Una nuova tecnica di sutura Tenorrhaphy con innesto di collagene ingegnerizzato per riparare grandi difetti tendinei

Sommario

In questo articolo, presentiamo un protocollo in vitro e in situ per riparare uno spazio tendineo fino a 1,5 cm riempiendolo con innesto di collagene ingegnerizzato. Questo è stato eseguito sviluppando una tecnica di sutura modificata per prendere il carico meccanico fino a quando l'innesto matura nel tessuto ospite.

Abstract

La gestione chirurgica di grandi difetti tendinei con innesti tendinei è impegnativa, in quanto vi è un numero finito di siti in cui i donatori possono essere prontamente identificati e utilizzati. Attualmente, questa lacuna è colmata con innesti tendinei auto-, allo-, xeno-, o artificiali, ma i metodi clinici per proteggerli non sono necessariamente traducibili agli animali a causa della scala. Al fine di valutare nuovi biomateriali o studiare un innesto tendineo costituito da collagene di tipo 1, abbiamo sviluppato una tecnica di sutura modificata per aiutare a mantenere il tendine ingegnerizzato in allineamento con le estremità del tendine. Le proprietà meccaniche di questi innesti sono inferiori al tendine nativo. Per incorporare il tendine ingegnerizzato in modelli clinicamente rilevanti di riparazione caricata, è stata adottata una strategia per scaricare l'innesto tendineo ingegnerizzato e consentire la maturazione e l'integrazione del tendine ingegnerizzato in vivo fino a quando non si è formato un neo-tendine meccanicamente sano. Descriviamo questa tecnica utilizzando l'incorporazione del costrutto tendineo ingegnerizzato del tessuto di collagene di tipo 1.

Introduzione

La rottura del tendine può verificarsi a causa di fattori estrinseci come lacerazioni traumatiche o carico eccessivo del tendine. A causa delle forze di trazione esterne poste su una riparazione del tendine, si forma inevitabilmente un divario con la maggior parte delle tecniche di riparazione dei tendini. Attualmente, i difetti /lacune tendinee sono riempiti con innesti auto-, allo-, xeno- o artificiali, ma la loro disponibilità è limitata e il sito donatore è una fonte di morbilità.

L'approccio di ingegneria tissutale per fabbricare l'innesto di tendine da un polimero naturale come il collagene ha il vantaggio distintivo di essere biocompatibile e può fornire componenti vitali della matrice extracellulare (ECM) che facilitano l'integrazione cellulare. Tuttavia, a causa della mancanza di allineamento fibrillare, le proprietà meccaniche del tendine ingegnerizzato (ET) sono inferiori al tendine nativo. Per aumentare le proprietà meccaniche del collagene più debole, sono stati utilizzati molti metodi, come la reticolazione fisica sotto vuoto, le radiazioni UV e i trattamenti deidrotermici¹. Inoltre, attraverso il cross-linking chimico con riboflavina, metodi enzimatici e non enzimatici hanno aumentato la densità del collagene e il modulo di Young del collagene in vitro^2,3. Tuttavia, aggiungendo agenti reticolanti, la biocompatibilità del collagene è compromessa, poiché gli studi hanno dimostrato un'alterazione del 33% delle proprietà meccaniche e una perdita del 40% della vitalità cellulare^3,4,5. L'accumulo graduale di allineamento e resistenza meccanica può essere ottenuto attraverso il carico ciclico⁶; tuttavia, questo può essere acquisito in modo efficiente in vivo⁷.

Affinché ET si integri in vivo e acquisisca forza senza la necessità di alterazioni chimiche, un approccio sarebbe quello di utilizzare una tecnica di sutura stabilizzante per mantenere il costrutto più debole in posizione. La maggior parte delle riparazioni dei tendini si basa sul design della sutura per tenere insieme le estremità dei tendini; quindi la modifica di queste tecniche esistenti potrebbe fornire una soluzione logica^8,9.

Fino al 1980, le riparazioni a 2 fili erano ampiamente utilizzate, ma la letteratura chirurgica recente descrive l'uso di 4 fili, 6 fili o anche 8 fili in riparazione^10,11. Nel 1985, Savage descrisse tecniche di sutura a 6 filamenti con 6 punti di ancoraggio, ed era significativamente più forte della tecnica di sutura Bunnell che utilizza 4 fili ¹². Inoltre, le riparazioni a 8 fili sono il 43% più forti di altri fili nei modelli a cadavere e in situ, ma queste riparazioni non sono ampiamente praticate in quanto diventa tecnicamente difficile riprodurre accuratamente le riparazioni^13,14,15,16. Pertanto, un numero maggiore di fili di sutura del nucleo si riferisce a un aumento proporzionale delle proprietà biomeccaniche del tendine riparato. Tuttavia, c'è una perdita di vitalità cellulare intorno ai punti di sutura e il trauma da sutura eccessiva può essere a scapito del tendine, che può compromettere la guarigione del tendine¹⁷. Le tecniche di sutura dovrebbero fornire una forte riparazione geometrica equilibrata e relativamente anelastica per ridurre al minimo il gap del tendine dopo la riparazione. Inoltre, la posizione della sutura e dei suoi nodi devono essere posizionati strategicamente in modo che non interferiscano con lo scivolamento, l'afflusso di sangue e la guarigione fino a quando non è stata ottenuta una forza adeguata^10,18.

Per stabilire la fattibilità di fissare l'innesto ET più debole o altro materiale di innesto tra il tendine rotto, abbiamo sviluppato una nuova tecnica di sutura in grado di scaricare l'innesto in modo che possa maturare e integrarsi gradualmente nel tessuto ospite in vivo.

