Method Article

Modellazione di Osteosarcoma con la sindrome di Li-Fraumeni paziente-derivato indotto Pluripotent Stem Cells

DOI:

10.3791/57664

⸱

June 13th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology and Pharmacology, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas MD Anderson Cancer Center UTHealth, 3Department of Musculoskeletal Oncology, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4Women's Health Institute, Cleveland Clinic Foundation, 5Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, The Brown Foundation Institute of Molecular Medicine for the Prevention of Human Diseases, The University of Texas Health Science Center at Houston, 6Center for Precision Health, School of Biomedical Informatics and School of Public Health, The University of Texas Health Science Center at Houston

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di induced pluripotent Stem Cells (iPSCs) da fibroblasti derivata pazienti di sindrome di Li-Fraumeni (LFS), differenziazione delle iPSCs tramite cellule staminali mesenchimali (MSCs) di osteoblasti e modellazione in vivo tumorigenesi utilizzando osteoblasti derivati paziente LFS.

Abstract

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Sindrome di Li-Fraumeni (LFS) è un disordine ereditario dominante autosomal del cancro. I pazienti con LFS sono predisposti a un tipo di vari tumori, compreso osteosarcoma..--una delle malignità primaria non ematologica più frequente nell'infanzia e nell'adolescenza. Di conseguenza, LFS fornisce un modello ideale per studiare questa malignità. Approfittando delle metodologie iPSC, osteosarcoma LFS-collegato può essere modellato con successo differenziando LFS iPSCs paziente alle cellule staminali mesenchimali (MSCs) e quindi di osteoblasti, le cellule di origine per gli osteosarcomi. Questi osteoblasti LFS ricapitolano proprietà oncogeniche di osteosarcoma, fornendo un sistema di modello attraente per delineare la patogenesi di osteosarcoma. Questo manoscritto viene illustrato un protocollo per la generazione di iPSCs da fibroblasti pazienti di LFS, differenziazione delle iPSCs per MSCs, differenziazione di cellule staminali mesenchimali di osteoblasti e tumorigenesi in vivo utilizzando osteoblasti LFS. Questo modello di malattia di iPSC può essere esteso per identificare potenziali biomarcatori o bersagli terapeutici per LFS-collegati di osteosarcoma.

Introduction

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Tra il 2006 e 2007, parecchi risultati di svolta dai laboratori di DRS. Shinya Yamanaka e James A. Thomson ha condotto allo sviluppo di pluripotenti indotte (iPSCs) le cellule staminali1,2,3. Di riprogrammare le cellule somatiche con definiti fattori trascrizionali a forma iPSCs, i ricercatori sono stati in grado di generare cellule con caratteristiche chiave, vale a dire, pluripotenza e auto-rinnovamento, che era precedentemente pensato solo esistono in cellule staminali embrionali umane (hESC). iPSCs potrebbe essere generato da qualsiasi individuo o il paziente e non ha dov....

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Protocol

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Questo lavoro è stato approvato da The University of Texas Health Science Center a Houston (UTHealth) Animal Welfare Committee. Gli esperimenti vengono eseguiti in stretta conformità con le norme stabilite dal centro UTHealth per la medicina del laboratorio animale & cura (CLAMC) che è accreditato dall'associazione americana per laboratorio Animal Care (AAALAC International). I soggetti umani in questo studio rientrano Scenario un ("No Human Subjects Research"), come definito nella documentazione di NIH SF424. Pertanto, non ha bisogno di alcuna approvazione comitato etico di UTHealth ricerca umana.

1. generazione di LFS iPSCs (

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Results

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Questo protocollo presenta le procedure incluse LFS iPSC generazione MSC differenziazione, differenziazione degli osteoblasti e in vivo nella tumorigenesi analisi usando osteoblasti LFS MSC-derivato.

Schema per la generazione di LFS iPSCs dai fibroblasti utilizzando un virus Sendai disponibile in commercio kit di riprogrammazione è mostrato in Figura 1A. Sendai virus-ha basato la consegna d.......

