Isolamento delle cellule staminali intestinale e cultura in un modello porcino di segmentale piccola Ischemia intestinale

Sommario

Questo protocollo consentirà ai lettori di stabilire con successo un modello porcino di ischemia intestinale segmentale e successivamente isolare e coltura di cellule staminali intestinali per lo studio della riparazione epiteliale dopo la lesione.

Abstract

Ischemia intestinale rimane una causa importante di morbilità e mortalità in pazienti umani e veterinari. Molti processi di malattia causare ischemia intestinale, quando il rifornimento di sangue e quindi ossigeno è diminuita all'intestino. Questo porta alla perdita di barriera intestinale e danni al tessuto sottostante. Cellule staminali intestinali risiedono alla base delle cripte di Lieberkühn e sono responsabili per rinnovo intestinale durante l'omeostasi e lesione seguente. Tecniche di coltura ex vivo delle cellule hanno permesso per il riuscito studio delle interazioni delle cellule staminali epiteliali stabilendo condizioni di coltura che supportano la crescita dei sistemi organo-come epiteliali tridimensionali (chiamato "enteroids" e" colonoids"dal piccolo e grande intestino, rispettivamente). Questi enteroids sono composti da cripta e villi coriali-come i dominii e maturo per contenere tutti i tipi di cellulare trovati all'interno dell'epitelio. Storicamente, i modelli murini sono stati utilizzati per studiare la lesione intestinale. Tuttavia, un modello porcino offre diversi vantaggi tra cui la somiglianza di dimensioni così come gastrointestinale anatomia e fisiologia a quello degli esseri umani. Utilizzando un modello porcino, stabiliamo un protocollo in cui il loop segmentale di ischemia intestinale possono essere creati all'interno di un singolo animale, consentendo lo studio di differenti punti della lesione ischemica tempo e riparare in vivo. Inoltre, descriviamo un metodo per isolare e coltura delle cellule staminali intestinali dai loop ischemica dell'intestino, consentendo lo studio continuo di riparazione epiteliale, modulata dalle cellule staminali, ex vivo.

Introduzione

Lesione ischemica intestinale, il risultato della disponibilità di ossigeno in diminuzione a causa di una riduzione o l'occlusione completa del flusso di sangue all'intestino, rimane una causa significativa della morbosità e della mortalità in pazienti umani e animali^1,2. Danno ischemico, con conseguente infiammazione e infiltrazione cellulare, conduce al compromesso di barriera mucosa. La barriera mucosa è fondamentale per la prevenzione della traslocazione batterica e tossine associate nella circolazione sistemica^3,4. La successiva riperfusione dei tessuti ischemici può provocare la formazione di danneggiare specie reattive dell'ossigeno che possono esacerbare la ferita⁵. Da ischemia intestinale è raramente evitabile, ricerca più corrente è stato incentrato sulla promozione di tecniche per la diagnosi precoce di ischemia e lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici che riducono la riparazione della mucosa di riperfusione lesioni o destinazione.

Modelli animali sono stati ampiamente utilizzati per ampliare le nostre conoscenze di scienza di base di ischemia-riperfusione e rimanere imperativo per ricerca traslazionale. Modelli di roditori sono stati il più ampiamente usato dovuto la loro capacità di essere geneticamente manipolati⁶. Più recentemente, tuttavia, l'uso di modelli animali grandi, in particolare il maiale, è stato sostenuto per futuri studi traslazionali a causa di una serie di vantaggi, tra cui le somiglianze di anatomici e fisiologici di maiali a esseri umani^7,8. Una varietà di modelli di lesione sono stati sviluppati per lo studio di ischemia-riperfusione e includono l'occlusione vascolare completa, ischemia di flusso debole e occlusione vascolare mesenterica segmentale. Una recensione completa di questi modelli è di fuori del Regno di questo articolo tuttavia gli autori diretta ai lettori di una recente revisione³.

