Microscopia di luce-foglio per visualizzazione tridimensionale delle cellule immuni umane

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare le cellule immunitarie incorporate in una matrice di collagene (3D) tridimensionale utilizzando la microscopia a luce-foglio. Questo protocollo elabora anche come tenere traccia di migrazione cellulare in 3D. Questo protocollo può essere impiegato per altri tipi di cellule in sospensione nella matrice 3D.

Abstract

In vivo, l'attivazione, proliferazione e funzione delle cellule immuni tutti si verificano in un ambiente tridimensionale (3D), per esempio nei linfonodi o tessuti. Fino a data, la maggior parte dei sistemi in vitro si basano su superfici bidimensionali (2D), come piastre di coltura cellulare o vetrini coprioggetti. A condizioni fisiologiche in modo ottimale mimare in vitro, utilizziamo una matrice di collagene 3D semplice. Il collagene è uno dei principali componenti della matrice extracellulare (ECM) ed è stato ampiamente utilizzato per costituire matrici 3D. Per l'imaging 3D, la tecnologia sviluppata di recente la microscopia luce-foglio (noto anche come microscopia di illuminazione su un unico piano) è dotata di acquisizione ad alta velocità, profondità di penetrazione grande, candeggio basso e fotocitotossicità. Inoltre, la microscopia luce-foglio è particolarmente vantaggiosa per misurazioni a lungo termine. Qui descriviamo un protocollo ottimizzato come impostare e gestire le cellule immuni umane, ad esempio primario umani linfociti T citotossici (CTL) e cellule natural killer (NK) nella matrice collagene 3D per l'utilizzo con la microscopia di luce-foglio per l'imaging di cellule vive e campioni fissati. La procedura di acquisizione e analisi di migrazione delle cellule delle immagini sono presentati. Un'attenzione particolare è data per evidenziare i passaggi critici e fattori per la preparazione dei campioni e analisi dei dati. Questo protocollo può essere impiegato per altri tipi di cellule in sospensione in una matrice di collagene 3D e non è limitato alle cellule immuni.

Introduction

La maggior parte delle conoscenze sulla migrazione di cellule proviene da 2D esperimenti^1,2,3, che normalmente si svolgono in una superficie in vetro o in plastica di un cultura/imaging piatto. Tuttavia, uno scenario fisiologico richiede, nella maggior parte dei casi, un microambiente 3D, in cui la matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo determinante. ECM non solo fornisce l'essenziale struttura 3D per mantenere la morfologia cellulare corretto, ma offre anche segnali di sopravvivenza o direzionale spunti per un funzionamento ottimale di molte cellule^4<....

Protocol

Ricerca effettuata per questo studio con il materiale umano (alloggiamenti di sistema del leucocita riduzione dai donatori di sangue umano) è autorizzata dal comitato etico locale (dichiarazione da 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) e segue le linee guida corrispondenti.

1. preparazione della soluzione neutralizzata collagene (500 µ l)

1. Trasferire 400 µ l di soluzione di riserva refrigerata collagene (10,4 mg/mL) in una provetta sterile 1,5 mL sotto il cofano di cultura cellulare. Lentamente aggiungere 50 µ l di refrigerati 10 x PBS (pH 7,0-7,3) a 400 µ l di soluzione di riserva refrigerata collagene. Miscelare la soluzio....

Results

Formazione di protrusione durante la migrazione delle cellule T è un processo altamente dinamico, che è dipendente di actina. Per visualizzare la formazione di protrusione di CTL umano primario, transfected transitoriamente una proteina mEGFP fusa per etichettare il citoscheletro di actina in CTL come descritto prima delle¹¹. Un giorno dopo trasfezione, le cellule sono state incorporate nella matrice di collagene. Serie di immagini sono state acquisite ogni 40 s co.......

Discussion

La maggior parte in vitro le analisi sono effettuata su una superficie 2D, ad esempio in piastre di coltura cellulare, capsule di Petri o sulle lamelle, considerando che in vivo le cellule, soprattutto le cellule immuni, esperienza principalmente un microambiente 3D. La prova emergente indica che modelli di migrazione delle cellule immuni differiscono tra 2D e 3D scenari¹⁷. Inoltre, i profili di espressione delle cellule del tumore sono differenti in 2D e 3D-in coltura di tessuti.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibricol, soluzione di collagene bovino	Advanced Biomatrix	#5133-20ML	Matrice di collagene
0,5 M Soluzione NaOH	Merck	1091381000	per neutralizzare la soluzione di Fibricol
Agarosio a bassissimo punto di fusione	Affymetrix	32821-10GM	Preparazione del campione in
Dynabeads Kit di cellule T CD8 umane intatte	Thermo Fisher	11348D	Isolamento di cellule T umane primarie CD8+ da PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 per l'espansione e l'attivazione delle cellule T	Thermo Fisher	11132D	Attivazione di popolazioni di CTL
Interleuchina-2 ricombinante umana	Thermo Fisher	PHC0023	Stimolazione di CTL
P3 in coltura Kit di soluzione primaria	Trasfezione
Lonza V4XP-30XXAnticorpo &alfa;-PFN1, coniglio, IgG	Abcam	ab124904	IF
Alexa Fluor 633 Falloidina	Thermo Fisher	A22284	IF
CellMask Orange Plasma membrana Colorazione	Thermo Fisher	C10045	Etichetta cellulare fluorescente
Tween 20	Sigma	P1379-250mL	IF
Triton X-100	Eurobio	018774	IF
DPBS Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco	Thermo Fisher	14190250	IF
Albumina sierica bovina	Sigma	A9418-100G	IF
Capra &alfa; Coniglio 568, IgG, coniglio	Thermo Fisher	A-11011	IF
Lightsheet Z.1 (Microscopia a foglio luminoso)	Zeiss	N.A.
Cappa per coltura cellulare	Thermo Fisher	HeraSafe KS Incubatore
per coltura cellulare HERACell 150i	Thermo Fisher	N.A.
Centrifuga 5418 e 5452	Eppendorf	N.A.
Pippettes	Eppendorf	3123000039, 3123000020 3123000063
punte Pippette	VWR	89079-444, 89079-436, 89079-452
Provette da 15 mL	Sarstedt	62.554.002
Capillari 50 &; L	VWR (Marca)	613-3373	Zeiss Preparazione del campione LSFM
Stantuffo per capillari	VWR (Marca)	BRND701934	"Timbri con punta in teflon" Preparazione del campione LSFM
MColorPunte per pH	Phast Merck	1095430001	per testare il pH delle siringhe neutralizzate Fibricol
BD Plastipak da 1 ml	BD	Z230723  ALDRICH	Preparazione alternativa del campione
Argilla da modellare (Hasbro Play-Doh A5417EU7)	Play-Doh	N.A.
Convertitore di file Imaris	Bitplane	disponibile all'indirizzo http://www.bitplane.com	Converti i file di imaging in formato file Imaris
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)	Bitplane	disponibile all'indirizzo http://www.bitplane.com	Analisi di dati di imaging 3D e 4D