Articolo metodologico

Isolamento delle cellule stromali dell'endometrio umane per In Vitro decidualizzazione

DOI:

10.3791/57684

⸱

1 settembre 2018

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Center for Reproductive Health Sciences, Washington University School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio presenta una procedura convalidata e ottimizzata per l'isolamento e la coltura delle cellule stromali dell'endometrio umane per condurre l'analisi in vitro decidualizzazione. Inoltre, questo studio fornisce un metodo dettagliato per atterramento in modo efficiente un gene specifico utilizzando siRNA in cellule stromal dell'endometrio umane.

Abstract

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La differenziazione delle cellule stromale dell'endometrio umane (HESC) da fibroblasto-come l'apparenza nella decidua secretiva è una trasformazione necessaria per l'impianto dell'embrione nella mucosa uterina del grembo materno. Decidualizzazione improprio è stato stabilito come causa radice per mancato impianto e conseguente aborto spontaneo precoce l'embrione. Pertanto, comprendere i meccanismi molecolari sottostanti decidualizzazione è vantaggioso per migliorare il tasso di nascite di successo. In vivo basato su studi di decidualizzazione artificiali sono spesso limitanti a causa di dilemmi etici connessi con la ricerca umana, come pure traslazionale complicazioni all'interno di modelli animali. Di conseguenza, saggi in vitro mediante colture cellulari primarie sono spesso utilizzate per esplorare la modulazione della decidualizzazione tramite ormoni. Questo studio fornisce un protocollo dettagliato per l'isolamento di HESC e successive decidualizzazione artificiale tramite il completamento di ormoni al mezzo di coltura. Inoltre, questo studio fornisce un metodo ben progettato per atterramento qualsiasi gene di interesse utilizzando siRNA basata sui lipidi transfezioni. Questo protocollo consente l'ottimizzazione della purezza di cultura così come la resa del prodotto, in modo da massimizzare la capacità di utilizzare questo modello come un metodo affidabile per capire i meccanismi molecolari sottostanti decidualizzazione e la successiva quantificazione del agenti secreti dalle cellule stromali dell'endometrio proteina.

Introduzione

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Tra le tappe del menarca e la menopausa, le donne dell'età riproduttiva subiscono cicli mensili di ormone-regolata proliferazione dell'endometrio, la differenziazione e il successivo spargimento in preparazione per la gravidanza in un processo noto come mestruazioni1 ,2. Tali modifiche fisiche dell'endometrio umano sono necessari per l'impianto di embrione corretta nel parete uterina1. Alterazioni dell'endometrio, compresi gli adattamenti sia morfologici e biochimici, sono mediate durante il ciclo mestruale tramite ormoni steroidi ovarici estrogeni e progesterone (P4)3,4,5. Entro la fase proliferativa (o follicolare), estrogeno preovulatorio i livelli aumentano, avviando l'ispessimento dell'endometrio. Dopo l'ovulazione, la fase secretiva (o luteinica) promuove un aumento significativo delle concentrazioni di P4, che induce la trasformazione morfologica delle cellule stromali dell'endometrio (ESC) da fibroblasto-come l'apparenza arrotondati, epiteliale-come le cellule deciduali in un processo noto come decidualizzazione4,6. Decidualizzazione improprio è stato stabilito come causa radice per mancato impianto e successivi primi embrione aborto spontaneo4,7,8. Di conseguenza, comprendere i meccanismi molecolari sottostanti decidualizzazione è vantaggioso per la diagnosi ed il trattamento di perdita iniziale di gravidanza.

Attualmente, diverse metodologie sono utilizzati per esplorare gli effetti sottostanti di decidualizzazione su cellule stromal dell'endometrio. In vivo, l'utero del mouse può essere indotta artificialmente per decidualizzazione tramite stimolazione meccanica (cioè, graffiare) o iniezione in un utero ormonalmente innescato9di olio. Distinti dagli esseri umani, questa stimolazione sintetica promuove la differenziazione del lume uterino fornendo l'aspetto della presenza di blastocisti, un passo necessario per l'avvio di decidualizzazione in roditori10,11. Di conseguenza, a causa delle complicazioni traslazionale associate modelli animali e i dilemmi etici che circondano in vivo basato su studi in esseri umani, sono più correttamente studiati modelli decidualizzazione basato in vitro.

