Articolo metodologico

Ex Vivo Calcio Imaging per visualizzare le risposte del cervello alla segnalazione endocrina in Drosophila

DOI:

10.3791/57701

⸱

2 giugno 2018

 , 
1Division of Biological Science, Graduate School of Science, Nagoya University, 2Department of Molecular Genetics, Institute of Life Science, Kurume University

In questo articolo

Sommario

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Questo articolo descrive un protocollo per l'ex vivo imaging del calcio del cervello di Drosophila . In questo metodo, composti naturali o sintetiche possono essere applicati il buffer per testare la loro capacità di attivare particolari neuroni nel cervello.

Abstract

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Organo per organo comunicazione mediante la segnalazione endocrina, ad esempio, dalla periferia al cervello, è essenziale per il mantenimento dell'omeostasi. Come un animale di modello per ricerca endocrina, Drosophila melanogaster, che dispone di sofisticati strumenti genetici e informazioni sul genoma, è sempre più utilizzato. Questo articolo viene descritto un metodo per l'imaging del calcio degli espianti del cervello di Drosophila . Questo metodo consente il rilevamento del segnale diretto di un ormone al cervello. È noto che molti ormoni peptidici agiscono attraverso i recettori accoppiati a proteine G (GPCR), cui attivazione provoca un aumento della concentrazione intracellulare di Ca2 +. Attivazione neurale anche eleva i livelli intracellulari di Ca2 + , da afflusso di Ca2 + e il rilascio di Ca2 + memorizzati nel reticolo endoplasmico (ER). Un sensore di calcio, GCaMP, può monitorare queste Ca2 + modifiche. In questo metodo, GCaMP è espresso nei neuroni di interesse, e il cervello larvale che esprimono GCaMP è dissecato e coltivato ex vivo. Il peptide di prova viene quindi applicato per l'espianto di cervello, e vengono rilevate le modifiche fluorescenti in GCaMP utilizzando un microscopio confocale di filatura disco equipaggiato con una camera CCD. Utilizzando questo metodo, qualsiasi molecola solubile in acqua possa essere testato, e vari eventi cellulari associati con attivazione neurale possono essere imaged utilizzando gli opportuni indicatori fluorescenti. Inoltre, modificando la camera imaging, questo metodo può essere utilizzato per l'immagine di altri organi di Drosophila o degli organi di altri animali.

Introduzione

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Comunicazione dell'organo--organo è una strategia evolutivamente conservata per il mantenimento dell'omeostasi per far fronte a cambiamenti ambientali. In esseri umani, una varietà di ormoni arereleased da ghiandole endocrine nella circolazione. Molti di questi ormoni come destinazione l'ipotalamo del cervello, che regola i processi metabolici e comportamenti fondamentali come l'alimentazione1,2. Molti ormoni sono stati scoperti utilizzando modelli mammiferi. Tuttavia, i meccanismi della loro azione, soprattutto le reti interorgan a cui essi partecipano, rimangono in gran parte poco chiari.

