Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare le cellule immunitarie incorporate in una matrice di collagene (3D) tridimensionale utilizzando la microscopia a luce-foglio. Questo protocollo elabora anche come tenere traccia di migrazione cellulare in 3D. Questo protocollo può essere impiegato per altri tipi di cellule in sospensione nella matrice 3D.
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Articolo metodologico
Microscopia di luce-foglio per visualizzazione tridimensionale delle cellule immuni umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
In vivo, l'attivazione, proliferazione e funzione delle cellule immuni tutti si verificano in un ambiente tridimensionale (3D), per esempio nei linfonodi o tessuti. Fino a data, la maggior parte dei sistemi in vitro si basano su superfici bidimensionali (2D), come piastre di coltura cellulare o vetrini coprioggetti. A condizioni fisiologiche in modo ottimale mimare in vitro, utilizziamo una matrice di collagene 3D semplice. Il collagene è uno dei principali componenti della matrice extracellulare (ECM) ed è stato ampiamente utilizzato per costituire matrici 3D. Per l'imaging 3D, la tecnologia sviluppata di recente la microscopia luce-foglio (noto anche come microscopia di illuminazione su un unico piano) è dotata di acquisizione ad alta velocità, profondità di penetrazione grande, candeggio basso e fotocitotossicità. Inoltre, la microscopia luce-foglio è particolarmente vantaggiosa per misurazioni a lungo termine. Qui descriviamo un protocollo ottimizzato come impostare e gestire le cellule immuni umane, ad esempio primario umani linfociti T citotossici (CTL) e cellule natural killer (NK) nella matrice collagene 3D per l'utilizzo con la microscopia di luce-foglio per l'imaging di cellule vive e campioni fissati. La procedura di acquisizione e analisi di migrazione delle cellule delle immagini sono presentati. Un'attenzione particolare è data per evidenziare i passaggi critici e fattori per la preparazione dei campioni e analisi dei dati. Questo protocollo può essere impiegato per altri tipi di cellule in sospensione in una matrice di collagene 3D e non è limitato alle cellule immuni.
Introduzione
La maggior parte delle conoscenze sulla migrazione di cellule proviene da 2D esperimenti1,2,3, che normalmente si svolgono in una superficie in vetro o in plastica di un cultura/imaging piatto. Tuttavia, uno scenario fisiologico richiede, nella maggior parte dei casi, un microambiente 3D, in cui la matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo determinante. ECM non solo fornisce l'essenziale struttura 3D per mantenere la morfologia cellulare corretto, ma offre anche segnali di sopravvivenza o direzionale spunti per un funzionamento ottimale di molte cellule4<....
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Protocollo
Ricerca effettuata per questo studio con il materiale umano (alloggiamenti di sistema del leucocita riduzione dai donatori di sangue umano) è autorizzata dal comitato etico locale (dichiarazione da 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) e segue le linee guida corrispondenti.
1. preparazione della soluzione neutralizzata collagene (500 µ l)
- Trasferire 400 µ l di soluzione di riserva refrigerata collagene (10,4 mg/mL) in una provetta sterile 1,5 mL sotto il cofano di cultura cellulare. Lentamente aggiungere 50 µ l di refrigerati 10 x PBS (pH 7,0-7,3) a 400 µ l di soluzione di riserva refrigerata collagene. Miscelare la soluzio....
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Risultati
Formazione di protrusione durante la migrazione delle cellule T è un processo altamente dinamico, che è dipendente di actina. Per visualizzare la formazione di protrusione di CTL umano primario, transfected transitoriamente una proteina mEGFP fusa per etichettare il citoscheletro di actina in CTL come descritto prima delle11. Un giorno dopo trasfezione, le cellule sono state incorporate nella matrice di collagene. Serie di immagini sono state acquisite ogni 40 s co.......
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Discussione
La maggior parte in vitro le analisi sono effettuata su una superficie 2D, ad esempio in piastre di coltura cellulare, capsule di Petri o sulle lamelle, considerando che in vivo le cellule, soprattutto le cellule immuni, esperienza principalmente un microambiente 3D. La prova emergente indica che modelli di migrazione delle cellule immuni differiscono tra 2D e 3D scenari17. Inoltre, i profili di espressione delle cellule del tumore sono differenti in 2D e 3D-in coltura di tessuti.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi finanziario o commercio.
Ringraziamenti
Ringraziamo l'Istituto di clinica Hemostaseology e medicina trasfusionale per la fornitura di sangue del donatore; Carmen Hässig e Cora Hoxha per l'eccellente assistenza tecnica. Ringraziamo Jens Rettig (Saarland University) per il vettore di pMAX modificate, Roland Wedlich-Soldner (Università di Muenster) per il costrutto originale LifeAct-Ruby e Christian Junker (Saarland University) per generare il costrutto LifeAct-mEGFP. Questo progetto è stato finanziato da 1027 Sonderforschungsbereich (progetto A2 a B.Q.) e 894 (progetto A1 a M.H.). Il microscopio di luce-foglio è stato finanziato dalla DFG (GZ: FUGG 19-1 INST 256/4).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fibricol, soluzione di collagene bovino | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Matrice di collagene |
| 0,5 M Soluzione NaOH | Merck | 1091381000 | per neutralizzare la soluzione di Fibricol |
| Agarosio a bassissimo punto di fusione | Affymetrix | 32821-10GM | Preparazione del campione in |
| Dynabeads Kit di cellule T CD8 umane intatte | Thermo Fisher | 11348D | Isolamento di cellule T umane primarie CD8+ da PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 per l'espansione e l'attivazione delle cellule T | Thermo Fisher | 11132D | Attivazione di popolazioni di CTL |
| Interleuchina-2 ricombinante umana | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimolazione di CTL |
| P3 in coltura Kit di soluzione primaria | Trasfezione | ||
| Lonza V4XP-30XXAnticorpo &alfa;-PFN1, coniglio, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Falloidina | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrana Colorazione | Thermo Fisher | C10045 | Etichetta cellulare fluorescente |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Albumina sierica bovina | Sigma | A9418-100G | IF |
| Capra &alfa; Coniglio 568, IgG, coniglio | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Microscopia a foglio luminoso) | Zeiss | N.A. | |
| Cappa per coltura cellulare | Thermo Fisher | HeraSafe KS Incubatore | |
| per coltura cellulare HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuga 5418 e 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020 3123000063 | |
| punte Pippette | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| Provette da 15 mL | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillari 50 &; L | VWR (Marca) | 613-3373 | Zeiss Preparazione del campione LSFM |
| Stantuffo per capillari | VWR (Marca) | BRND701934 | "Timbri con punta in teflon" Preparazione del campione LSFM |
| MColorPunte per pH | Phast Merck | 1095430001 | per testare il pH delle siringhe neutralizzate Fibricol |
| BD Plastipak da 1 ml | BD | Z230723 ALDRICH | Preparazione alternativa del campione |
| Argilla da modellare (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Convertitore di file Imaris | Bitplane | disponibile all'indirizzo http://www.bitplane.com | Converti i file di imaging in formato file Imaris |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | disponibile all'indirizzo http://www.bitplane.com | Analisi di dati di imaging 3D e 4D |
Riferimenti
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
- Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M.
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Ristampe e permessi