In questo studio, gli oggetti vengono reclutati attraverso il collocamento di pubblicità in entrambi i giornali locali inglese e spagnolo. Soggetti identificati come idonei per questo studio sono portati dentro per soddisfare con il coordinatore della ricerca, in cui una rilevazione completa dei rischi potenziali sono discussi. Al momento della conferma di una completa comprensione dei potenziali rischi, consenso degli oggetti è raggiunto in forme sia scritte che verbali. Consenso della persona interessata include autorizzazione di (1) subiscono il deposito (2) a lungo termine flebotomia dei loro tessuti per scopi di ricerca futura e (3) d'accordo per la creazione di colture primarie da esemplari raccolti del tessuto. A seguito di consenso, gli oggetti sono dati un modulo da compilare in cui consentito autoidentificazione di razza/etnia e/o il diritto di non divulgazione. Una successiva visita è prevista per raggiungere la biopsia dell'endometrio basata sul ciclo mestruale del soggetto. Volontari reclutati per questo studio riflettono entrambi la demografia etnica e razza della regione metropolitana di St. Louis, come documentato dal censimento del 2012 e non hanno coinvolto la partecipazione di qualsiasi popolazione vulnerabili, tra cui donne incinte, feti, embrioni, bambini sotto i 18 anni di età, o di altri gruppi vulnerabili. Requisiti di ammissibilità per la partecipazione alla raccolta del campione di biopsia includono (1) essere tra i 18-45 anni (2) avere cicli mestruali regolari (25-32 giorni) (3) non avendo attuale gravidanza o uso di contraccettivi ormonali/intrauterina dispositivo per 30 giorni prima dell'arruolamento (4) non avendo attuale infezione vaginale o malattie sessualmente trasmissibili (5) avendo nessuna correnti trattamenti antibiotici e (6) non avendo nessuna corrente Pap test anormale.

All'interno di questo studio, le cellule stromale dell'endometrio umane (HESC) sono coltivate e artificialmente indotte per subire in vitro decidualizzazione attraverso il completamento di ormoni (estradiolo (E2), medrossiprogesterone acetato (MPA) e adenosina ciclica monofosfato ciclico (cAMP)) al mezzo. In questo metodo, il grado di decidualizzazione è alterato basata sul numero totale di giorni di trattamento ormonale. In concomitanza con la riorganizzazione del citoscheletro, completamento ormonale induce adattamenti biochimici in cui le cellule deciduali esperienza qualità secretiva-come2,4. L'espressione dei geni di segno distintivo, come la prolattina (PRL) e proteina legante il fattore di crescita insulino-simile 1 (IGFBP1), possa essere utilizzata per confermare e quantificare il grado di HESC decidualizzazione5,12, 13 , 14. d'importanza, è dimostrata anche la vitalità di questo protocollo per condurre atterramento specifico gene.

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Protocollo

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Tutte le biopsie dell'endometrio umano raccolte per questo studio sono state conseguite presso l'Università di Washington a St. Louis, dipartimento di ostetricia e ginecologia utilizzando un Institutional Review Board (IRB) ha approvato il modulo di consenso scritto.