Drosophila melanogaster è emerso come un utile modello per lo studio della comunicazione dell'organo--organo. In insetti, molti processi fisiologici sono controllati dagli ormoni. I primi studi sulla crescita e metamorfosi di messa a fuoco utilizzato grossi insetti. In questi studi, la rimozione o il trapianto di organi specifici predisse l'esistenza Inter-dell'organo molecole di segnalazione; più tardi, ormone giovanile (JH), ormone protoracicotropo (PTTH) ed ecdisone erano biochimicamente purificata3,4,5. Una grande famiglia di peptidi segnalazione intercellulare è pensata per essere coinvolti in vari eventi fisiologici durante il ciclo di vita dell'insetto6,7. La maggior parte di questi peptidi agiscono su recettori accoppiati a proteine G (GPCR), anche se i GPCR specifici erano inizialmente difficili da identificare mediante approcci convenzionali. La pubblicazione dell'intero genoma della drosofila sequenza8 è stata la svolta che ha permesso l'identificazione di peptidi bioattivi di Drosophila basato su loro omologia a quelli trovati in altri insetti. Inoltre, i recettori per i peptidi diversi sono stati identificati da GPCR preveduto nel genoma usando analisi di associazione GPCR-ligando cell-cultura-based. Successivamente, analisi di espressione predetto le vie dell'organo--organo suscitate da questi peptidi e recettori. In particolare, molti dei ricevitori del peptide putativo sono espressi nel cervello, suggerendo che il cervello è un obiettivo importante di peptide ormoni9. Inoltre, gli strumenti genetici avanzati in Drosophila hanno contribuito all'identificazione di ruoli fisiologici di combinazioni peptide-GPCR. Ad esempio, i sistemi trascrizionale binari LexA e GAL4 abilitare gene atterramento o sovraespressione in maniera controllata spazialmente e temporalmente. Gal4, un fattore di trascrizione identificato in lievito, si lega a una specifica sequenza di cis-regolatori chiamata sequenza di attivazione a Monte (UAS). Nel sistema GAL4/UAS, la riga di driver fornisce tessuto-specifica o espressione GAL4 fase-specifici e la linea di risponditore trasporta UAS a Monte del gene di interesse o il costrutto all'espressione di shRNA in auto. LexA/LexAop sistema è basato su un meccanismo simile. Analisi fenotipiche di animali di GPCR-atterramento di peptide-atterramento e tessuto-specifico tessuto-specifici possono rivelare informazioni sulla modalità di segnalazione di peptide-GPCR e sito di azione. Tuttavia, le conclusioni che possono essere raggiunto esclusivamente da dati genetici sono limitate. D'altra parte, una volta che il bersaglio putativo di un ormone peptidico particolare viene ristretto a un tipo di tessuti o cellule, ex vivo calcio imaging in espianti di organo utilizzabile per delucidare la comunicazione dell'organo--organo mediata dalla segnalazione del peptide-GPCR. Al momento dell'attivazione di un GPCR accoppiati a Gq, concentrazione intracellulare di Ca2 + è aumentata a causa del rilascio di Ca2 + dal ER10. Nel cervello, attivazione neurale anche eleva i livelli di Ca2 + intracellulari. Tali aumenti di Ca2 + possono essere rilevati da un sensore di calcio, GCaMP, che subisce cambiamenti conformazionali in presenza di Ca2 + con conseguente emissione di fluorescenza11.

In questo articolo, viene descritto un metodo di imaging utilizzando il cervello di Drosophila espianti di calcio. Per testare la capacità di un peptide di attivare specifici neuroni, un peptide di prova viene applicato per l'espianto di cervello GCaMP-esprimendo, e cambiamenti di fluorescenza sono controllati mediante microscopia confocale. Il coinvolgimento dei GPCR viene confermato eseguendo la stessa analisi utilizzando un mutante cervello manca il GPCR. Questa combinazione di immagine e genetica fornisce informazioni precise sulla comunicazione dell'organo--organo di peptidi-GPCR. eventuali modifiche e applicazioni del presente protocollo inoltre sono discussi.

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Protocollo

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1. preparazione del cervello larvale espianti