Oltre ai modelli in vivo , l'uso di ex vivo sistemi di coltura cellulare offre uno strumento promettente per lo studio dell'omeostasi intestinale e riparazione dopo la lesione. Cellule staminali intestinali sono responsabili della proliferazione cellulare e fatturato del rivestimento epiteliale intestinale. Quando isolato dall'intestino normale o ferito, cellule staminali intestinali possono essere mantenute in coltura e servire come uno strumento o un modello per lo studio delle cellule staminali e biologia delle cellule epiteliali. Metodi per isolare e stabilire questi tridimensionale cultura sistemi (chiamati enteroids e colonoids quando derivato dal piccolo e grande intestino, rispettivamente) sono stati descritti per una varietà di specie e organo sistemi^{9,10 ,11,12,13}. In particolare, all'interno del tratto gastrointestinale, questi sistemi di coltura sono stati utilizzati per la malattia gastrointestinale compreso cancro, agente patogeno infezione e malattia di viscere infiammatoria¹⁴modello. In questo momento, non ci sono rapporti che descrive l'isolamento e la manutenzione delle cellule staminali intestinale dal tenue ischemically feriti in ogni specie. Di conseguenza, qui descriviamo il processo di ischemia intestinale in un romanzo, grande modello animale porcino che provoca lesioni riproducibile e la capacità di isolare cellule staminali intestinale dall'intestino normale e ischemically ferito per l'ulteriore studio di recupero ex vivo.

Protocollo

Per questi esperimenti, tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della North Carolina State University.

1. preparazione per la cultura

Nota: Tutti i reagenti sono elencati nella Tabella materiali. Concentrazioni di specifici fattori di crescita sono elencate nella tabella 1.

1. Preparare una soluzione 0,5 M di acido (EDTA) etilendiamminotetracetico in acqua distillata deionizzata (ddH₂O). Mescolare in modo adeguato e regolare il pH a 7,4 utilizzando soluzioni di NaOH o HCl.
   Nota: Compongono soluzione EDTA fresco prima di ogni esperimento.
2. Preparazione del reagente di dissociazione #1 (DR #1) come segue e metterli su ghiaccio: soluzione tampone fosfato di combinare senza Ca^{2 +} e Mg^{2 +} (PBS), 0,5 M EDTA, 1 M 1,4-ditiotreitolo (DTT), 10 µM Y27632 e 1 soluzione X antibiotico-antimicotica (Anti-Anti) contenenti penicillina, streptomicina e anfotericina b.
   Nota: Aggiungere Y27632 immediatamente prima della raccolta del tessuto.
3. Preparazione del reagente di dissociazione #2 (DR n. 2) come indicato di seguito e inserire in bagnomaria a 37 ° C: combinare PBS senza Ca^{2 +} e Mg^{2 +}, EDTA 0.5 M, 10 µM Y27632 e 1 X anti-Anti. Nota: Aggiungere Y27632 immediatamente prima della raccolta del tessuto.
4. Preparare i supporti delle cellule staminali epiteliali intestinali (IESC) come segue: Mix 25 mL advanced medium DMEM/F12 con 1 supplemento N2 X, 1 X B-27 supplemento, 10 mM HEPES, 2mm Glutamax e 1 X anti-Anti. Conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
5. Preparare un mix master di fattore di crescita ridotta della membrana dello scantinato matrix (matrice) e fattori di crescita supplementari come segue: scongelare la matrice sul ghiaccio. In un tubo del microcentrifuge, aggiungere 100 ng/mL Noggin umana ricombinante, 500 ng/mL 1 R-Spondin umano ricombinante, 50 ng/mL ricombinante umano fattore di crescita epidermico (EGF), 100 ng/mL Wnt3a umana ricombinante, 10mm nicotinammide, gastrina nM 10, 500 nM A-83-01, 10 µM Y-27632 , 10 mM SB202190, 500 nM LY2157299 e 2,5 µM glicogeno sintasi chinasi 3 inibitore (GSK3i, CHIR99021). Quando la matrice è scongelata, completare con il mix di fattore di crescita (facendo mix master) e memorizzare sul ghiaccio.
   Nota: Fare attenzione per evitare di introdurre bolle d'aria come questo creerà artefatto entro la patty di matrice durante placcatura.
6. Pre-riscaldare un piatto di coltura del tessuto 24 pozzetti in un incubatore a 37 ° C prima di iniziare le procedure di isolamento delle cellule.