1. preparazione

  1. Preparare 500 mL di 1 x di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS) aggiungendo 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina nel flacone contenente media (ulteriore riferito come HBSS + medio).
  2. Preparare 500 mL di Medium di Eagle per volta di Dulbecco: miscela nutriente F-12 (DMEM/F12) con rosso fenolo, L-Glutammina e 15 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES) aggiungendo soluzione antibiotico antimicotico (la concentrazione finale di 1% è 0,25 µ g/mL 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL streptomicina Fungizone) ai media contenente flacone (ulteriore riferito come HESC isolamento Media).
  3. Preparare 500 mL di DMEM/F12 con rosso fenolo, L-Glutammina e 15 mM HEPES aggiungendo 10% siero bovino fetale (FBS), 1 x Na2HCO3e 1% penicillina (10.000 U/mL) e streptomicina (10.000 µ g/mL) (penna Strep) ai media contenente bombola (ulteriormente riferimento come HESC Media).
  4. Preparare 500 mL di mezzo di siero ridotto con L-Glutammina, 2,4 g/L sodio bicarbonato e HEPES con 2% carbone spogliato siero bovino fetale (csFBS) e 1% Strep penna ai media contenente flacone (ulteriore riferito come decidualizzazione Media).
  5. Preparare 500 mL di fenolo rosso gratis DMEM/F12 aggiungendo 2% carbone spogliato di siero bovino fetale (csFBS) nei mezzi di comunicazione contenente flacone (ulteriore riferito come Media di cambiamento).
  6. Preparare 10 nM estradiolo (E2), 1 µM medrossiprogesterone acetato (MPA) e 50 µM dell'amp ciclico (cAMP) in un tubo conico in polipropilene da 15 mL e aggiungere un 2 mL / ben aliquota media decidualizzazione precedentemente preparato per in vitro dosaggio di decidualizzazione (ulteriore riferito come EPC Media).
  7. Preparare 50 mL di congelamento media con 90% di FBS e 10% di dimetilsolfossido (DMSO) in tubo conico in polipropilene da 50 mL (ulteriore riferito come Media di congelamento).
  8. Pre-pesare 25 mg di collagenasi e 5 mg di dnasi I in un tubo conico in polipropilene da 50 mL e conservare a-20 ° C.

2. endometrio biopsia acquisizione

  1. Ottenere campioni di biopsia endometrio umano raccolti nella fase proliferativa (giorno 9 - giorno 12) del ciclo mestruale dalla clinica IRB approvato in HBSS.
  2. Lavare i campioni di biopsia con 1 mL di preriscaldati 37 ° C HBSS + medio e agitare delicatamente per rimuovere il sangue in eccesso e delle mucose.

3. isolamento di cellule stromali dell'endometrio umane (HESC)

Nota: Questa procedura di isolamento viene eseguita in un ambiente sterile sotto una cappa di sicurezza biologica.