  1. Prenotare una camera di imaging.
    Nota: La registrazione stabile richiede che i cervello espianti essere legati. Qui, una camera di imaging a basso costo, fatto a mano è usata nel Ca2 + sistema di imaging.
    1. Usando il forcipe, graffiare il basso al centro di un piatto di plastica cultura (35 x 10 mm) per creare un'ammaccatura per il ganglio ventrale del cervello larvale rendendo il montaggio più facile (passaggio 1.3, Figura 1).
    2. Con uno stuzzicadenti, mettere una piccola goccia di colla su entrambi i lati dell'ammaccatura e allegare un'asta di tungsteno (0,125 mm di diametro, 6-7 mm di lunghezza) per la colla.
    3. Con un piccolo pezzo di adesivo riutilizzabile pastoso, fare un muro circolare (10 mm di diametro e 3 mm di altezza) che circondano l'ammaccatura (Figura 1).
      Nota: Lo spazio all'interno della parete sarà successivamente riempito di tampone fosfato salino (PBS; 0,14 M NaCl, KCl, M 0,0027 0,01 M PO43 -, pH 7,4 ± 0.05 a 25 ° C).
  2. Preparazione degli animali
    Nota: Per l'imaging del calcio, un indicatore del calcio, GCaMP6s, è espresso nel tipo cella di interesse, che è comunemente ottenuto utilizzando combinazioni di GAL4 UAS-GCaMP6se tessuto-specifici. Per garantire che il segnale è mediato attraverso il recettore di candidato, GCaMP6s si esprime anche in un mutante difettoso nel ricevitore.
    1. Quando sono richiesti confronti sperimentali per i diversi genotipi come wild-type e mutanti, età larve test match per evitare variazioni di livello di espressione GCaMP6 e differenze fisiologiche a causa di fasi inerenti allo sviluppo.
    2. Tenere mosche parentale (30 mosche per ciascun sesso) in un flacone di coltura contenenti cibo standard volo per 8 h consentire la deposizione delle uova sulla superficie del cibo. Larve di cultura in massa nell'ambito di un ciclo luce-buio di 12 h a 25 ° C e 60-70% di umidità relativa.
  3. Dissezione del cervello larvale
    1. A 90-120 h dopo (AEL) la deposizione delle uova, le larve di raccogliere e lavarli almeno 3 volte con acqua distillata per rimuovere i residui di cibo aderente.
    2. Posto una larva su un vetro da orologio quadrato 1,5 pollici riempito con PBS freddo ghiaccio.
      Nota: I due passaggi successivi sono effettuati in questo vetro d'orologio sotto il microscopio per dissezione.
    3. Utilizzare pinze per afferrare delicatamente la parte centrale della larva. Utilizzare un'altra pinza per afferrare i ganci di bocca e tirare i ganci di bocca delicatamente per separare la parte anteriore della larva contenente il cervello dal resto del corpo.
      Nota: In alternativa, possono essere utilizzate forbici chirurgiche.
    4. Tenere la punta anteriore dal forcipe e girare la larva dentro e fuori. Rimuovere il tessuto estraneo attaccato al cervello, come i dischi immaginali, corpi grassi e anello della ghiandola. Separare delicatamente il cervello dall'apparato boccale.
    5. Applicare 200 µ l di PBS all'interno dell'anello composto l'adesivo riutilizzabile e mastice-come nella camera di imaging. Succhiare delicatamente il cervello sezionato con PBS in una pipetta Pasteur e poi trasferirlo nella camera di imaging.
  4. Impostazione del cervello nella camera di imaging
    1. Utilizzare pinze per afferrare le fibre muscolari che si estende dai gangli ventrali. Inserire delicatamente il cervello l'ammaccatura sotto il filo di tungsteno.
    2. Utilizzando un altro forcipe, tirare il filo di tungsteno leggermente fino a posizionare il cervello alla posizione corretta per l'imaging (Figura 1).

2. acquisizione di Ca2 + fluorescenza immagini

Nota: Espianti di cervello immersi in PBS sono Imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza equipaggiato con un 20x obiettivo di immersione in acqua (N.A. = 0.5). PBS non attiva le cellule del cervello. Se sono necessarie immagini asse z, l'obiettivo è montato con un motore piezoelettrico-attivata lente. Una testa confocal di filatura del disco viene utilizzata per migliorare la risoluzione di tempo. Per l'imaging di scarsa illuminazione, un elettrone moltiplicando charge coupled device fotocamera è montato sul microscopio. La formazione immagine di fluorescenza GCaMP6s (eccitazione/emissione: 488/509 nm) richiede un laser di 488 nm per l'eccitazione con un divisore di fascio dicroici e un filtro di emissione (ad es., 528 filtro passa-banda banda di ± 38 nm).