2. modello chirurgico di Ischemia e di raccolta del tessuto

1. Uso da otto a dieci-settimana-vecchio Yorkshire incrociate maiali di entrambi i sessi (scelta consigliata). Rimuovere tutti i mangimi 16-18 h prima della chirurgia. Consentire l'accesso all'acqua in ogni momento suini.
2. Pianificare i maiali di arrivare almeno 48 h prima degli esperimenti per consentire ambientale acclimatazione.
   Nota: Tecnici veterinari e/o laboratorio preparati sotto la supervisione di un veterinario autorizzato forniscono routine cura degli animali e assistenza con procedure anestetiche.
3. Wow il maiale con xilazina (1,5 mg/kg per via intramuscolare (IM)) e ketamina (11-20 mg/kg (IM))¹⁵. Una volta calmo, intubare la orotracheally di maiale.
4. Mantenere i maiali in anestesia generale con isoflurano (2-5%) vaporizzato in 100% O₂ fino al momento dell'eutanasia.
5. Posizionare un catetere endovenoso (IV) (vena orecchio consigliato) e amministrare un fluido sostitutivo come soluzione di Ringer lattato suonerie a un tasso di mantenimento di 15 mL/kg/h.
6. Eseguire la routine di anestetico monitoraggio compreso pulsossimetria, elettrocardiografia e indiretta pressione sanguigna misure¹⁵. Monitorare la frequenza respiratoria e sforzo del maiale e ventilare manualmente o meccanicamente come necessario se end tidal CO₂ supera i 55-60 mmHg.
   Nota: L'anestesia appropriata è confermata dal continuo monitoraggio delle tendenze nella frequenza cardiaca (gamma 80-130 battiti/min), pressione sanguigna non invasiva (media pressione arteriosa 75-100 mmHg) e frequenza respiratoria (10-25 respiri/min)¹⁶e controllo periodico per assenza di mascella e tono anale. Profondità dell'anestesia può anche essere giudicato da grado di rilassamento muscolare e fascicolazioni muscolari segue stimolo chirurgico. Riflessi oculari sono di solito di nessun valore¹⁶. L'analgesia può essere fornito come diretto dalla politica istituzioni IACUC. In questo caso, un oppiaceo, come la buprenorfina, può essere somministrato durante l'intervento chirurgico.
7. Posizionare il maiale su un rilievo di riscaldamento e trattengono in decubito dorsale per la procedura chirurgica.
8. Radere l'addome ventrale e prepara con scrub chirurgico (soluzione di clorexidina) e alcool isopropilico.
9. Fare un'incisione di 8-10 cm ventrale del midline usando un bisturi centrato al umbilicus per accedere all'addome.
10. Identificare il piccolo intestino (digiuno) circa 40 cm per via orale alla giunzione ileocecale. Delineare il loop lungo dieci-cm del digiuno legando circonferenzialmente intestino due volte, uno cm tra ogni legatura, prima di creare successive loops 10cm trova oralmente (Figura 1).
11. Creare due cicli per ogni punto di tempo di ischemia adiacente a vicenda, uno per ischemia e uno per ischemia con un ulteriore 1h di riperfusione se lo si desidera. Per creare l'ischemia completa (nessun flusso di arterie o vene), morsetto o legare il sistema vascolare mesenterico usando pinze vascolari bulldog, emostatiche di zanzara Halstead curvi o seta non riassorbibile 2-0 per 1, 2, 3 e 4h e quindi rimuovere Morse per 1h di riperfusione, se lo si desidera.
    Nota: Gli autori creato tutti i cicli di ischemia in ordine a partire con il ciclo ischemico di 4h e progredito in movimento prossimalmente (minimizzare il tempo totale di chirurgia). Per affrontare la possibilità che la vicina ischemici segmenti intestinali può danneggiare spire adiacenti, l'ordine dei cicli ischemici può essere variata. Questo può alterare il tempo chirurgico totale.
    Nota: L'intervallo di tempo di riperfusione può essere variata basata sulla domanda di ricerca di interesse o se terapie volete essere testato durante il periodo di riperfusione. Tuttavia, come danno di tessuto diventa più grave dall'aumentare le durate di ischemia da solo, riperfusione probabilmente non contribuisce a ulteriori lesioni epiteliali. Riperfusione probabilmente un ruolo seguenti periodi lieve della lesione ischemica.
12. Tra i punti di tempo di ischemia, tenere l'addome coperti o chiusi utilizzando un asciugamano sterile e/o un morsetto di asciugamano.
    Nota: All'interno di un singolo animale per questo esperimento, otto segmenti ischemici possono essere creati. Identificare un segmento aggiuntivo del digiuno, almeno 5-10 cm prossimale all'ultimo anello ischemico, che servirà come un normale controllo interno.
13. Ostruire circa tre vasi mesenterici per bulldog morsetto vascolare o curvo pinza emostatica di zanzara di Halstead. Deve prestare attenzione durante l'applicazione del laccio emostatico perché i vasi sono facilmente traumatizzati. Tenta di impilare i vasi all'interno delle mascelle dei morsetti.
14. Alla fine dell'esperimento, seguente l'eutanasia con pentobarbital 85-100 mg/kg IV, raccogliere tutti i cicli del tessuto utilizzando forbici metzenbaum, dopo la morte è stata confermata senza battito cardiaco auscultati con perdita del riflesso corneale. Iniziare raccogliendo un pezzo di controllo di digiuno normale almeno 5 - 10 cm prossimale all'ultimo anello ischemico.
15. Separano e raccolgono il loop da ogni punto del tempo di ferita in piccoli contenitori di PBS freddo ghiaccio fino al momento per l'isolamento di cripta.
    Nota: Se lo si desidera, fare ischemico loop abbastanza a lungo per dividere in campioni separati per istologia e cultura intestinale delle cellule staminali; Tuttavia, gli autori hanno trovato che gli anelli superiori a circa 10 cm di lunghezza sono più probabili di diventare emorragica.

