Questo protocollo descrive la labyrinthectomy chirurgica di un topo, che è un metodo utile per lo studio del sistema vestibolare.
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Articolo metodologico
Labyrinthectomy chirurgica del ratto per studiare il sistema vestibolare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Per studiare il sistema vestibolare o il processo di compensazione vestibolare, un numero di metodi è stato sviluppato per causare danno vestibolare, tra cui labyrinthectomy chirurgica o chimica e neurectomia vestibolare. Labyrinthectomy chirurgica è un metodo relativamente semplice, affidabile e rapido. Qui, descriviamo la tecnica chirurgica per ratto labyrinthectomy. Un'incisione postauricular fatta in anestesia generale per esporre il canale uditivo esterno e la membrana timpanica, dopo di che la membrana timpanica e gli ossicini vengono rimossi senza stapes. L'arteria dello stapes, che si trova tra la staffa e la finestra ovale, è una struttura vulnerabile e dovrà essere conservato per ottenere un campo chiaro chirurgico. Un buco a fenestrate il vestibolo è realizzato con una fresa trapano 2,1 mm superiore a stapes. Poi, 100% etanolo è iniettato attraverso questo foro e aspirato più volte. Dissezione meticolosa sotto un microscopio e un attento controllo del sanguinamento sono essenziali per ottenere risultati affidabili. Sintomi di perdita vestibolare, quali nistagmo, inclinazione testa e un movimento di rotolamento, sono visibili immediatamente dopo la chirurgia. Il test di sedia rotarod o rotazione può essere utilizzato per oggettivamente e quantitativamente valutare la funzione vestibolare.
Introduzione
L'organo vestibolare è essenziale per il controllo di equilibrio e con gli occhi. Una normale funzione vestibolare dipende simmetrici segnali afferenti dagli organi vestibolari nei due orecchi interni. Ipofunzione vestibolare o perdita induce vertigini, nistagmo e squilibrio posturale. Dopo danno acuto, la funzione vestibolare recupera spontaneamente entro alcuni giorni, un processo conosciuto come il compenso vestibolare1,2. Il compenso vestibolare dei deficit statico è un processo di recupero legata allo squilibrio dell'attività spontanea che riposa fra i nuclei vestibolari ipsilaterale e controlaterali. Il compenso vestibolare dei deficit dinamico avviene principalmente tramite sostituzioni sensoriali e comportamentali (utilizzando input visivo o somatosensoriali)3. Questi processi sono attraenti per plasticità neuronale studi4,5.
Un numero di metodi è stato sviluppato per studiare il sistema vestibolare e i meccanismi alla base della plasticità neuronale durante il compenso vestibolare, come labyrinthectomy chirurgico e chimico e neurectomia vestibolare5,6 ,7,8. Neurectomia vestibolare è un certo modo di indurre perdita vestibolare completa, ma è una procedura più complessa e invasiva e può indurre danni cerebrali8,9. Questo metodo richiede una maggiore abilità chirurgica e richiede più tempo che labyrinthectomy. Labyrinthectomy chimici, tra cui la gentamicina, arsanilate e tetracaina, è più facile e può produrre risultati affidabili10,11,12. Tuttavia, la coclea può anche essere danneggiata e perdita vestibolare può svilupparsi nel tempo11. Inoltre, gli effetti delle sostanze chimiche sul cervello, che deve essere conservato per una valutazione accurata, sono poco chiari. Labyrinthectomy chirurgico è stato introdotto negli studi sugli animali in 184215 e in primo luogo è stato segnalato nel ratto in 193616. Questa tecnica è stata usata da allora in molti animale studia5,17,18,19. Labyrinthectomy chirurgica è un metodo specifico, affidabile e relativamente semplice. 13 , 14 inoltre, i sintomi di danno vestibolare sono visti immediatamente dopo la chirurgia. Qui, descriviamo la nostra tecnica chirurgica per ratto labyrinthectomy.
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Protocollo
Questo studio è stato svolto in conformità delle istituzionali Animal Care e uso Comitato di Seoul National University Hospital (14-0148-C1A1), che è accreditato dall'associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio Animal Care Internazionale.