  1. Posizionare la camera imaging contenente l'espianto di cervello al microscopio.
  2. Abbassare la lente dell'obiettivo fino a che tocca il PBS. Sotto illuminazione in campo chiaro, posizionare il cervello e portare a fuoco. Passare a luce fluorescente e regolare la messa a fuoco sulle cellule GCaMP6s-labeled.
    Nota: La fluorescenza verde basale il GCaMP6s dovrebbe essere visibile.
  3. Avvia acquisizione a 250 ms/frame con una risoluzione di 512 × 512 pixel in modalità raffreddato ad acqua, utilizzando il software di acquisizione appropriato (ad es., µManager). Regolare il tempo di esposizione per ottenere i valori di fluorescenza all'interno della gamma dinamica della fotocamera CCD, ma non inferiori a 1000 (unità arbitrarie), con immagini a 16 bit (gamma dinamica 0-65.535).
    Nota: Un tempo di esposizione basso dovrebbe essere utilizzato per ridurre al minimo i foto-candeggio della GCaMP6s. Tempo di esposizione dovrebbe essere ottimizzata in ogni esperimento dipende i livelli di espressione di GCaMP6 e la sensibilità del sistema di rilevamento. E ' stato 100 ms nel nostro esperimento utilizzando dilp2 > GCaMP6s. Quando z-sezioni sono necessari per una data profondità imaging, diverse immagini di z-sezione possono essere acquisite a seconda gli intervalli di tempo e cornice di esposizione. Se la fotocamera dispone di sufficiente risoluzione spaziale, la dimensione binning (numero di registri sul chip che verrà essere cestinate in un pixel digitale) dovrebbe essere aumentata per ridurre il tempo di esposizione.
  4. Una volta determinati parametri di imaging, prendere le immagini per 1 min prima della somministrazione del peptide per rilevare l'intensità del segnale di linea di base (F0).
  5. Applicare il peptide di prova; per questo, sciogliere 100 µ l di soluzione di peptide in PBS e pipettare esso direttamente nella vasca larvale per produrre una concentrazione ottimale.
    Nota: La soluzione di peptide deve essere iniettata lentamente (ad es., flusso tariffa 20 µ l/s) nella soluzione vasca utilizzando una pipetta. Peptide sintetico estranei disciolti in PBS viene utilizzato come controllo negativo.
  6. Registrare l'emissione di GCaMP6s per pochi minuti.

3. analisi dei dati

Nota: Dati di Imaging sono analizzati non in linea con il ImageJ. Durante l'imaging time-lapse, pipettaggio induce il cervello larvale spostare. Di conseguenza, posizionali aberrazioni delle immagini seriale devono essere corretto prima dell'analisi. La correzione può essere eseguita utilizzando un plug-in, di ImageJ TurboReg come segue.

  1. Aprire il software di analisi e utilizzare il primo fotogramma (prima dell'applicazione del peptide) come immagine di riferimento.
  2. Selezionare plug- | Registrazione | TurboReg.
  3. Scegliere il file di immagine seriale come l' origine e l'immagine di riferimento come destinazione.
  4. Verifica Corpo rigido (parallelo spostamento e rotazione delle immagini) e preciso ("Veloce" è grossa ma veloce analisi invece) per il metodo di lavorazione e qualità, rispettivamente.
  5. Fare clic su Batch per avviare l'elaborazione di immagini.
  6. Selezionare più aree di interesse (ROI) utilizzando Analyze | Strumenti | Manager di ROI in ImageJ.
  7. Misurare l'intensità di pixel cliccando più | Multi misura | OK nella finestra Gestione ROI.
  8. Calcolare ΔF/F0 = (F - F0) / f0, dove F è l'intensità ROI al momento dello stimolo, e F0 è l'intensità a una finestra di tempo immediatamente prima di un determinato evento sperimentale (ad esempio, 30 fotogrammi precedenti la insorgenza di stimolo).
  9. Ripetere l'esperimento utilizzando campioni multipli del cervello, lo svolgimento di elaborazioni statistiche per ottenere la media e l'errore standard della media (SEM) in ogni momento.