3. cripta (cellule staminali) isolamento da ischemico e loop di controllo

1. Inverti ogni ciclo di piccolo intestino utilizzando un calibro 20 filo e pinze per esporre la superficie mucosa. Legare la parte superiore e inferiore del ciclo in modo sicuro al filo mediante sutura (2-0 non assorbibili seta o equivalente).
2. A seguito di inversione, sciacquare ogni ciclo in PBS freddo ghiaccio per rimuovere i detriti luminal.
3. Posizionare il campione immediatamente in provette coniche da 50 mL contenente DR #1 sul ghiaccio per 30 min.
4. Raccogliere i cicli iniziano con controllo e seguire con cicli di aumento incrementale durate di ischemia. Loop da meno tessuto danneggiato (cioè 1 h e controllo tessuto ischemico) può essere agitato con forza, rompersi il polso per ottenere i migliori risultati. Tessuti dai tessuti gravemente danneggiati (3 e 4 h di ischemia) dovrebbero essere dolcemente cullati o invertiti solo come troppa agitazione provocherà cripta rottura e distruzione di tessuto supplementare. Tubi dovrebbero essere scossi o invertiti ogni 5 min mentre il ghiaccio.
5. Trasferire i campioni in DR #2 per 10 min in bagnomaria a 37° C. Scuotere o invertire tubi ogni 5 min.
6. Dopo aver trasferito i tessuti, centrifugare le provette coniche contenenti DR #1 dai loop 2-4 h danneggiato per rimuovere il surnatante EDTA (200 x g per 5 min). Come questi tessuti sono altamente danneggiati è possibile che le cripte hanno già diventare dissociate. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con un piccolo volume di PBS (5 mL) e procedere al punto 3.9.
7. Rimuovere i campioni da DR #2 e inserire direttamente i campioni di tessuto 25 mL di PBS freddo sul ghiaccio (etichetta come lavare n. 1). Posizionare i campioni su agitatore orbitale su ghiaccio a 60 giri/min. Continuare a scuotere o capovolgere ogni provetta per 30 s ogni 2-5 min.
8. Dopo aver trasferito i tessuti, spin le provette coniche contenenti DR #2 da 2-4 h danneggiato con passanti per rimuovere il surnatante EDTA (200 x g per 5 min). Come questi tessuti sono altamente danneggiati è possibile che le cripte hanno diventare dissociate. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con un piccolo volume di PBS (5 mL) e procedere al punto 3.9.
9. Rimuovere un'aliquota di 50 µ l dal lavaggio #1 (o dal DR) per verificare il grado di dissociazione di cripta e quantità di detriti. Posizionare il tessuto in una nuova provetta conica 50 mL (Wash #2, #3, ecc.) riempito con 25 mL di PBS freddo e agitare fino a cripte intatte sono isolati con detriti minimal e villi.
   Nota: L'obiettivo è di essere in grado di isolare una frazione pulita con cripte intatte ed i residui minimi. Ogni ulteriore lavaggio pulirà le cellule tuttavia troppo agitazione inizierà a provocare il danno secondario dei tessuti/cellule. Inoltre, i migliori risultati con meno contaminazione si realizzerà se cripte sono rivestiti da una fase di lavaggio e non da un passo di reagente di dissociazione.
10. Rimuovere il tessuto restante e centrifugare le provette coniche da 50 mL a 200 x g per 5 minuti per rimuovere il surnatante, quindi risospendere restanti il pellet cripta nel più piccolo volume di PBS (5 mL).
11. Utilizzando un microscopio invertito, esaminare 50 aliquote µ l di ogni campione per determinare il numero di cripte o frazione. L'obiettivo è di 50-100 µ l di cripte/50, come questa sarà la dimensione del mondo di patty di matrice finale.
    Nota: Se il campione è troppo concentrato, continuare ad aggiungere PBS freddo fino a quando non viene raggiunta la concentrazione desiderata. Se il campione è troppo diluito, determinare il numero di aliquote necessarie per raggiungere la resa desiderata cripta e regolare.
12. Aliquotare volumi appropriati delle cripte (determinati dall'aliquotare osservazioni) in un tubo del microcentrifuge. Ad esempio, se il campione contiene 50 µ l di cripte/50 poi aliquota 50 µ l per patty X3 replica = 150 µ l / tubo del microcentrifuge. Se il campione contiene solo 25 µ l di cripte/50 poi 2 aliquote necessarie / patty X 3 replica = 300 µ l/tubo.
13. Cripte di pellet a 200 x g per 5 min a 4° C.
14. Risospendere delicatamente pellettati cripte con volume appropriato di mix master (50 µ l per pozzetto). Mescolare accuratamente pipettando rapidamente 15 volte senza creare bolle d'aria.
    Nota: Pre-raffreddare la punta della pipetta con PBS freddo sterile prima di aspirare il mix master. Questo vi aiuterà a mantenere il mix master dalla diffusione. Suggerimenti possono essere conservati in frigorifero e collocati nella cappa immediatamente prima dell'uso.
15. Erogare una 50 mix master µ l plus gocciolina cripta nel centro di ciascun pozzetto di una piastra ben 24 pre-riscaldato.
16. Incubare la piastra di coltura per 30 min a 37 ° C.
17. Sovrapposizione di ogni tortino di matrice con 500 µ l / pozzo di media IESC (senza ulteriori fattori di crescita necessari il giorno 0 come si trovassero all'interno del master mix).
18. Aggiungere 500 µ l PBS sterile eventuali pozzetti inutilizzati a sinistra sulla piastra per mantenere l'umidità.
19. Contare il numero di cripte placcati il giorno 0.
    Nota: È utile per pre-griglia ogni cella cultura piastra in quadranti per contribuire a garantire il conteggio più preciso.
20. Contare il numero di enterospheres ogni 24h e monitorare per lo sviluppo di enteroid al giorno.
21. Aggiungere fattori di crescita per ogni bene ogni 48 h. rimuovere il supporto IESC ogni 96 ore e sostituire con media fresco di 500 µ l (fattori di crescita deve essere aggiunto ai media).

