Articolo metodologico

Analisi computazionale della linea germinale Caenorhabditis elegans di studiare la distribuzione dei Nuclei, le proteine ed il citoscheletro

DOI:

10.3791/57702

⸱

19 aprile 2018

 , 
1Development and Stem Cells Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University

In questo articolo

Sommario

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Presentiamo un metodo automatico per la ricostruzione tridimensionale della linea germinale Caenorhabditis elegans . Il nostro metodo determina il numero e la posizione di ogni nucleo all'interno del germline e la distribuzione di analisi germinale della proteina e la struttura del citoscheletro.

Abstract

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La linea germinale Caenorhabditis elegans (c. elegans) è usata per studiare i diversi processi biologicamente importanti tra cui dinamiche di sviluppo, apoptosi e cromosoma della cellula formativa. Mentre la linea germinale è un eccellente modello, l'analisi è spesso due dimensioni a causa del tempo e la manodopera necessaria per l'analisi tridimensionale. Principali letture in tali studi sono il numero/posizione dei nuclei e della distribuzione della proteina all'interno della linea germinale. Qui, presentiamo un metodo per eseguire l'analisi automatica della linea germinale usando microscopia confocale e approcci computazionali per determinare il numero e la posizione dei nuclei in ogni regione della linea germinale. Il nostro metodo analizza anche distribuzione di proteina di germline che consente l'esame tridimensionale dell'espressione proteica in differenti ambiti di provenienza genetici. Ulteriormente, il nostro studio mostra variazioni nell'architettura del citoscheletro in regioni distinte della linea germinale che può ospitare fino a specifiche esigenze di sviluppo spaziale. Infine, il nostro metodo consente un conteggio automatizzato dello sperma nella spermateca di ogni linea germinale. Presi insieme, il nostro metodo permette l'analisi fenotipica rapida e riproducibile della linea germinale di c. elegans .

Introduzione

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La conservazione delle vie con i mammiferi di segnalazione rende c. elegans un eccellente modello per studiare più processi biologici1,2. Nel nostro laboratorio, utilizziamo la linea germinale di c. elegans per studiare lo sviluppo delle cellule staminali, apoptosi e l'espressione genica. Mentre la linea germinale è una struttura tridimensionale, molti studi sono due dimensioni a causa della natura molto tempo e laborioso di analisi tridimensionale. È molto probabile che l'analisi bidimensionale può travisare in vivo gli eventi sulla linea germinale. L'ermafrodita adulto di c. elegans ha due braccia di germline, ognuno dei quali ospita una cellula somatica punta distale (DTC) che mantiene le cellule germinali distale in un stato indifferenziato3,4. Queste cellule germinali iniziano a differenziarsi come essi allontana il DTC, sfuggire la sua influenza e diventare ovociti e spermatozoi come raggiungono l'estremità prossimale della linea germinale. Durante questo processo, i nuclei delle cellule di germe subiscono la mitosi, prima di passare ai meiosi5,6. Produzione di spermatozoi è completata da stadio larvale 4 (L4) dello sviluppo, dopo di che gli ovociti sono prodotte durante l'età adulta. Gli spermatozoi vengono archiviati nella spermateca dove essi fertilizzare gli ovociti per generare embrioni.

Non ci sono più fattori genetici e ambientali che possono influenzare lo sviluppo di germline in c. elegans conseguente cambiamenti nel numero dei nuclei, il numero di fenomeni apoptotici, dinamiche del cromosoma e l'espressione della proteina e/o localizzazione7 ,8,9,10,11. L'analisi di questi eventi richiede l'identificazione di ogni fase di differenziazione basata sulla distribuzione e la morfologia nucleare. Per analizzare con precisione questi parametri manualmente con un campione di grandi dimensioni è laborioso e che richiede tempo. Per aggirare questi inconvenienti e per consentire la coerenza dell'analisi, abbiamo sviluppato un metodo automatizzato per l'esame tridimensionale della linea germinale per nuclei di conteggio, distribuzione di nuclei, espressione della proteina, c. elegans e del citoscheletro struttura. Combinando la microscopia confocale con rendering tridimensionale, abbiamo generato i parametri di dimensione e forma per l'identificazione di ogni fase di differenziazione delle cellule di germe. Inoltre, questo metodo consente di conteggio dei nuclei delle cellule di germe e sperma più segnando del cromosoma in ogni ovocita.