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Discussion

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Per raggiungere una maggiore efficienza di differenziazione di MSC, alcuni aspetti sono fondamentali. Uno è la condizione di cultura di iPSCs prima dell'inizio della differenziazione di MSC. Il protocollo presentato nel manoscritto si basa su precedenti studi 9,17. iPSCs devono essere coltivate su MEFs per almeno 2 settimane. Mantenere iPSCs in buone condizioni su MEFs sono critiche per celle fissare la piastra rivestite con gelatina per il differenziamento di MS.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

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R. Z. è supportato da UTHealth innovazione per cancro Prevenzione ricerca formazione programma corso Fellowship (prevenzione del cancro e Istituto di ricerca del Texas concedere RP160015). J.T. è supportato dal programma Ke Lin dell'Università ospedale affiliato prima di Sun Yat-sen. D.-F.L. è lo studioso CPRIT nella ricerca sul cancro e supportato da NIH via indipendenza Premio R00 CA181496 e CPRIT premio RR160019.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Plastic ware
100 mm PiattoCorning430107
60 mmCorning430166
Piastra a 6 pozzettiFalcon353046
12 pozzetti353043
Falcon48 pozzetti353078
1 mL Punta per pipettaUSA Scientific1111-2721
200 µ L Punta per pipettaUSA Scientific1111-0706
10 & micro; L Pipet TipUSA Scientific1111-3700
Pipetta sierologica da 5 mLSARSTEDT86.1253.001
Pipetta sierologica da 10 mLSARSTEDT86.1254.001
Pipetta sierologica da 25 mLSARSTEDT86.1685.001
Provetta da 50 mL, PPSARSTEDT62.547.100
Provetta da 15 mL, PPSARSTEDT62.554.100
Materiali di coltura e reagenti
CytoTune- iPS 2.0 Kit di riprogrammazione SendaiInvitrogenA16517Kit di riprogrammazione del virus Sendai commerciale
Corning hESC Matrice qualificata Corning 354277Matrice a membrana basale
CF1 MEF, irradiataThermoFisherA34180
DMEMSigma-AldrichD5671
DMEM/F12Corning10-090-CV&
alpha; MEMCorning10-022-CV
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368Commercial iPSC medium
KnockOut DMEM/F-12ThermoFisher12660012
FBS Opti-GoldGenDEPOTF0900-050
KnockOut Siero di ricambioThermoFisherA3181502
Penicillina-StreptomicinaSigma-AldrichP4333
MEM Aminoacidi non essenzialiCorning25-025-CI
Soluzione di L-glutamminaSigma-AldrichG7513
2-MercaptoetanoloSigma-AldrichM3148
FGF-basico umano (bFGF)PEPROTECH100-18B
PDGF-AB UMANO RICOMBINANTEPEPROTECH100-00AB
β-glicerofosfatoSigma-AldrichG9422
DesametasoneSigma-AldrichA4902
Acido ascorbicoSigma-AldrichA5960
salina tamponata con fosfato di Dulbecco, 1x (DPBS)Corning21-031-CV
Soluzione di passaggio StemMACS XFMiltenyi Biotec130-104-688Soluzione di passaggio commerciale
Soluzione di distacco cellulare AccutatseCorning25-058-CISoluzione di distacco cellulare
Tiazovivin (inibitore ROCK)Calbiochem420220
Soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25%Sigma-AldrichT4049
Collagenasi, Tipo II   ThermoFisher17101015
R& Anticorpo umano NANOG D SystemAF1997
OCT4 Anticorpo (H-134)Santa Cruzsc-9081
Umano/Topo SSEA-4 PE-conjugated AntibodyR& Sistema DFAB1435P
Alexa Fluor 555 Topo Anti-Umano TRA-1-81 AntigeneDB Biosciences560123
Alexa Fluor 488 Asino Anti-Capra IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch705-545-003
Alexa Fluor 488 Capra Anti-Coniglio IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch111-545-144
PE Topo Anti-Umano CD105eBioscience12-1057-42
FITC Topo Anti-Umano CD44DB Biosciences555478
PE Topo Anti-Umano CD73DB Biosciences550257
PE Topo Anti-Umano CD166DB Biosciences560903
FITC Topo Anti-Umano CD24DB Biosciences555427
Siero d'AsinoJackson ImmunoResearch017-000-121
Siero di capraJackson ImmunoResearch005-000-121
Kit di colorazione con fosfatasi alcalina IIStemgent00-0055
Rosso di alizarina SSigma-AldrichA5533
Reagente TRIzolThermoFisher15596018
CloroformioThermoFisherC298-500
2-propanoloThermoFisherA416-4
Etanolo, assoluto, grado di biologia molecolareThermoFisherBP28184
DNasi I, privo di RNasi (1 U/µ L)ThermoFisherEN0521
iScript cDNA Synthesis KitBioRad1708891BUN
iQ SYBR Green SupermixBioRad1708884
Matrigel Matrix High Concentration (HC), senza fenoloCorning354262
1 mL Siringa con punta a slittamento, 26 gauge x 5/8 polliciDB Biosciences309597
Piatto Corning da Piastra Falcon a Piastra a Soluzione

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult h....

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