Risultati

Ischemia intestinale completa è stata creata in piccole anse intestinali utilizzando occlusione vascolare con sutura o i morsetti come mostrato in Figura 1. Rilasciando i morsetti, può essere eseguito un controllata periodo di riperfusione, consentendo lo studio supplementare della successiva riperfusione se lo si desidera. Tutti gli animali sopravvissero durante la procedura con la minima complicazione fino ad eutanasia. La più comune complicanza chirurgica era ipotensione, che ha risolto con il completamento di un inotropa positiva come dobutamina.

Se eseguita correttamente, la lesione ischemica inizierà sulla punta del villo intestinale e migrare verso il basso all'interno della cripta, come la durata di aumenti di ischemia (Figura 2). Un errore comune con la tecnica chirurgica può verificarsi quando i vasi sanguigni non sono legati o fissati in modo uniforme. Il risultato è un'ischemia emorragica (Figura 3), in cui la vena sottili crolla prima l'arteria, consentendo ulteriori sangue di infiltrare i tessuti. Questo è visto grossolanamente come una superficie serosal viola scura (Figura 3, a sinistra) rispetto ad una superficie più chiara durante ischemia completa (Figura 3, destra).

A seguito di rimozione delle anse intestinali ischemiche, cripte intestinali sono stati correttamente isolati seguendo il protocollo di dissociazione (Figura 4). Come previsto, le cripte da punti temporali più severamente danneggiato spesso erano rotti (f; frammento) e frazioni di cripta conteneva più detriti cellulari di sfondo rispetto a quelli che hanno subito di no o lievi danni. Durante il protocollo, l'intestino gravemente infortunato deve essere agitata delicatamente per evitare ulteriori danni al tessuto sottostante. Agitando troppo approssimativamente può causare ulteriori danni di cripta e la maggior parte delle cripte finendo nella DR soluzioni contenenti EDTA, conseguente rottura aggiuntiva.