Una struttura fondamentale nella linea germinale è il citoscheletro, che fornisce stabilità al vano di germline, aids flusso citoplasmatico e protezione di germline nuclei12. Utilizzando il rendering computazionale, abbiamo eseguito la ricostruzione tridimensionale del citoscheletro germline ed abbiamo identificato caratteristiche distinte proteine citoscheletriche entro la linea germinale. Qui, descriviamo un protocollo passo-passo per illustrare come computazionale analisi combinata con confocale imaging consente analisi completa della linea germinale di c. elegans .

Proponiamo un metodo rapido per l'analisi tridimensionale di germline di c. elegans (Figura 1). Utilizzando analisi tridimensionale, è possibile studiare la distribuzione tridimensionale dei nuclei di germline (Figura 2 e Figura 3), automatizzato di conteggio delle cellule (Figura 2), ricostruzione del citoscheletro germinale ( Figura 3), distribuzione delle proteine (Figura 4) e segnando il numero di spermatozoi nella spermateca e cromosomi negli ovociti (Figura 5). Il metodo non solo consente il facile e precisa quantificazione della linea germinale, ma identifica fenotipi fisiologicamente rilevanti.

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Protocollo

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1. preparazione e allevamento della vite senza fine

Nota: Consultare la Tabella materiali per tutte le informazioni sul prodotto.

  1. OP50 Escherichia coli cultura: cultura OP50 batteri in brodo di Lisogenesi (LB) (tryptone di 1%, 0,5% lievito, 0.5% NaCl, pH 7,0) durante la notte a 37 ° C senza antibiotici.
  2. 400 µ l di OP50 batteri di cartilagini di accrescimento del nematode media (NGM) (1,5 g di NaCl, 8,5 g di agar, 1,25 g di peptone, 1 mL di 1 M CaCl2, 1 mL di colesterolo 5 mg/mL in etanolo, 1 mL di 1 M MgSO4 del seme e 25 mL di buffer di4 1m KPO) e asciugare all'aria i batteri per 48 h.
  3. Prendono vermi sulle piastre di NGM seminati e incubare a 15 ° C o 20 ° C.
    1. Per l'analisi della linea germinale ermafrodita adulta, prendono ben nutriti L4 vermi al prato batterico e incubare per una notte a 20 ° C.
    2. Per il punteggio numero di spermatozoi in ermafroditi, incubare L4 vermi a 20 ° C per 12 h fino a raggiungono i vermi la molt L4/adulto. Per sincronizzare i vermi sul palco di L4, preparare le uova con la scelta di vermi adulti con un sacco di uova in soluzione di candeggina (1 M NaOH e candeggina nel rapporto 1:1). Lasciare le uova si schiudono e scegli gli animali L4 per l'esperimento.
  4. Preparare vetrini da microscopio Teflon posizionando 25 µ l di soluzione di poli-L-lisina sulla diapositiva e diffondendo la soluzione, utilizzando un puntale. Dopo la rimozione di poli-L-lisina in eccesso con carta assorbente, lasciare i vetrini asciugare all'aria e incubare i vetrini a 65 ° C per 15-20 min.

