Articolo metodologico

Ex Vivo Calcio Imaging per visualizzare le risposte del cervello alla segnalazione endocrina in Drosophila

DOI:

10.3791/57701

2 giugno 2018

In questo articolo

Sommario

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Questo articolo descrive un protocollo per l'ex vivo imaging del calcio del cervello di Drosophila . In questo metodo, composti naturali o sintetiche possono essere applicati il buffer per testare la loro capacità di attivare particolari neuroni nel cervello.

Abstract

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Organo per organo comunicazione mediante la segnalazione endocrina, ad esempio, dalla periferia al cervello, è essenziale per il mantenimento dell'omeostasi. Come un animale di modello per ricerca endocrina, Drosophila melanogaster, che dispone di sofisticati strumenti genetici e informazioni sul genoma, è sempre più utilizzato. Questo articolo viene descritto un metodo per l'imaging del calcio degli espianti del cervello di Drosophila . Questo metodo consente il rilevamento del segnale diretto di un ormone al cervello. È noto che molti ormoni peptidici agiscono attraverso i recettori accoppiati a proteine G (GPCR), cui attivazione provoca un aumento della concentrazione intracellulare di Ca2 +. Attivazione neurale anche eleva i livelli intracellulari di Ca2 + , da afflusso di Ca2 + e il rilascio di Ca2 + memorizzati nel reticolo endoplasmico (ER). Un sensore di calcio, GCaMP, può monitorare queste Ca2 + modifiche. In questo metodo, GCaMP è espresso nei neuroni di interesse, e il cervello larvale che esprimono GCaMP è dissecato e coltivato ex vivo. Il peptide di prova viene quindi applicato per l'espianto di cervello, e vengono rilevate le modifiche fluorescenti in GCaMP utilizzando un microscopio confocale di filatura disco equipaggiato con una camera CCD. Utilizzando questo metodo, qualsiasi molecola solubile in acqua possa essere testato, e vari eventi cellulari associati con attivazione neurale possono essere imaged utilizzando gli opportuni indicatori fluorescenti. Inoltre, modificando la camera imaging, questo metodo può essere utilizzato per l'immagine di altri organi di Drosophila o degli organi di altri animali.

Introduzione

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Comunicazione dell'organo--organo è una strategia evolutivamente conservata per il mantenimento dell'omeostasi per far fronte a cambiamenti ambientali. In esseri umani, una varietà di ormoni arereleased da ghiandole endocrine nella circolazione. Molti di questi ormoni come destinazione l'ipotalamo del cervello, che regola i processi metabolici e comportamenti fondamentali come l'alimentazione1,2. Molti ormoni sono stati scoperti utilizzando modelli mammiferi. Tuttavia, i meccanismi della loro azione, soprattutto le reti interorgan a cui essi partecipano, rimangono in gran parte poco chiari.

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Protocollo

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1. preparazione del cervello larvale espianti

  1. Prenotare una camera di imaging.
    Nota: La registrazione stabile richiede che i cervello espianti essere legati. Qui, una camera di imaging a basso costo, fatto a mano è usata nel Ca2 + sistema di imaging.
    1. Usando il forcipe, graffiare il basso al centro di un piatto di plastica cultura (35 x 10 mm) per creare un'ammaccatura per il ganglio ventrale del cervello larvale rendendo il montaggio più facile (passaggio 1.3, Figura 1).
    2. Con uno stuzzicadenti, mettere una piccola goccia di colla su entrambi i lati dell'ammaccatura e allegare un'asta di tungsteno ....

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Risultati

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Usando questo protocollo, l'attivazione delle cellule cerebrali che producono insulina (IPCs) dall'ormone peptide, CCHa2, è stato esaminato. IPC del selvaggio-tipo cervello sono stati etichettati con GCaMP6s usando una combinazione di dilp2 -GAL412 (un regalo da Dr. Rulifson) e UAS-GCaMP6s13 (un regalo da Dr. Kim). Cervello larvale espianti sono stati trattati con un peptide sintetico di CCHa2, e la fluorescenza da GCaMP6s .......

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Discussione

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Il Ca2 + imaging metodo qui descritto è un sistema utile per testare la funzione degli ormoni nel cervello. In vivo, il cervello riceve gli ormoni dai vari organi endocrini. Inoltre, il cervello percepisce costantemente crescente di informazioni sensoriali, che provoca l'attivazione neuronale spontanea. Questo sistema ex vivo elimina tale rumore e produce un migliore rapporto segnale/rumore rispetto all'imaging in vivo . In questo sistema, le molecole possono essere testati singolarm.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da localizzativi per la ricerca scientifica (15K 07147, 17K 07419) da JSP (a Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), un Inamori Foundation Research Grant (a HI) e il programma del centro di utilizzo/ricerca congiunta per la medicina inerente allo sviluppo, in l'Istituto di embriologia molecolare e genetica, Università di Kumamoto (al HS). Ringraziamo il Dr. Azusa Kamikouchi e il signor Daichi Yamada per il loro aiuto nell'utilizzo del sistema di imaging.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Barra di tungstenoA-M systems, Sequim, WA, USA717000
Blu TackBostik, Parigi, Francia3049100adesivi riutilizzabili simili allo stucco Vetro dell'orologio
, quadrato, 1 5/8 inCarolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA742300
PBSTAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, GiapponeT900Sali tamponati fosfatati
CCHa2SCRUM Inc., Tokyo, GiapponePeptide sintetizzato con Custum
GhrerinPeptide institute Inc., Osaka, Giappone4372-s
NociceptinPeptide institute Inc., Osaka, Giappone4313-v
Axio Imager A2Carl Zeiss, Oberkochen, GermaniaAxio Imager A2microscopio a fluorescenza
Obiettivo W N-Achroplan 20x/0.5 M27Carl Zeiss, Oberkochen, Germania420957-9900-000obiettivo a immersione in acqua
P-725 Scanner obiettivo PIFOC con corsa lungaPhysik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, GermaniaN/Amotore di lenti attivato piezoelettrico
Unità scanner confocale CSU-W1Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, GiapponeCSU-W1testa confocale a disco rotante
ImagEM C9100-13Hamamatsu Photonics, Sizuoka, GiapponeC9100-13Telecamera EM-CCD
OBIS 488 nm LS 60 mWCoherent, Santa Clara, CA, USA1178770 laser 488-nm
488/568/647 nm Yokogawa dicroico beamsplitterSemrock, Rochester, NY, USADi01-T405/488/568/647-13x15x0.5dicroico dicroico
528/38 nm Filtro passa-banda a banda singola BrightLineSemrock, Rochester, NY, USAFF01-528/ Filtro di emissione 38-25
&Micro; ResponsabileOpen Imaging, Inc.N/Ahttps://micro-manager.org
ImageJIstituti Nazionali di Sanità degli Stati UnitiN/Ahttps://imagej.nih.gov/ij/
TurboRegPhilippe Thé venaz, Biomediccal Imaging Group, Politecnico federale di Losannan/Ahttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/

Riferimenti

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  1. Morton, G. J., Schwartz, M. W. Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism. Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).
  2. Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. Hormonal regulation of food intake. Physiological Reviews. 85 (4), 1131-11....

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Cervello di Drosophilaimaging ex vivosensore GCaMPmicroscopia confocaleormone peptidicosegnalazione GPCRattivazione neuraleespianto di cervello

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