Ex Vivo Calcio Imaging per visualizzare le risposte del cervello alla segnalazione endocrina in Drosophila

Sommario

Questo articolo descrive un protocollo per l'ex vivo imaging del calcio del cervello di Drosophila . In questo metodo, composti naturali o sintetiche possono essere applicati il buffer per testare la loro capacità di attivare particolari neuroni nel cervello.

Abstract

Organo per organo comunicazione mediante la segnalazione endocrina, ad esempio, dalla periferia al cervello, è essenziale per il mantenimento dell'omeostasi. Come un animale di modello per ricerca endocrina, Drosophila melanogaster, che dispone di sofisticati strumenti genetici e informazioni sul genoma, è sempre più utilizzato. Questo articolo viene descritto un metodo per l'imaging del calcio degli espianti del cervello di Drosophila . Questo metodo consente il rilevamento del segnale diretto di un ormone al cervello. È noto che molti ormoni peptidici agiscono attraverso i recettori accoppiati a proteine G (GPCR), cui attivazione provoca un aumento della concentrazione intracellulare di Ca^{2 +}. Attivazione neurale anche eleva i livelli intracellulari di Ca^{2 +} , da afflusso di Ca^{2 +} e il rilascio di Ca^{2 +} memorizzati nel reticolo endoplasmico (ER). Un sensore di calcio, GCaMP, può monitorare queste Ca^{2 +} modifiche. In questo metodo, GCaMP è espresso nei neuroni di interesse, e il cervello larvale che esprimono GCaMP è dissecato e coltivato ex vivo. Il peptide di prova viene quindi applicato per l'espianto di cervello, e vengono rilevate le modifiche fluorescenti in GCaMP utilizzando un microscopio confocale di filatura disco equipaggiato con una camera CCD. Utilizzando questo metodo, qualsiasi molecola solubile in acqua possa essere testato, e vari eventi cellulari associati con attivazione neurale possono essere imaged utilizzando gli opportuni indicatori fluorescenti. Inoltre, modificando la camera imaging, questo metodo può essere utilizzato per l'immagine di altri organi di Drosophila o degli organi di altri animali.

Introduzione

Comunicazione dell'organo--organo è una strategia evolutivamente conservata per il mantenimento dell'omeostasi per far fronte a cambiamenti ambientali. In esseri umani, una varietà di ormoni arereleased da ghiandole endocrine nella circolazione. Molti di questi ormoni come destinazione l'ipotalamo del cervello, che regola i processi metabolici e comportamenti fondamentali come l'alimentazione^1,2. Molti ormoni sono stati scoperti utilizzando modelli mammiferi. Tuttavia, i meccanismi della loro azione, soprattutto le reti interorgan a cui essi partecipano, rimangono in gran parte poco chiari.

Protocollo

1. preparazione del cervello larvale espianti

1. Prenotare una camera di imaging.
   Nota: La registrazione stabile richiede che i cervello espianti essere legati. Qui, una camera di imaging a basso costo, fatto a mano è usata nel Ca^{2 +} sistema di imaging.
   1. Usando il forcipe, graffiare il basso al centro di un piatto di plastica cultura (35 x 10 mm) per creare un'ammaccatura per il ganglio ventrale del cervello larvale rendendo il montaggio più facile (passaggio 1.3, Figura 1).
   2. Con uno stuzzicadenti, mettere una piccola goccia di colla su entrambi i lati dell'ammaccatura e allegare un'asta di tungsteno ....

Risultati

Usando questo protocollo, l'attivazione delle cellule cerebrali che producono insulina (IPCs) dall'ormone peptide, CCHa2, è stato esaminato. IPC del selvaggio-tipo cervello sono stati etichettati con GCaMP6s usando una combinazione di dilp2 -GAL4¹² (un regalo da Dr. Rulifson) e UAS-GCaMP6s¹³ (un regalo da Dr. Kim). Cervello larvale espianti sono stati trattati con un peptide sintetico di CCHa2, e la fluorescenza da GCaMP6s .......

Discussione

Il Ca^{2 +} imaging metodo qui descritto è un sistema utile per testare la funzione degli ormoni nel cervello. In vivo, il cervello riceve gli ormoni dai vari organi endocrini. Inoltre, il cervello percepisce costantemente crescente di informazioni sensoriali, che provoca l'attivazione neuronale spontanea. Questo sistema ex vivo elimina tale rumore e produce un migliore rapporto segnale/rumore rispetto all'imaging in vivo . In questo sistema, le molecole possono essere testati singolarm.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Barra di tungsteno	A-M systems, Sequim, WA, USA	717000
Blu Tack	Bostik, Parigi, Francia	3049100	adesivi riutilizzabili simili allo stucco Vetro dell'orologio
, quadrato, 1 5/8 in	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Giappone	T900	Sali tamponati fosfatati
CCHa2	SCRUM Inc., Tokyo, Giappone		Peptide sintetizzato con Custum
Ghrerin	Peptide institute Inc., Osaka, Giappone	4372-s
Nociceptin	Peptide institute Inc., Osaka, Giappone	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Germania	Axio Imager A2	microscopio a fluorescenza
Obiettivo W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Germania	420957-9900-000	obiettivo a immersione in acqua
P-725 Scanner obiettivo PIFOC con corsa lunga	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germania	N/A	motore di lenti attivato piezoelettrico
Unità scanner confocale CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Giappone	CSU-W1	testa confocale a disco rotante
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Giappone	C9100-13	Telecamera EM-CCD
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, USA		1178770 laser 488-nm
488/568/647 nm Yokogawa dicroico beamsplitter	Semrock, Rochester, NY, USA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	dicroico dicroico
528/38 nm Filtro passa-banda a banda singola BrightLine	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/ Filtro di emissione 38-25
&Micro; Responsabile	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org
ImageJ	Istituti Nazionali di Sanità degli Stati Uniti	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
TurboReg	Philippe Thé venaz, Biomediccal Imaging Group, Politecnico federale di Losanna	n/A	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/