2. Germline dissezione e colorazione6,13

  1. Spot 10 µ l di 0.01% Tetramisolo (anestetico) su un vetrino coprioggetti 22 mm × 22 e prendere i vermi adulti 1 giorno di vita in esso.
  2. Sezionare il verme alla coda come si diventa placato con una siringa (5 mL) e un ago (24 "x 1") e assicurarsi che la linea germinale non sia danneggiata.
    Nota: La dissezione deve essere effettuata prima che il worm diventa completamente paralizzato in modo che la pressione negativa nel verme e il movimento del verme aiutare l'espulsione della linea germinale. Per il punteggio dello sperma, necessario adottare precauzioni per non danneggiare la spermateca dall'ago durante la dissezione. Evitare di toccare la linea germinale con l'ago ad eccezione del punto di dissezione dopo la spermateca. Se c'è rottura nel vano di germline o qualsiasi scarico dalla linea germinale è osservato, la linea germinale non dovrebbe essere utilizzata per l'analisi.
  3. Porre il coprivetrino invertito su una diapositiva rivestita di poli-L-lisina, mantenendo la linea germinale dissecata sulla diapositiva.
  4. Rimuovere il liquido in eccesso sotto il vetrino coprioggetto inserendo una torre di carta in un angolo del vetrino coprioggetto, quindi posto il vetrino in azoto liquido per 1 min, rimuovere rapidamente il vetrino coprioggetto utilizzando un ago con il germlines sulla diapositiva.
  5. Trasferire i vetrini in metanolo-20 ° C per 30-60 s in una camera, quindi incubare per 30 minuti nella soluzione preparata di fissaggio (1x tamponato fosfato salino (PBS) contenente 0.08 M HEPES pH 6.9, 1,6 mM MgSO4, glicole etilenico 0,8 mM-bis(beta-aminoethyl etere)-N, N, N', N'-tetraacetico acido (EGTA) e 3,7% paraformaldeide) a temperatura ambiente.
  6. Lavare i vetrini inserendo in una camera contenente 1X PBS, pH 7.4 con 0.1% Tween-20 per 10 min. Ripetere questo passaggio una volta.
  7. Bloccare il germlines con 30 µ l di soluzione bloccante (30% di siero di capra preparato aggiungendo 900 µ l di siero di capra nel 1700 µ l di acqua distillata H2O e 300 µ l di PBS 1x 10) in una camera umida preparata ponendo il tovagliolo di carta bagnato in una scatola di plastica a temperatura ambiente per 30 min.
  8. Aggiungere 50 µ l di soluzione di anticorpo REC-8 preparata in siero di capra 30% in un rapporto di 1: 300 per ogni campione. Incubare per una notte a 4° C.
  9. Lavare i vetrini inserendo in una camera contenente 1X PBS con 0,1% Tween-20 per 10 min. Ripetere il passo una volta e togliere il liquido in eccesso mettendo un asciugamano di carta all'angolo della diapositiva.
  10. Preparare la soluzione di anticorpo secondario diluendo fluoroforo verde (lunghezza d'onda emissione nm 488) anticorpo secondario coniugato (1: 1000), falloidina (macchia di actina, 1: 4000) e DAPI (macchia di DNA, 1: 4000) in siero di capra normale del 30%.
  11. Aggiungere 50 µ l di soluzione di anticorpo secondario alla diapositiva.
  12. Incubare per 1 h a temperatura ambiente.
  13. Lavare i vetrini due volte mettendo in una camera contenente 1X PBS con 0,1% Tween-20 per 10 minuti togliere il liquido in eccesso.
  14. Aggiungere 30 µ l di reagente sulla diapositiva di fissaggio e adagiarvi un 12 mm2 x 1,5 µm coprioggetto e asciugare i vetrini a 4 ° C durante la notte.

3. microscopio confocale

  1. Accendere il microscopio confocale laser, scanner risonante e software di microscopio confocale. Porre i vetrini con germlines macchiato il portavetrini sopra l'obiettivo X 63.
  2. Individuare un germline, messa a fuoco sulla parte superiore della linea germinale e contrassegnarla utilizzando software di microscopio confocale. Allo stesso modo concentrarsi sulla parte inferiore della linea germinale e contrassegnarlo per stabilire lo spessore totale di germline.
  3. Immagine intera linea germinale definendo lo spessore di ogni fetta fino a 0,5 µm. contrassegnare la completa acquisizione di germline e inizio. 8 tempi di scansione ogni fetta e media dei valori per migliorare la qualità dell'immagine. Lo scanner risonante consentirà scansione veloce per evitare lo sbiancamento durante la formazione immagine. Se il microscopio non dispone di uno scanner di risonanza, ridurre il numero di scansioni a quattro per evitare lo sbiancamento.

