Questo studio presenta una procedura convalidata e ottimizzata per l'isolamento e la coltura delle cellule stromali dell'endometrio umane per condurre l'analisi in vitro decidualizzazione. Inoltre, questo studio fornisce un metodo dettagliato per atterramento in modo efficiente un gene specifico utilizzando siRNA in cellule stromal dell'endometrio umane.
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Articolo metodologico
Isolamento delle cellule stromali dell'endometrio umane per In Vitro decidualizzazione
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La differenziazione delle cellule stromale dell'endometrio umane (HESC) da fibroblasto-come l'apparenza nella decidua secretiva è una trasformazione necessaria per l'impianto dell'embrione nella mucosa uterina del grembo materno. Decidualizzazione improprio è stato stabilito come causa radice per mancato impianto e conseguente aborto spontaneo precoce l'embrione. Pertanto, comprendere i meccanismi molecolari sottostanti decidualizzazione è vantaggioso per migliorare il tasso di nascite di successo. In vivo basato su studi di decidualizzazione artificiali sono spesso limitanti a causa di dilemmi etici connessi con la ricerca umana, come pure traslazionale complicazioni all'interno di modelli animali. Di conseguenza, saggi in vitro mediante colture cellulari primarie sono spesso utilizzate per esplorare la modulazione della decidualizzazione tramite ormoni. Questo studio fornisce un protocollo dettagliato per l'isolamento di HESC e successive decidualizzazione artificiale tramite il completamento di ormoni al mezzo di coltura. Inoltre, questo studio fornisce un metodo ben progettato per atterramento qualsiasi gene di interesse utilizzando siRNA basata sui lipidi transfezioni. Questo protocollo consente l'ottimizzazione della purezza di cultura così come la resa del prodotto, in modo da massimizzare la capacità di utilizzare questo modello come un metodo affidabile per capire i meccanismi molecolari sottostanti decidualizzazione e la successiva quantificazione del agenti secreti dalle cellule stromali dell'endometrio proteina.
Introduzione
Tra le tappe del menarca e la menopausa, le donne dell'età riproduttiva subiscono cicli mensili di ormone-regolata proliferazione dell'endometrio, la differenziazione e il successivo spargimento in preparazione per la gravidanza in un processo noto come mestruazioni1 ,2. Tali modifiche fisiche dell'endometrio umano sono necessari per l'impianto di embrione corretta nel parete uterina1. Alterazioni dell'endometrio, compresi gli adattamenti sia morfologici e biochimici, sono mediate durante il ciclo mestruale tramite ormoni steroidi ovarici estrogeni e progesterone (P4)....
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Protocollo
Tutte le biopsie dell'endometrio umano raccolte per questo studio sono state conseguite presso l'Università di Washington a St. Louis, dipartimento di ostetricia e ginecologia utilizzando un Institutional Review Board (IRB) ha approvato il modulo di consenso scritto.
1. preparazione
- Preparare 500 mL di 1 x di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS) aggiungendo 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina nel flacone contenente media (ulteriore riferito come HBSS + medio).
- Preparare 500 mL di Medium di Eagle per volta di Dulbecco: miscela nutriente F-12 (DMEM/F12) con rosso fenolo, L-Glutammina e 15 mM 4-(2-hydroxy....
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Risultati
Decidualizzazione HESC cultura
A seguito di isolamento, cellule stromali dell'endometrio umane sono state coltivate ad una formazione di monostrato con confluency di 80-90% e indotta per in vitro decidualizzazione trattando con 10 nM E2, 1 µM MPA e 50 µM cAMP (EPC). Cambiamenti morfologici associati in vitro decidualizzazione sono stati visualizzati in Figura 1A. A.......
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Discussione
Il ciclo mestruale femminile riproduttivo è caratterizzato da un aumento nei livelli di progesterone durante la fase luteale, quindi inducendo la decidualizzazione dell'ESC in tondo, epiteliale-come le cellule secretive3,8. L'iniziazione di decidualizzazione è specie dipendenti. In esseri umani, decidualizzazione si verifica spontaneamente al momento l'aumento della concentrazione del progesterone, mentre topi richiedono blastocisti presenza10
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Dichiarazioni
Questo lavoro è sostenuto da finanziamenti da National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) grant (R00 HD080742) e Start-up Washington University School of Medicine fondi a R.K. Vorremmo ringraziare la clinica di fertilità Washington University per fornire i campioni di biopsia dell'endometrio.
Ringraziamenti
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Opti-MEM I (1X) Siero ridotto Medium | Gibco | 31985-070 | Per terreni di decidualizzazione |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | Per la conta cellulare |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | Per l'isolamento/purificazione dell'RNA |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacità | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Controllo endogeno eucariotico 18S rRNA | Life Technologies | 4319413E | Per il controllo interno qPCR |
| Saggio di espressione genica TaqMan Sonda per prolattina | Applied Biosystems | 4331182 | Per il controllo interno qPCR |
| Espressione genica TaqMan Sonda IGFBP1 | Applied Biosystems | 4331182 | Per il controllo interno qPCR |
| Reagente Falloidina-iFluor 488 - CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Kit ELISA per prolattina umana | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldeide | Alfa Aesar | 30525-89-4 | |
| Lipofectamina fissativa RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Reagente di trasfezione |
| Reagente antisbiadimento ProLong Gold con DAPI | Invitrogen | P36935 | Per montaggio |
| 0,25% Tripsina-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillina Streptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Siero fetale bovino spogliato al carbone | Sigma | F6765-500ML | |
| Bicarbonato di sodio (7,5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagente | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenasi da Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Desossiribonucleasi I da pancreas bovino | Sigma | DN25-100MG | |
| Medrossiprogesterone 17-acetato | Sigma | M1629-1G | Per EPC Media |
| Estradiolo | Sigma | E1024-1G | per EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | Per EPC Media |
| Forbici per punto dritto fine | Strumenti di scienza | fine 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Siero fetale bovino, inattivato a caldo | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotico-antimicotico | Thermo Scientifico | 15240062 | |
| Hank' s Soluzione salina bilanciata | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL polipropilene conico Tubo Falcon | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Pinze | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Piastra di Petri in vetro | VWR | 75845-546 | |
| Filtro cellulare da 40 micron | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Bagno d'acqua | Fisher Scientific | FS-215 | |
| Centrifuga LSE | Corning | 6755 | |
| Umano NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Sonda qPCR specifica per gene |
| Incubatore a CO2 Steri-cycle i160 | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | Per la quantificazione dell'RNA |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Fisher Scientific 50146771 | ||
| Pallone per coltura cellulare a collo inclinato da 75 cm | Corning | 430641U | |
| Piastra per coltura cellulare non pirogena a 6 pozzetti | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| Pallone per coltura cellulare a collo inclinato da 25 cm | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL provetta conica in polipropilene Falcon | Corning | 352099 | |
| Siringa da 10 mL | BD | 302995 | |
| 1300 Serie A2 Cappa di sicurezza biologica | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Centrifuga Micro17 | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast sistema di PCR in tempo reale | Biosystems applicata | 3052632 | |
| EVOS FL Microscopio a immunofluorescenza Life | Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Microscopio a luce invertita | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Fogli di calcolo Excel Microsoft | 2016 | ||
| Deckglaser Occhiali da copertura da 18 mm | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoetanolo | Fisher Bioreagents | BP176-100 | Per tampone di lisi dell'RNA |
| 1,2mL Fiala criogenica in polipropilene filettata esterna | Corning | 430658 | Per il congelamento delle cellule HESC |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | Per terreni di congelamento |
Riferimenti
- Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
- Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualiza....
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Ristampe e permessi
