Qui, presentiamo un protocollo per la fabbricazione di piastre gradiente GNSM via nanoimprinting termica e il metodo di screening risposte di cellule progenitrici endoteliali umane alle nanostrutture. Utilizzando la tecnologia descritta, è possibile produrre un ponteggio che può manipolare il comportamento delle cellule di stimoli fisici.
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Articolo metodologico
Fabbricazione di GNSM gradiente termico Nanoimprinting tecnica e Screening della risposta delle cellule endoteliali umane formanti colonie
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nanotopography può essere trovato in varie matrici extracellulari (ECMs) intorno al corpo ed è conosciuto per avere importanti atti normativi su reazioni cellulari. Tuttavia, è difficile da determinare la relazione tra le dimensioni di una nanostruttura e le risposte delle cellule a causa della mancanza di un'adeguata selezione di strumenti. Qui, ci mostra lo sviluppo delle piastre GNSM gradiente riproducibile ed economica per la manipolazione delle risposte cellulari. Utilizzando ossido di alluminio anodico (AAO) come uno stampo master, gradiente GNSM piastre con nanopillars delle gamme di diametro crescente [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) e 280-360 nm (GP 280/360)] sono stati fabbricati da una termica imprinting tecnica. Queste piastre di gradiente GNSM sono state progettate per imitare le varie dimensioni dei nanotopography in ECM e sono state utilizzate per lo screening delle risposte delle cellule formanti colonie endoteliali umane (hECFCs). In questo protocollo, descriviamo la procedura dettagliata di fabbricare gradiente GNSM piastre per ingegneria, tecniche di coltivazione hECFCs da sangue periferico umano e hECFCs il GNSM piastre di coltura delle cellule.
Introduzione
Recentemente, la risposta delle cellule dalla stimolazione fisica della topografia superficiale è stato messo in luce nel campo della cella ingegneria1,2,3,4. Di conseguenza, si è concentrati più su nanostrutture tridimensionali al superficie cellulare allegato5. È stato segnalato che l'integrina, che è il dispositivo di riconoscimento superficie della cella, trasmette lo stimolo fisico guidato dalle strutture micro-nano di ECM a Meccano-trasduzione6. Questa stimolazione meccanica regola il com....
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Protocollo
Questo studio è stato approvato dalla Institutional Review Board presso ospedale di Corea Università Anam (IRB No. ED170495). Tutte le procedure sono state effettuate conformemente alla dichiarazione di Helsinki e sue modifiche successive.
1. preparazione del substrato di alluminio (Al) di elettrolucidatura
Attenzione: Soluzione di elettrolucidatura è corrosivo e tossico. Indossare indumenti protettivi, compresi guanti di nitrile, occhiali e camice da laboratorio. Eseguire questo passaggio in una cappa aspirante.
- Preparare l'elettrolucidatura soluzione mescolando etilico alcol (C2<....
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Risultati
La figura 1 Mostra immagini di SEM degli stampi AAO gradienti fabbricati secondo il loro tipo e la posizione. La figura 2 Mostra immagini di SEM di gradiente GNSM piastre con nanopillars regular-arrotondato, e nella figura 3 è dati di quantificazione del diametro nanopillars. La tabella 1 elenca le caratteristiche della nanopillars fabbricato.
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Discussione
Fabbricazione di un AAO spesso soffre di difetti quali cricche, forme irregolari di pori e la masterizzazione. La ragione principale di questi difetti è chiamata un breakdown elettrolitico, che è fortemente influenzata dalla natura dei substrati metallici essendo anodizzato e la resistività del elettroliti21. Poiché la resistività dell'elettrolito varia a seconda della sua temperatura, eliminando calore continuamente dagli elettrodi è il punto critico per mantenere la temperatura tra piazze dell'e.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca di scienza base attraverso la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziato dal Ministero dell'istruzione, scienza e tecnologia (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] e Bio & Medical Technology Development Programma della NRF finanziato dal Ministero della scienza, ICT & futuro pianificazione [NRF-2017M3A9C6029563].