  1. Trasferire la biopsia con la pinzetta sterilizzati in una provetta conica per centrifuga in polipropilene 50 mL contenente 10 mL HBSS fresco.
  2. Centrifugare la biopsia a temperatura ambiente a 500 x g per 90 s.
    1. Se le rotture di pellet cellulare, re-spin la biopsia a 2.000 x g per 90 s.
  3. Rimuovere il supporto utilizzando una pipetta da 1 mL e lavare con 10 mL di 37 ° C preriscaldato HESC isolamento Media seguita da centrifugazione a 500 x g per 90 s.
  4. Rimuovere il supporto utilizzando una pipetta da 1 mL e vigorosamente aggiungere 3 mL di fresco HESC isolamento Media per sloggiare la biopsia.
  5. Decantare la biopsia in una piastra Petri contenente 5 mL di HESC isolamento Media.
  6. Tritare la biopsia in come piccoli pezzi possibili utilizzando #5 pinze e le forbici bene punto dritto per circa 20 minuti.
  7. Preparare dnasi I e gli enzimi collagenasi aggiungendo 10 mL di HESC isolamento Media pre-pesata dnasi I (0,5 mg/mL) e la collagenosi (2,5 mg/mL). Mescolare con pipetta.
  8. Pipetta taglia campioni di tessuto utilizzando una pipetta da 1 mL in una provetta di polipropilene conica 50 mL nuovo. Lavare con 7 mL di HESC isolamento Media e aggiungere al tubo in polipropilene ad acquisire l'esempio completo.
  9. Centrifugare il campione a temperatura ambiente a 800 x g per 2 minuti, delicatamente, eliminare il surnatante mediante pipetta.
  10. Filtrare la dnasi I e soluzione della collagenosi attraverso 0,2 µm filtro collegati a siringa da 10 mL direttamente sul pellet.
  11. Vortexare per 10 s per risospendere il pellet.
  12. Digest in bagnomaria a 37 ° C per 1,5 h, su vortex per 10 s accuratamente ogni 10 min, fino a quando il tessuto viene digerito.
  13. Filtrare il campione attraverso un colino di cella µm 40 impilati uno sopra un tubo in polipropilene conico da 50 mL per rimuovere le cellule epiteliali e detriti del tessuto.
    Nota: Le cellule Stromal sono nel tubo in polipropilene conica 50 mL.
  14. Centrifugare la provetta di polipropilene 50 mL conica a 800 x g per 2,5 min a temperatura ambiente. Rimuovere delicatamente il surnatante con una pipetta da 1 mL.
  15. Risospendere il pellet in 10 mL di HESC isolamento Media.
  16. Centrifugare a 800 x g per 2,5 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e quindi risospendere le cellule in 6 di Media HESC e pipetta avanti e indietro per mescolare.
  17. Lentamente strato su 3 mL di media gradienti di densità per le cellule sedimento di separare i restanti cellule del sangue dalle cellule stromali, facendo attenzione a non mescolare gli strati.
  18. Centrifugare la provetta da 15 mL in polipropilene a 400 x g per 30 min a temperatura ambiente.
  19. Raccogliere 5 mL del surnatante in un nuovo tubo in polipropilene da 50 mL e aggiungere un ulteriore 5 mL HESC supporti per risospendere le cellule.
  20. Centrifugare a 800 x g per 2,5 min a temperatura ambiente, seguita dalla rimozione del surnatante e aggiunta di 6 mL HESC Media. Vortice il campione per 10 s e mescolare pipettando avanti e indietro 5 volte.
  21. Aliquotare e 10 µ l di cellule risospese in una microcentrifuga da 1,5 mL per il conteggio delle cellule.
  22. Aggiungere 10 µ l di 0,4% Trypan blu macchia per cella aliquota e mescolare con pipetta. Caricare 10 µ l di aliquota e contare le celle utilizzando un emocitometro.
  23. Le cellule in una boccetta appropriata dipenda dal conteggio totale delle cellule in 15ml HESC Media del piatto.
    1. Se il numero totale delle cellule è meno di 1 milione, piastra di tutte le celle nella beuta 25 cm con 6 mL di Media HESC. Se il numero totale delle cellule è più di 1 milione, piastra di tutte le celle in pallone da 75 cm con 15 mL di Media HESC.
  24. Coltura le cellule in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C per un minimo di 6 h per garantire adeguata delle cellule adesione e cambiare il supporto ai Media HESC.
  25. Coltura del HESC isolato in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C per un periodo di 3-5 giorni fino a quando le cellule formano un monostrato raggiungimento confluency di 80-90% in un pallone di placcato.
  26. Cambiare HESC Media ogni due giorni.
    1. Media di HESC caldo a bagnomaria a 37 ° C per 15-20 min.
    2. Aspirare la media dalla beuta e aggiungere fresco HESC Media al pallone (volume di lavoro: mL 8 o 16 mL per fiaschetta di 25 cm o 75 cm rispettivamente).
    3. Immergere la muffola in 5% CO2 incubatore a 37 ° C fino a raggiungere confluency di 80-90%.
  27. Una volta HESC diventano 80-90% confluenti, cellule di trasferimento da 25 cm a 75 cm boccetta o da una boccetta di 75 cm a tre boccette di 75 cm.
    Nota: HESC possono essere congelati e conservati per un successivo utilizzo in questo momento per future sperimentazioni.