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Risultati

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Usando questo protocollo, l'attivazione delle cellule cerebrali che producono insulina (IPCs) dall'ormone peptide, CCHa2, è stato esaminato. IPC del selvaggio-tipo cervello sono stati etichettati con GCaMP6s usando una combinazione di dilp2 -GAL412 (un regalo da Dr. Rulifson) e UAS-GCaMP6s13 (un regalo da Dr. Kim). Cervello larvale espianti sono stati trattati con un peptide sintetico di CCHa2, e la fluorescenza da GCaMP6s ...

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Discussione

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Il Ca2 + imaging metodo qui descritto è un sistema utile per testare la funzione degli ormoni nel cervello. In vivo, il cervello riceve gli ormoni dai vari organi endocrini. Inoltre, il cervello percepisce costantemente crescente di informazioni sensoriali, che provoca l'attivazione neuronale spontanea. Questo sistema ex vivo elimina tale rumore e produce un migliore rapporto segnale/rumore rispetto all'imaging in vivo . In questo sistema, le molecole possono essere testati singolarm...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da localizzativi per la ricerca scientifica (15K 07147, 17K 07419) da JSP (a Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), un Inamori Foundation Research Grant (a HI) e il programma del centro di utilizzo/ricerca congiunta per la medicina inerente allo sviluppo, in l'Istituto di embriologia molecolare e genetica, Università di Kumamoto (al HS). Ringraziamo il Dr. Azusa Kamikouchi e il signor Daichi Yamada per il loro aiuto nell'utilizzo del sistema di imaging.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Barra di tungstenoA-M systems, Sequim, WA, USA717000
Blu TackBostik, Parigi, Francia3049100adesivi riutilizzabili simili allo stucco Vetro dell'orologio
, quadrato, 1 5/8 inCarolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA742300
PBSTAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, GiapponeT900Sali tamponati fosfatati
CCHa2SCRUM Inc., Tokyo, GiapponePeptide sintetizzato con Custum
GhrerinPeptide institute Inc., Osaka, Giappone4372-s
NociceptinPeptide institute Inc., Osaka, Giappone4313-v
Axio Imager A2Carl Zeiss, Oberkochen, GermaniaAxio Imager A2microscopio a fluorescenza
Obiettivo W N-Achroplan 20x/0.5 M27Carl Zeiss, Oberkochen, Germania420957-9900-000obiettivo a immersione in acqua
P-725 Scanner obiettivo PIFOC con corsa lungaPhysik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GermaniaN/Amotore di lenti attivato piezoelettrico
Unità scanner confocale CSU-W1Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, GiapponeCSU-W1testa confocale a disco rotante
ImagEM C9100-13Hamamatsu Photonics, Sizuoka, GiapponeC9100-13Telecamera EM-CCD
OBIS 488 nm LS 60 mWCoherent, Santa Clara, CA, USA1178770 laser 488-nm
488/568/647 nm Yokogawa dicroico beamsplitterSemrock, Rochester, NY, USADi01-T405/488/568/647-13x15x0.5dicroico dicroico
528/38 nm Filtro passa-banda a banda singola BrightLineSemrock, Rochester, NY, USAFF01-528/ Filtro di emissione 38-25
&Micro; ResponsabileOpen Imaging, Inc.N/Ahttps://micro-manager.org
ImageJIstituti Nazionali di Sanità degli Stati UnitiN/Ahttps://imagej.nih.gov/ij/
TurboRegPhilippe Thé venaz, Biomediccal Imaging Group, Politecnico federale di Losannan/Ahttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/

Riferimenti

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