Una volta placcato, cripte da tutti i punti di tempo di ischemia sopravvivono e sono in grado di stabilirsi in cultura (Figura 5). Quando cripte intestinali normali e lievemente danneggiati sono placcati in cultura, enterospheres forma entro 24-48 h. Con grave danno ischemico (3 e 4 h), cripte intestinali sopravvivono ma sono danneggiate, causando la formazione di sfere molto più piccoli inizialmente. Da 72-120 h, enteroids diventano più complesse con evidente lumen centrale e strutture in erba. Nel complesso, c'è un'efficienza di crescita è diminuito delle cripte e anche una dimensione ridotta di enteroids derivato dal tessuto intestinale gravemente danneggiato (Gonzalez, L.M., dati non pubblicati, 2017).

Figura 1 : Modello chirurgico di ischemia intestinale completa in un modello porcino. A) normale digiuno porcina esteriorizzato. B) mesenteriche vasi sono state legate con sutura creazione di ischemia intestinale. C) ischemia creato utilizzando pinze vascolari bulldog per consentire riperfusione del tessuto se lo si desidera. D) intestinale vascolarizzazione immediatamente dopo rimozione dei morsetti vascolari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Prova istologica (ematossilina ed eosina (H & E) macchia) di aumentare il danno epiteliale seguendo le durate più lunghe di ischemia intestinale completa. Danni inizia sulla punta del del villo con graduale perdita dello strato epiteliale unicellulare, villo smussamento e danno cellulare che si estende verso il basso per la cripta base con lesioni gravi (durata fino a 4 h). barra della scala 100 µm. Io = Ischemia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Prova lorda ed istologica di ischemia emorragica. A) lorda fotografia confrontando l'ischemia emorragica (loop di sinistra) e ischemia completa (loop di destra). Quando il sistema vascolare non è legato o fissato uniformemente, sangue può continuare a infiltrare i tessuti, con conseguente ulteriore infiammazione e danno. B) H & E immagini di ischemia emorragica di aumento della durata da 1-4 h. Oltre al danno cellulare visto con ischemia completa, c'è prova di infiltrazione di globuli rossi all'interno della lamina propria circostante. barra della scala 100 µm. Io = Ischemia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Aliquote delle cripte intestinali isolati dai cicli dell'intestino ischemico e normale. Completi, intatti cripte intestinali (asterischi) sono stati correttamente isolati da ogni ansa dell'intestino. Come previsto, le cripte da più punti di tempo gravemente danneggiato spesso erano rotti (f; frammento) e frazioni di cripta conteneva più detriti cellulari di sfondo rispetto a quelli che hanno subito di no o lievi danni. barra della scala 100 µm. Io = Ischemia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : Corso di tempo di crescita intestinale delle cellule staminali dopo isolamento da loop ischemica dell'intestino tenue. Quando cripte intestinali normali erano cromate nella cultura, enterospheres formata entro 24-48 h. Con grave danno ischemico (3 e 4 h), cripte sopravvivono ma formano inizialmente molto più piccole sfere. Da 72-120 h, enteroids diventano più complesse con evidente lumen centrale e strutture in erba. 20 µm scala bar se non diversamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fattore di crescita	Diluente	Concentrazione d'archivio	Diluizione di stock	Diluizione di lavoro
R-Spondin	PBS	100 X	100 µ g/ml	1 µ g/ml
Zucca	SW/0.1%BSA	1000 X	100 µ g/ml	100 ng/ml
FEG	10mM acido acetico	10.000 X	500 µ g/ml	50 ng/ml
A-83-01	DMSO	1000 X	500 ΜM	500 nM
SB202190	DMSO	3000 X	30 mM	10 ΜM
Nicotinammide	SW	1000 X	2.	1 mM
Gastrina	PBS	10.000 X	100 ΜM	10 nM
Y-27632	PBS	1000 X	10 mM	10 ΜM
LY2157299	DMSO	10.000 X	5 mM	0,5 ΜM
CHIR99021	PBS	1000 X	2,5 mM	2,5 ΜM
Wnt3a	PBS	2000 X	200 µ g/ml	100 ng/ml

Tabella 1: tabella dei fattori di crescita di reagente. Sintesi delle soluzioni di riserva del fattore di crescita e soluzioni di lavoro utilizzate nel presente protocollo.