4. il congelamento e lo scongelamento HESCs

  1. Aspirare la media dal pallone di 75 cm e aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA.
  2. Incubare in un incubatore di 5% CO2 per 2-3 min a 37 ° C fino a quando le cellule sloggiare dal pallone.
  3. Aggiungere 7 mL di HESC Media e mescolare bene di pipettaggio forward e reverse.
  4. Centrifugare a 800 x g per 2,5 min e aspirare il supernatante.
  5. Etichetta congelamento tubi con linea cellulare, data e numero di passaggio.
  6. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di media di congelamento.
  7. Aliquotare 1 mL di ri-sospensione dalle CSE umane ad ogni provetta e trasferire tubi per congelatore a-80 ° C.
  8. Trasferimento tubi in azoto liquido entro 24 ore.
    Nota: Se progettando di scongelare le cellule nel futuro immediato, conservare cellule congelate a-80 ° C per un mese.
  9. Per lo scongelamento il HESCs preriscaldare HESC Media per 20 min.
  10. Aggiungere 8 mL di preriscaldato HESC Media in bottiglia da 25 cm.
  11. Il tubo di congelamento di recuperare da-80 ° C o serbatoio di azoto liquido e immergere la provetta in bagnomaria a 37 ° C per 1-2 min a scongelare le cellule.
  12. Trasferire HESC scongelati in un pallone di 25 cm con Media HESC e incubare in un incubatore di 5% CO2 durante la notte a 37 ° C.
  13. Giorno successivo, cambiare il supporto HESC e attendere 2-3 giorni fino a quando HESC diventare confluenti e trasferire le cellule in 75 cm pallone come dettagliato di seguito nel protocollo n. 5.
    1. Media di HESC caldo a bagnomaria a 37 ° C per 15-20 min.
    2. Aspirare la media dalla beuta e aggiungere fresco HESC Media al pallone (volume di lavoro: mL 8 o 16 mL per fiaschetta di 25 cm o 75 cm rispettivamente).
    3. Immergere la muffola in 5% CO2 incubatore a 37 ° C fino a raggiungere confluency di 80-90%.

5. coltura di cellule stromali dell'endometrio umane (HESC)

Nota: Questa procedura Culturing viene eseguita in un ambiente sterile sotto una cappa di sicurezza biologica.

  1. Pre-riscaldare HESC Media a 37 ° C in un bagno d'acqua per 20-30 min.
  2. Aspirare la media dalla beuta e aggiungere acido di 0,25% tripsina etilendiamminotetraacetico (EDTA) (1 mL per beuta 25 cm o 2 mL per beuta di 75 cm).
  3. Incubare in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C per 2-3 minuti fino a quando le cellule sloggiare.
  4. Picchiettare delicatamente le pareti muffola per sloggiare le celle rimanenti. Aggiungere 7 mL di HESC Media e mescolare bene di pipettaggio forward e reverse.
  5. Dispensare la miscela delle cellule in un tubo conico in polipropilene da 50 mL e centrifugare a 800 x g per 2,5 min a temperatura ambiente.
  6. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in Media HESC.
    1. Aggiungere 15 mL per beuta 25 cm o 45mL per beuta 75 cm (15 mL ciascuno).
  7. Aggiungere 5 mL o 15 mL di sospensione cellulare a ciascuna beuta 25 cm o 75 cm, rispettivamente.
  8. Coltura del HESC isolato in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C per un periodo di 3-5 giorni fino a quando le cellule formano un monostrato raggiungimento confluency di 80-90% in un pallone di placcato.
  9. Cambiare HESC Media ogni due giorni.
    1. Media di HESC caldo a bagnomaria a 37 ° C per 15-20 min.
    2. Aspirare la media dalla beuta e aggiungere fresco HESC Media al pallone (volume di lavoro: mL 8 o 16 mL per fiaschetta di 25 cm o 75 cm rispettivamente).
    3. Immergere la muffola in 5% CO2 incubatore a 37 ° C fino a raggiungere confluency di 80-90%.

6. umana dell'endometrio Stromal Cell (HESC) placcatura e transfezione di siRNA

Nota: Questa procedura di trasfezione viene eseguita in un ambiente sterile sotto una cappa di sicurezza biologica.