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido perclorico 60% | Daejung Chemicals & Metalli | 6512-4100 | |
| Alcool etilico, assoluto 99,9% | Daejung Chemicals & Metalli | 4118-4100 | |
| Acido fosforico 85% | Daejung Chemicals & Metalli | 6532-4400 | |
| Alcool metilico 99,5% | Daejung Chemicals & Metalli | 5558-4400 | |
| Ossido di cromo (VI) | Daejung Prodotti chimici e Metalli | 2558-4400 | |
| Acido solforico 95% | Daejung Chemicals & Metalli | 7781-4100 | |
| Perossido di idrogeno 30% | Daejung Chemicals & Metalli | 4104-4400 | |
| n-esano 95% | Daejung Prodotti chimici & Metalli | 4081-4400 | |
| Toluene 99,5% | Daejung Prodotti chimici e Metalli | 8541-4400 | |
| (eptadecafluoro-1,1,2,2,-tetraidrodecil)dimetilclorosilano | Gelest | SIH5840.4 | Sensibile all'umidità |
| Metossinonafluorobutano 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
| Soluzione di collagene | Stemcell | #4902 | |
| Gelatina | Sigma aldrich | G1890 | Soluzione di rivestimento |
| proteicoFicoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Soluzione polisaccaridica idrofila |
| EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Mezzo di espansione delle cellule endoteliali |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Gibco | 10010031 | |
| Siero fetale bovino | Gibco | 12483-020 | |
| Paraformaldeide | Sigma aldrich | P6148 | |
| Glutaraldeide | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
| Tetrossido di osmio | Sigma aldrich | 201030-1G | |
| Esametildisilazano | Sigma aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Ottilfenolo etossilato... |
| Siero di capra | Gibco | 26050-088 | |
| anticorpo primario anti-vinculina umana | Sigma aldrich | V9131 | |
| Sonda F-actina | Sonde molecolari | A12379 | Falloidina coniugata a fluorescenza |
| Alexa Fluor 488-coniugato anti-topo | Sonde molecolari | A11001 | Anticorpo secondario coniugato a fluorescenza |
| 4',6-diamidino-2-fenilindolo | Sigma aldrich | D9542 | |
| Mezzo di montaggio | DAKO | S3023 | |
| Anticorpo primario vWF anti-umano | DAKO | A0082 | |
| Anti-umano Anticorpo primario CD144 | BD Bioscienze | #555661 | |
| Eponate 12&commercio; Kit di inclusione, con BDMA | Ted Pella | 18012 | Resina epossidica |
| Acetato di uranile, 25 g | Ted Pella | 19481 | |
| Citrato di piombo, triidrato, 10 g | Ted Pella | 19312 | |
| Piastra in alluminio ultra puro | Goodfellow | 26050-088 | |
| Foglio di polistirene | Goodfellow | ST313120 | |
| 8,0" wafer di silicone | Siltron | 29-01024-03 | Lato singolo lucido, 725 &; m spessore |
| Essiccatore a vuoto, 4,4 L | Kartell | KA.230 | |
| Pompa a vuoto | Aspiratore | V3. VOP100 | |
| Alimentatore | Unicorntech | UDP-3003 | |
| Agitatore magnetico | Daihan scientific | SL. | |
| Agitatore ad asta | Daihan scientific | HT120DX | |
| Circolatore | Daihan scientific | WCR-P12 | |
| Tavolino mobile lineare | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| Staffa angolare, 90 gradi | Zaber | AB90M | tavolino mobile lineare |
| , 145 mm | Vitlab | 67995 | Pinzetta non metallica |
| Bicchiere in PTFE, 250 mL | Cowie | CW007.25 | |
| Pulitore ad ultrasuoni | Branson | B2510MTH | |
| Taglierina per PCB | Hozan Tool Dispositivo industriale | K-110 | |
| Nanoimprint | Nanonex | NX-2000 | |
| Generatore di plasma di ossigeno | Femto Science | CUTE | |
| Sterilizzatore a bassa temperatura | Lowtem | Crystal 50 | |
| CO2 Incubatore | Panasonic | MCO-18AC | |
| Confoal microscopio a scansione laser | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Microscopio elettronico a scansione | JEOL | JSM6701 | |
| Microscopio elettronico a trasmissione | Hitachi | H-7500 |
Riferimenti
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
- Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W.
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Ristampe e permessi