Discussione

Lo sviluppo di un modello porcino di ischemia intestinale segmentale si espande sulla precedenti modelli murini consentendo per lo studio di più punti di tempo della lesione del tessuto all'interno dello stesso animale. Ci sono diversi punti di discussione critica del presente protocollo, tra cui la legatura corretta nave, riperfusione del tessuto e coltura cellulare successo cripta.

La legatura vaso corretto è fondamentale per la creazione di un modello di ischemia completa. Se la sutura è legata in modo non uniforme o il morsetto non serrate completamente, sangue dall'arteria pareti spesse può continuare ad immettere il tessuto e non è possibile uscire a causa del crollo della vena con pareti sottili. In questo modo lo stravaso di sangue nella lamina propria causando danni di tessuto supplementare. Tuttavia, a seconda del tipo di lesione ischemica in fase di studio, ischemia completa o emorragica può essere desiderato. Ad esempio, nel processo di trapianto intestinale, intestino è completamente separato dal rifornimento vascolare (arteria e vena) durante la fase di resezione della procedura, che si traduce in ischemia intestinale completa. In alternativa, tuttavia, quando il mesentere è contorto durante un evento come un volvolo intestinale, il ritorno venoso è spesso ostacolato in primo luogo, che conduce sangue addizionale all'interno del tessuto prima di essere il rifornimento arterioso occluso, creando così ischemia emorragica.

Lesione ischemica provoca danni ai tessuti inizia sulla punta del villo e si estende fino alla base della cripta³. Durante l'ischemia, energia sotto forma di trifosfato di adenosina continua ad essere utilizzata e genera l'ipoxantina metabolita. Quando il tessuto è reperfused con ossigeno, ipoxantina diventa metabolizzato dalla xantina ossidasi e produce radicali liberi superossido che conduce alla ferita mucosa e l'attrazione del tessuto danneggiando i neutrofili^17,18. Differenze tra specie in architettura vascolare della mucosa così come espressione variante della xantina ossidasi, causare vari gradi di riperfusione lesioni³. Felini e roditore modelli di ischemia-riperfusione sono più suscettibili alla riperfusione da metaboliti reattivi dell'ossigeno^19,20. Al contrario, maiali sono stati trovati per avere meno xantina ossidasi e conseguenza meno riperfusione, rendendo questo modello più paragonabile a quella di ischemia intestinale umano²¹. In questo momento, l'utilizzo di Ko o modelli transgenici suini per lo studio di lesione intestinale non è stata descritta, rendendo questo una limitazione importante di questo modello. Selezione del modello animale adeguato dipende dal processo di malattia o condizione specifica il ricercatore desidera studiare. Ad esempio, modelli porcine della lesione ischemica fino a 6 h sono stati descritti²², considerando che le procedure più ischemiche in modelli murini sono 45-60 min²³.

Successo isolamento delle cripte intestinali dall'intestino normale e ischemically danneggiato consente lo studio di recupero epiteliale nella cultura. Questo sistema consente al ricercatore di concentrarsi unicamente sull'epitelio da solo, come c'è rifornimento non vascolare o componente delle cellule immuni da considerare. Questo offre l'opportunità di studiare le interazioni delle cellule epiteliali e recupero dopo la lesione oltre alla risposta a diversi fattori di crescita, o trattamenti somministrati durante chirurgia o seguente cripta isolamento completando i terreni di coltura. Questo passaggio rimane il più difficile, come isolamento dai loop gravemente danneggiato richiede agitazione delicata e la rimozione rapida delle soluzioni contenenti EDTA nel caso in cui le cripte hanno diventare prematuramente dissociati. Se queste anse dell'intestino non vengono lavate accuratamente, le cripte hanno il potenziale per diventare contaminato nella cultura. Di conseguenza, soluzione antibiotico antimicotico inserito in entrambe le soluzioni DR oltre i media IESC. Un altro punto di discussione si concentra sull'intestino raccolto come un normale controllo. Come gli animali subiscono l'anestesia con possibili alterazioni in perfusione tissutale sistemica, assieme alla possibilità di circolanti di mediatori infiammatori secondarie ad ischemia, tessuto di controllo anche "normali" non può rappresentare un vero controllo. In questi esperimenti, è di nota che il tessuto di controllo è sembrato grossolanamente ed istologicamente paragonabile al tessuto da animali che non subissero l'ischemia in altri esperimenti (Gonzalez, L.M., dati non pubblicati, 2017).