Nota: Gli esperimenti sono stati condotti su ratti maschi Sprague-Dawley (deviazione standard) del 7-8 settimane di età (200/250 g). Ogni animale è stati acclimatati alle condizioni di laboratorio per 1 settimana prima dell'inizio dell'esperimento. Gli animali sono stati alloggiati in una camera a temperatura e umidità controllata con una costante 12-h:12-h chiaro: scuro ciclo con libero accesso a cibo e acqua.
1. Labyrinthectomy
- Coprire gli strumenti chirurgici sterilizzati nell'autoclave con un tampone sterile. Disinfettare la zona operativa con etanolo al 70%. Utilizzare un telino sterile e mantenere condizioni di sterilità durante l'intervento chirurgico.
- Indossare un abito, maschera (per coprire naso e bocca), PAC (per coprire la testa) e un paio di guanti sterili. Gli strumenti chirurgici devono solo venire a contatto con superfici sterili.
- Iniettare l'anestetico zolazepam tiletamina (40 mg/kg di peso corporeo) per via intramuscolare nella coscia mediale o intraperitonealmente e xilazina (10 mg/kg di peso corporeo) per via intramuscolare o per via intraperitoneale.
Nota: Altre modalità di anestesia generale, incluse inalazione isoflurane, può anche essere utilizzato. - Posto il ratto su un tappetino riscaldante (inizialmente fissato a 42 ° C). Applicare unguento oculare lubrificante in entrambi gli occhi del ratto per prevenire la secchezza dell'occhio mentre sotto anestesia.
- Posto il ratto sul suo lato destro. Radere il pelo nella zona chirurgica con tosatrici. Disinfettare il sito con etanolo al 70%.
- Iniettare 1% lidocaina cloridrato per via sottocutanea nella zona retroauricular sinistra.
- Utilizzando una lama per bisturi #15, fare un'incisione di retroauricular cm ~5.0. Separare il muscolo e la fascia di esporre il canale uditivo esterno con forbici Iris (Figura 1A). Aprire leggermente il canale uditivo esterno utilizzando la lama #15 o le forbici Iris (Figura 1B). Ampiamente esporre la membrana timpanica (Figura 2A).
- Sotto un microscopio (7.5 X o 12,5 X), rimuovere la membrana timpanica e gli ossicini ad eccezione dello stapes, usando il forcipe. Staccare i muscoli sul crinale lambdoidal con la lama #15 o le forbici Iris (Figura 2B).
- Utilizzando un trapano a bassa velocità (< 3000 giri/min) con una fresa diamantata (2.1 o 1,4 mm), forare l'osso timpanico bulla attorno al punto di uscita del nervo facciale (Figura 3A). Identificare l'arteria stapediali. Fare attenzione a non per danneggiare l'arteria stapediali durante il processo di perforazione.
- Continuare ad esplorare il vestibolo superiore all'arteria stapediali ed esporre la finestra rotonda e il canale semicircolare laterale ossuto. Aprire il canale semicircolare laterale vicino alla sua ampolla. Continuare ad esplorare nel piano del canale semicircolare laterale e forare l'ampolla del canale semicircolare superiore.
- Aspirare il contenuto del vestibolo utilizzando un ago 18-G o 22-G. Iniettare e aspirare 1 cm3 di etanolo 100% 3 x.
- Chiudere i muscoli e la pelle in due strati con i suturare interrotti semplici.
- Non lasciare incustodito un animale fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Mantenere caldo il ratto fino a quando non risveglia con un rilievo di riscaldamento o una lampada di calore. Dopo il risveglio, spostare il ratto in una gabbia individuale in una sala con le solite condizioni ambientali.
- Somministrare antibiotici (ad es., Cefazoline 20 mg/kg, trimetoprim-sulfonamide 100 µ l per via sottocutanea, o penicillina 300.000 IU) come necessario il giorno 1; un analgesico (non un oppioide; ad esempio, Metacam 2mg/kg, Carprofen 5 mg/kg per via sottocutanea) può anche essere somministrato.
2. sham chirurgia
- Per la chirurgia di sham come controllo, eseguire le stesse procedure chirurgiche e post-chirurgiche (secondo la sezione 1), tra cui l'esposizione del canale uditivo esterno e la membrana timpanica (punto 1.7), la rimozione della membrana timpanica e gli ossicini e la distacco dei muscoli sul lambdoidal colmo (passo 1,8), ma non aprire il canale semicircolare o iniettare etanolo.