  1. Aspirare HESC Media dal pallone di 75 cm e aggiungere 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA di 0,25%.
  2. Incubare in 5% CO2 incubatore a 37 ° C per 2-3 minuti fino a quando le cellule sloggiare.
  3. Una volta che le cellule sono sloggiate dalla beuta, aggiungere 7 mL di Media HESC e mescolare delicatamente pipettando forward e reverse 5 volte.
  4. Dispensare la miscela delle cellule in un tubo conico in polipropilene da 50 mL e centrifugare a 800 x g per 2,5 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di Media HESC.
    Nota: Se le cellule da più di una boccetta di placcatura, semplicemente aumentare il volume di Media HESC.
  5. Contare le celle utilizzando un emocitometro.
    1. Aliquotare e 10 µ l di cellule ri-sospensione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
    2. Aggiungere 10 µ l di 0,4% Trypan blu macchia al cellulare aliquotare e Miscelare pipettando in avanti e inversa.
  6. Cellule di5 piastra 0,8 x 10 per pozzetto in piastre da 6 pozzetti. Dopo due giorni, cellule dovrebbero essere confluenti di 60-70% per la transfezione ottima.
  7. Per ogni campione di transfezione di siRNA, preparare complessi utilizzando siRNA (60 nanomoles) di reagente di transfezione.
  8. Diluire 5 µ l di reagente di transfezione in 150 µ l di media liberi riduttori del siero e incubare per 5 min.
  9. Diluire 60 nanomoles di siRNA in 100 µ l di media liberi riduttori del siero e incubare per 5 min.
  10. Dopo 5 minuti, combinare siRNA diluito con soluzione di reagente di transfezione diluito e mescolare delicatamente pipettando in avanti e retromarcia 5 volte.
    Nota: Se uno o più siRNA in pozzi multipli di trasfezione, preparare mix master in 10 mL provette di polistirene.
  11. Incubare complessi di reagente di transfezione di siRNA per 5 min a temperatura ambiente.
  12. Durante questa incubazione, aggiungere 1 mL di cambiamento Media ad ogni pozzetto.
  13. Dopo 5 min di incubazione, centrifugare le provette a 500 x g per 2 minuti raccogliere la soluzione e aggiungere il 250 µ l di complessi di reagente di transfezione di siRNA a ciascuno contenente ben celle e media.
  14. Mescolare delicatamente a dondolo e incubare le cellule a 37° C in un incubatore di 5% CO2 per 5 h.
  15. Dopo 5 h, è necessario cambiare il supporto ai Media HESC.
  16. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore a CO2 5% per 2 giorni in preparazione per un test di decidualizzazione in vitro .

7. in Vitro decidualizzazione Assay

Nota: Questo test viene eseguito in un ambiente sterile sotto una cappa di sicurezza biologica.

  1. Preparare il supporto EPC prima di iniziare il trattamento in vitro decidualizzazione come descritto in Camden et al. 3 (Vedi 1.6).
  2. Aspirare i media dalla post-48 ora trasfettata linea di HESC incubata dal passaggio 6.16.
  3. Aggiungere 2 mL di EPC Media in ciascun pozzetto.
    Nota: come un controllo, lascia una serie di celle non trattata con EPC Media. Invece, aggiungere 2 mL di HESC Media dei pozzetti di controllo.
  4. Incubare le cellule in 5% CO2 incubatore a 37 ° C per 6 giorni.
    1. Modificare il supporto di EPC ogni 48 ore.
      1. Caldo e preparare supporti EPC in bagnomaria a 37 ° C per 15-20 min.
      2. Aspirare la media dal pozzo e aggiungere fresco EPC Media.
      3. Inserire nuovamente la piastra 5% CO2 incubatore a 37 ° C.
  5. Dopo il sesto giorno, analizzare l'entità della decidualizzazione cellule stromali via ELISA e qRT-PCR (come descritto di seguito).

8. validazione di decidualizzazione In Vitro utilizzando la PCR Real Time quantitativa (qRT-PCR)

Nota: qRT-PCR è completata come precedentemente descritto nella Kommagani et al.10.