Protocollo

NOTA: La progettazione dell'esperimento e l'approvazione etica sono state ottenute dall'UCL Institutional Review Board (IRB). Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo il regolamento del Ministero degli Interni e le linee guida degli animali (procedura scientifica) Act 1986 con la legislazione rivista della direttiva europea 2010/63 / UE (2013). I conigli sono stati ispezionati da un veterinario nominato (NVS) periodicamente e due volte in un giorno da un funzionario per la cura e il benessere degli animali (NACWO) (secondo le linee guida e i regolamenti del Ministero degli Interni). Non hanno mostrato alcun segno di dolore fino a quando non sono stati eutanasizzati.

1. Preparazione dell'innesto di tendine ingegnerizzato tissutale (ET)

1. Per fabbricare l'idrogel di collagene, aggiungere 4 mL di soluzione di collagene monomerico di tipo 1 della coda di ratto (2,15 mg / mL in acido acetico allo 0,6% con 0,2% p / v di proteine totali) e 500 μL di 10x Minimal Essential Medium. Neutralizzare questo titolando contro idrossido di sodio 5 M e 1 M e aggiungere 500 μL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
2. Versare 5 mL di questa soluzione in uno stampo metallico rettangolare costruito su misura (33 mm × 22 mm × 10 mm, peso 120 g) (Figura 1). Tenere lo stampo in un incubatore a CO₂ a 37 °C e 5% CO₂ per 15 minuti per consentire l'assemblaggio della matrice¹⁹.

2. Fabbricazione dell'innesto

1. Dopo la polimerizzazione, rimuovere l'idrogel di collagene dallo stampo e posizionarlo in un gruppo di compressione plastica standard (Figura 2A)¹⁹.
2. Posizionare l'idrogel di collagene tra due fogli di rete di nylon da 50 μm e applicare un carico statico di 120 g (superficie totale 7,4 cm², che è una pressione equivalente a 1,6 kPa) per 5 minuti per rimuovere il liquido interstiziale dall'idrogel (Figura 2A). Utilizzare quattro strati di carta da filtro per assorbire il fluido scaricato dagli idrogel.
3. Utilizzare quattro strati di gel compressi arrotolati uno sopra l'altro (Figura 2B) e tagliati in segmenti di 15 mm (Figura 2C) per fabbricare l'ET.
   NOTA: negli esperimenti sono stati utilizzati conigli maschi bianchi della Nuova Zelanda di età compresa tra 16 e 25 settimane.
4. Sedare gli animali con una dose intramuscolare (i.m.) di Hypnorm (0,3 mg/mL) ed eutanasiare somministrando un sovradosaggio di pentobarbitone.
5. Subito dopo l'eutanasia, tagliare i capelli su entrambe le zampe posteriori. Quindi, con una lama chirurgica di dimensioni 20, eseguire un'incisione di 9 cm attorno all'area tibiofibulare inferiore per esporre il tendine tibiale posteriore (TP).
6. Con la stessa lama chirurgica di dimensioni, asportare i tendini TP lapini con una lunghezza media di 70 mm e mantenere umidi in PBS durante il processo sperimentale per evitare l'essiccazione.

3. Sviluppato una nuova tecnica Tenorrhaphy

NOTA: Le suture (vedi Tabella dei Materiali)sono inassorbibili e costituite da uno stereoisomero cristallino isotattico di polipropilene, che è una poliolefina lineare sintetica. Le suture ad incastro del nucleo erano costituite principalmente da 3-0 e le suture periferiche erano 6-0. Queste erano le due principali suture utilizzate in tutti gli esperimenti.

1. Con una lama chirurgica, tagliare il tendine TP nel punto medio. Asportare un segmento di 15 mm del tendine dal centro del tendine e sostituirlo con l'innesto di collagene ET (Figura 2D). Interbloccare la sutura 3-0 prossimalmente lontano dalle estremità del tendine nativo (Figura 3A).
2. Passare le suture del nucleo 3-0 sopra l'intera lunghezza dell'innesto e interbloccare distalmente lontano dall'estremità tagliata.
3. Fissare entrambe le estremità dell'ET al tendine nativo con 6-0 e suture continue in esecuzione intorno alla periferia accoppiando due estremità tendinee (Figura 3B). Questo viene fatto in modo che l'innesto possa essere spostato facilmente sulla sutura ponendo tensione sul tendine nativo²⁰.
4. Dopo aver fissato la sutura come descritto sopra, assicurarsi manualmente che la tensione sulle suture sia appropriata e che non vi sia flaccidità nella totalità della sutura.

Risultati

Abbiamo usato innesti di collagene fabbricati con collagene di tipo I, poiché questa è la proteina predominante che si trova nel tendine. Costituisce quasi il 95% del collagene totale nel tendine; quindi, il collagene ha mostrato tutte le proprietà ideali per imitare il tendine in vivo^21,22.

In questo studio, il collagene di tipo I utilizzato è stato estratto da...

Discussione

In questo studio, gli innesti di collagene di tipo I ingegnerizzati tissutale sono stati scelti come innesto tendineo perché il collagene è un polimero naturale e utilizzato come biomateriale per varie applicazioni di ingegneria tissutale^27,28_. Inoltre, il collagene costituisce il 60% della massa secca del tendine, di cui il 95% è di collagene di tipo ^{1 21,29,30,}

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Coda di ratto tipo 1 Collagene	First Link, Birmingham, Regno Unito	60-30-810
suture in prolene 6-0	Ethicon Ltd, Edimburgo, Regno Unito
suture in prolene 3-0	Ethicon Ltd, Edimburgo, Regno Unito	D8911
Carta da filtro Whatman	SIGMA-ALDRICH
Gibco  DMEM, glicemia alta	Thermo Fisher Scientific
Rete di nylon	Plastok (Reti e filtrazione) Ltd.	Na

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