3. controllare la perdita della funzione vestibolare
Nota: La perdita della funzione vestibolare può essere valutata utilizzando sia le prove di funzione comportamentale o vestibolare. 13 , 17 , 18 prove comportamentali includono la valutazione della asimmetria posturale e nistagmo.
- Identificare asimmetria posturale che comprende spontanei o evocati barile-rolling, che cade sul lato sinistro, o muoversi mentre sporgendosi verso il lato leso18. Guarda il Video 1.
- Identificare il nistagmo da un controllo visivo del movimento di occhio volontaria. Quando il nistagmo spontaneo è assente in stato di riposo, soffio aria delicatamente sopra la testa dell' animale18. Guarda il Video 2.
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Risultati
Il successo della chirurgia è stato convalidato da test comportamentali. Tutti gli animali hanno esibito il comportamento tipico di una perdita della funzione vestibolare unilaterale. Barile-rotolamento spontaneo era evidente subito dopo della chirurgia, essere evocato da un soffio di aria sopra la testa o un tocco leggero al corpo nella fase iniziale di recupero (Video 1). 3 d dopo la chirurgia, gli animali spostati sporgendosi verso il lato leso con occasionali cade sul...
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Discussione
Questa tecnica è un metodo utile per la creazione di perdita di funzione vestibolare improvvisa, permanente e completa. Questo potrebbe essere utilizzato per lo studio di patologie vestibolari, come neurite vestibolare, un tumore acustico e la malattia di Meniere. Molti studi hanno utilizzato questa tecnica per studiare la plasticità neuronale dei nuclei vestibolari o il relativo processo centrale5,17,18,
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione dalla Corea Health Technology R & D Project attraverso Corea salute industria Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della salute & benessere, Repubblica di Corea (concessione numero: HI15C2651).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ASPIRATORE KB-012 | KOH BONG & CO., LTD. | KB-012 | Aspiratore medico |
| Lama: #15 | Fine Science Tools | #10015-00 | Lame per #7 manici per bisturi, #15 |
| Frese in acciaio al carbonio Fine | Science Tools | #19007-05 | diametro dell'albero: 2,3 mm, lunghezza: 44 mm, confezione da 10 frese |
| Carl Zeiss Surgical GmbH | Carl Zeiss | #6627100863 | Microscopio operatorio |
| Dumont #3c | Fine Science Tools | #11231-20 | Punta standard 0,17 x 0,10 mm, 11 cm |
| Dumont #5SF | Fine Science Tools | #11252-00 | |
| Dumont #7B | Fine Science Tools | #11270-20 | Seghettato 0,17 x 0,10 mm, 11 cm |
| Extra Fine Bonn: dritto | Fine Science Tools | #14084-08 | Forbici per iris, più adatte per la microdissezione ad alto ingrandimento |
| Forbici per iride fini: dritte | Fine Science Strumenti | #14094-11 | Realizzato in acciaio inossidabile martensitico, combinato con molibdeno e vanadio |
| Finger Loop Ear Punch | Fine Science Tools | #24212-01 | 1 mm. Fornisce stabilità e controllo ai ricercatori che utilizzano il sistema di numerazione |
| Hartman | Fine Science Tools | #13002-10 | Larghezza della punta: 1 cm, seghettata, 10 cm |
| Manico corto per bisturi #7 Solid | Fine Science Tools | #10003-12 | Cauterizzatore corto da 12 cm |
| piccoli vasi | Strumenti per la scienza | #18000-03 | Punta di ricambio, coltello dritto, mantiene il sanguinamento al minimo e quindi fornisce un campo chirurgico libero da morsetti ed emostatici |
| Forte 207S | SAESHIN | 207S | Coppia potente a bassa velocità, disponibile con regolatore di velocità o on/off a pedale |
| Tubi di aspirazione | JEUNGDO B& P CO., LTD. | H-1927-8 | Frazier, 18 cm |
| VICRYL | ETHICON | W9570T | Sutura chirurgica sterile sintetica assorbibile |
| Weitlaner-Locktite | Fine Science Tools | #17012-13 | Diffusione massima: 4,5 cm, 2 x 3 denti smussati, 11 cm |
| Zoletil | Virbac, Francia | Tiletamine-zolazepam | |
| Rompun | Bayer | Xylazine | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofene | |
| Septra | Pfizer | Trimetoprim-sulfonamide |
Riferimenti
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