  1. Isolare il RNA totale da HESC che utilizzano il protocollo da un kit di isolamento del RNA disponibile in commercio.
    1. Analizzare la quantità di RNA e la purezza (un /A260280) utilizzando un NanoDrop o metodologia simile come descritto in Garcia-Elias et al15.
  2. Sintesi di cDNA da 1 µ g di RNA totale attraverso un protocollo di kit di trascrizione inversa commercialmente disponibili.
  3. Eseguire una reazione di qRT-PCR come descritto in un protocollo di kit disponibili in commercio qRT-PCR.
    1. Eseguire la reazione utilizzando un commercialmente disponibile Real-Time PCR Master Mix e gene specifiche sonde insieme ai controlli di sistema interno (18s, PRLe IGFBP1).

9. convalida di decidualizzazione In Vitro utilizzando ELISA

  1. Quantificare i livelli di prolattina secreti dal supporto di coltura del tessuto utilizzando un kit di prolattina ELISA disponibile in commercio.

10. convalida di decidualizzazione In Vitro utilizzando falloidina macchiatura.

  1. Inserire vetrini coprioggetto sterili in ciascun pozzetto di una piastra ben 12.
  2. Ripetere i passaggi da 6.1-6.5.
  3. Cellule di5 piastra 0,8 x 10 per pozzetto di una piastra ben 12.
  4. Incubare le cellule in 5% CO2 incubatore a 37 ° C per 2 giorni.
  5. Aspirare i media.
  6. Ripetere i passaggi da 7.3-7.4.
  7. Fissare le cellule in paraformaldeide al 4% (PFA) in tampone fosfato salino (PBS) a temperatura ambiente per 30 min.
  8. Aspirare la soluzione di fissazione e lavare 3 volte con 1 mL di PBS per 5 minuti ciascuno.
  9. Aggiungere 0,1% tensioattivi non ionici polietilenglicole tert-octyl fenil etere in PBS per 5 min per le celle fisse per aumentare la permeabilità.
  10. Lavare 3 volte con 1 mL di PBS per 5 minuti ciascuno.
  11. Aggiungere 100 µ l di soluzione di falloidina per vetrino coprioggetto e incubare a temperatura ambiente per 90 min.
    1. Preparazione della diluizione 1: 100 in PBS utilizzando una soluzione di riserva falloidina in 1 unità per 5 µ l.
  12. Lavare 3 volte con 1 mL di PBS per 5 minuti ciascuno.
  13. Montare i vetrini con mezzo di montaggio contenente 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
  14. Osservare le cellule utilizzando un microscopio confocale.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Decidualizzazione HESC cultura

A seguito di isolamento, cellule stromali dell'endometrio umane sono state coltivate ad una formazione di monostrato con confluency di 80-90% e indotta per in vitro decidualizzazione trattando con 10 nM E2, 1 µM MPA e 50 µM cAMP (EPC). Cambiamenti morfologici associati in vitro decidualizzazione sono stati visualizzati in Figura 1A. A...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il ciclo mestruale femminile riproduttivo è caratterizzato da un aumento nei livelli di progesterone durante la fase luteale, quindi inducendo la decidualizzazione dell'ESC in tondo, epiteliale-come le cellule secretive3,8. L'iniziazione di decidualizzazione è specie dipendenti. In esseri umani, decidualizzazione si verifica spontaneamente al momento l'aumento della concentrazione del progesterone, mentre topi richiedono blastocisti presenza10

