) | EH7823H | sutura |
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| reagenti | |||
| aprotinina (6000 KIU/mg) | LOXO, Heidelberg, Germania | CAS 9087-70-1 | |
| Bepanthen, Augen- und Nasensalbe | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germania | PZN: | unguento |
| Chromogenix S-2251 | HAEMOCHROM DIAGNOSTICA GmbH, Essen, Germania | 82 0332 39 | substrato cromogenico |
| doxorubicina (2,0 µ g/µ L) | Cell Pharm, Bad Vilbel, Germania | CAS 25316-40-9 | doxorubicina |
| isofluran CP (1 mL/mL) | CP-Pharma, Burgdorf, Germania | CAS 26675-46-7 | isofluran |
| con rilascio prolungato guidato dalla matrice (su misura) | Innovative Research of America, Sarasota, FL | X-999 | pellet |
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| equipment | |||
| ELx808 Lettore di micropiastre ad assorbanza | BioTek, Bad Friedrichshall, Germania | Lettore di micropiastre | ELx808 |
| MICROSTERIL - 436 | B.M.S., Trescore Balneario, Italia | Sterilizzatore GAL/436 | |
| Forno di ibridazione/ agitatore | GE Healthcare UK Limited, Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, UK | Camera termica | RPN 2511 |
| Thermo MAT Pro 10 W, 15x25 cm, Lucky Reptile | Import Export Peter Hoch GmbH, Waldkirch, Germania | 61201 | Dispositivo di riscaldamento del mouse |
Riferimenti
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