In sintesi, questo metodo viene descritto un modello riproducibile di ischemia intestinale porcina, che modella molto attentamente ciò che avviene nella lesione ischemica umana. Inoltre, l'isolamento di cellule staminali intestinale da loop ischemico è descritto, che serve per studiare la riparazione epiteliale e possibile risposta al trattamento nella cultura.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione salina tamponata con fosfato, Ca2+, Mg 2+ free	Fisher Scientific	BP-399	Diluire 1:10
Acqua distillata e deionizzata (ddH2O)			Utilizzato per preparare EDTA e PBS
Dimetil solfossido (DMSO)	Thermo Scientific	20688
Acido etilendiame tetraacetico (EDTA)	Sigma Aldrich	ED45	Preparare fresco prima di ogni esperimento; pH 7,4
1,4-Ditiotreitolo (DTT)	Sigma Aldrich	646563
Y-27632	Sigma Aldrich	Y0503
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010
N2 Supplement	Life Technologies	17502-048
B-27 Supplement	Life Technologies	12587-010
HEPES	Life Technologies	15630-106
Glutamax	Life Technologies	35050-061
Penicillina/Streptomicina/Amfotericina B	Gibco	15240-096	Soluzione anti-anti
Wnt-3a umano ricombinante	R & D Systems	5036 WN/CF
Rispondina umana ricombinante1	R & D Systems	4645- RS
Noggin umano ricombinante	R & D Systems	6057-NG
EGF umano ricombinante	R & D Systems	236-EG
LY2157299	SelleckChem	52230
CHIR99021	Cayman Chemical	13122
Umano [leu]15-gastrina 1	Sigma Aldrich	G9145
SB202190	Sigma Aldrich	57067
A83-01	Tocris	2939
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636
Acido acetico	Sigma Aldrich	695092
acqua, qualità WFI	Corning, Inc.	25-055-CM	Indicato come acqua sterile (SW); per i fattori di crescita stock
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
Matrigel Matrix, GFR	Corning, Inc.	356231	senza rosso fenolo
	Corning, Inc.	3524
Provetta conica, 50 ml	Corning, Inc.
Manico per bisturi	di precisione mondiali	500236
lama chirurgica in acciaio al carbonio, n. 10	di precisione mondiali	504169
Pinze per tessuti	di precisione mondiali	15918
Pinze per tessuti Debakey	di precisione	501239
Mayo Forbici	Strumenti di precisione	501752	Metzenbaum curve o diritte
	Precision Instruments	501739
Pinze per zanzare, Curved	World Precision Instruments	503724-12	Curvo o dritto (503728-12)
Hopkins Bulldog Clamp	Stoelting Co.	52120-40P	Seta dritta
, 2-0	Henry Schein	685S-MA	Qualsiasi marca simile è accettabile
Morsetti per asciugamani	World Precision Instruments	501700
Supporto per aghi	World Precision Instruments	V503382
Sutura a filo, calibro 20	Henry Schein	19075	Tagliare e raddrizzare prima dell'uso.
Asciugamani chirurgici	Henry Schein	ST1833	Qualsiasi prodotto simile è accettabile.
Soluzione di Ringers lattato	Henry Schein	9851
Scrub antisettico al clorex (4%)	Henry Schein	VINV-CHMX-SCRB	Qualsiasi marca simile è accettabile
Alcool isopropilico 70%	Henry Schein	MS071HS	Qualsiasi marca simile è accettabile
Catetere IV, calibro 22	Henry Schein	2225PUR	Potrebbe essere necessario 20 g o 24 g a seconda delle dimensioni della vena
Xilazina (100 mg/ml)	Henry Schein	33198
Ketamina (100 mg/ml)	Henry Schein	11695-6835-1	Farmaco controllato
Soluzione di isoflurano	Henry	Schein 10015516
Pentobarbital (Soluzione fatale più eutanasia (390 mg/ml))	Vortech Pharm.		Sono disponibili diverse marche di pentobarbital sodico.
Termoforo	Sistema di riscaldamento Gaymar Tpump Core; altri sono disponibili.
Mindray Datascope Monitor	Mindray North America		Qualsiasi apparecchiatura di monitoraggio equivalente accettabile
Vaporizzatore	Vetland Medical		Si consiglia di utilizzare un sistema circolare con pezzo Y; più fornitori disponibili.
Pompa per fluidi	Abbott Hospira		Plum A+; Si consiglia un produttore simile.

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