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è sostenuto da finanziamenti da National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) grant (R00 HD080742) e Start-up Washington University School of Medicine fondi a R.K. Vorremmo ringraziare la clinica di fertilità Washington University per fornire i campioni di biopsia dell'endometrio.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Opti-MEM I (1X) Siero ridotto MediumGibco31985-070Per terreni di decidualizzazione
DMEM / F12 (1:1) (1X)Gibco11330-032
Trypan Blue Stain (0,4%)Gibco15250-061Per la conta cellulare
PureLink RNA Mini KitInvitrogen12183018APer l'isolamento/purificazione dell'RNA
TaqMan 2X Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
Kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacitàApplied Biosystems4374967
Controllo endogeno eucariotico 18S rRNALife Technologies4319413EPer il controllo interno qPCR
Saggio di espressione genica TaqMan Sonda per prolattinaApplied Biosystems4331182Per il controllo interno qPCR
Espressione genica TaqMan Sonda IGFBP1Applied Biosystems4331182Per il controllo interno qPCR
Reagente Falloidina-iFluor 488 - CytoPainterAbcamab176753
Kit ELISA per prolattina umanaInvitrogenEHIAPRL
16% ParaformaldeideAlfa Aesar30525-89-4
Lipofectamina fissativa RNAiMAXInvitrogen13778150Reagente di trasfezione
Reagente antisbiadimento ProLong Gold con DAPIInvitrogenP36935Per montaggio
0,25% Tripsina-EDTA (1X)Gibco25200-056
Penicillina StreptomicinaGibco15140-122
Siero fetale bovino spogliato al carboneSigmaF6765-500ML
Bicarbonato di sodio (7,5%)Gibco25080-094
Ficoll-Paque PLUS ReagenteFisher Scientific45001749
Collagenasi da Clostridium histolyticumSigmaC0130-1G
Desossiribonucleasi I da pancreas bovinoSigmaDN25-100MG
Medrossiprogesterone 17-acetatoSigmaM1629-1GPer EPC Media
EstradioloSigmaE1024-1Gper EPC Media
cAMPSigmaA6885-100MGPer EPC Media
Forbici per punto dritto fineStrumenti di scienzafine 15396-00
TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 ProbeApplied Biosystems4351372
Siero fetale bovino, inattivato a caldoGibco10-082-147
Antibiotico-antimicoticoThermo Scientifico15240062
Hank' s Soluzione salina bilanciata Corning21-021-cv
50 mL polipropilene conico Tubo FalconCorning352098
Dumont #5/45 PinzeFine Science Tools11251-35
100 x 15 mm Piastra di Petri in vetroVWR75845-546
Filtro cellulare da 40 micronMidsci229481
Isotemp 215 Bagno d'acquaFisher ScientificFS-215
Centrifuga LSE Corning6755
Umano NCOA2 siRNA DharmaconL-020159-00Sonda qPCR specifica per gene
Incubatore a CO2 Steri-cycle i160 Thermo Scientific51030301
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000Per la quantificazione dell'RNA
Soluzione salina tamponata con fosfatoFisher Scientific 50146771
Pallone per coltura cellulare a collo inclinato da 75 cmCorning430641U
Piastra per coltura cellulare non pirogena a 6 pozzettiCorning3506
Pipet Controller UltraCorning4099
PhotoshopAdobe19.0.1.334
Pallone per coltura cellulare a collo inclinato da 25 cmCorning7200876
Triton X-100SigmaX100-1L
15 mL provetta conica in polipropilene FalconCorning352099
Siringa da 10 mLBD302995
1300 Serie A2 Cappa di sicurezza biologicaThermo Scientific1377
accuspin Centrifuga Micro17Fisher Scientific13100675
7500 Fast sistema di PCR in tempo realeBiosystems applicata3052632
EVOS FL Microscopio a immunofluorescenza LifeTechnologies01414-155G-291
Leica Microscopio a luce invertitaLeicaDMi1
IllrustratorAdobe22.0.1.253
Fogli di calcolo Excel Microsoft2016
Deckglaser Occhiali da copertura da 18 mmNeuVitroGG-18
Reichert Bright-Line HemacytometerSigmaZ359629-1EA
2-mercaptoetanoloFisher BioreagentsBP176-100Per tampone di lisi dell'RNA
1,2mL Fiala criogenica in polipropilene filettata esternaCorning430658Per il congelamento delle cellule HESC 
Dimetil solfossido (DMSO)SigmaD2650-100mLPer terreni di congelamento

Riferimenti

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