4. post analisi dei Nuclei di Imaging numero e distribuzione

Nota: Fare riferimento complementare figura 1 per screenshot per gli strumenti software e pulsanti utilizzati.

  1. Importare l'immagine a Imaris 8.4.1 o versioni successive del software.
  2. Definire regione mitotica, zona di transizione, regione meiotica, regione dell'ovocita e spermateca della linea germinale individuando la morfologia nucleare in ogni regione.
  3. Utilizzare il pulsante di funzione della superficie (complementare figura 1A) del software per selezionare la regione di interesse.
  4. Annullare la procedura guidata Creazione automatica della superficie e disegnare manualmente l'area di interesse presso la prima e l'ultima fetta dell'immagine dallo stack tridimensionale.
  5. Fare clic su Crea superficie.
    Nota: È possibile che il software svilupperà automaticamente gli stack tra il primo e l'ultimo stack.
  6. Maschera tutti i canali tranne DAPI facendo clic sul pulsante maschera canale (Complementare figura 1B-C).
  7. Definire i parametri di dimensione nucleare utilizzando il pulsante di funzione spot (complementare figura 1A). Per la regione mitotica, definire un diametro di x-y di 2 µm, lasciando diametro Z non definito. Per la zona di transizione, definire un diametro di x-y di 2 µm e Z come 1,5 µm. (complementare figura 1).
    Nota: Risoluzione dei problemi i diametri seguendo le specifiche del microscopio e ingrandimento. Per il protocollo attuale, l'obiettivo utilizzato era 63 X e fornito un extra 1.70 volte ingrandimento durante la formazione immagine. Se si cambia l'obiettivo, per esempio 40 X, i diametri dovrebbero essere modificati di conseguenza. Risoluzione dei problemi deve essere eseguita con wildtype germlines per stabilire i parametri corretti. La regione mitotica di un braccio di germline di tipo selvaggio ha circa 250 nuclei. Il diametro deve essere modificato per ottenere questo valore. Utilizzare almeno 15 germlines per determinare il valore ottimale per il diametro. Un approccio simile dovrebbe essere usato per calibrare la zona di transizione (nuclei di 150-170) e la regione meiotica (nuclei di 600-700).
  8. Limitare il rilevamento dei punti definendo la soglia minima (complementare Figura 1E). Uso DAPI macchiato germlines wild-type per stabilire la soglia minima aumentando la soglia di minima resa tridimensionale, fino a quando il primo spot appare all'esterno la linea germinale.
  9. Salvare l'immagine e ottenere il numero di nuclei dalla tabella generata automaticamente dal software. Esportare le immagini come file TIF.

5. post analisi di Imaging per il punteggio dello sperma e il numero di cromosoma

  1. Eseguire il rendering tridimensionale selezionando la spermateca come la regione di interesse. Per rilevare ogni sperma, definire il diametro del punto tra 0,75 - 1,0 µm per X e Y-asse, mentre Z diametro rimane indefinito. Utilizzare il pulsante di funzione di macchie come illustrato nella Figura 1 supplementare.
  2. Sottrarre lo sfondo selezionando sfondo sottrarre casella e utilizzando i valori di correzione del fondo calcolati dal software (complementare figura 1).
    Nota: Software di Imaris sceglie punti ad alta intensità in primo luogo, quindi l'effetto di sfondo è minima, purché ci sia differenza significativa tra la regione di interesse e lo sfondo. Un secondo metodo è di definire manualmente la correzione del fondo, eventualmente valori può essere dato per lo sfondo. Correzione manuale sfondo sarà opportuno se l'intensità di campioni indipendenti ha bisogno di confronto.
  3. Regolare la soglia di rendering tridimensionale per rilevare tutto lo sperma DAPI macchiato nella spermateca (complementare Figura 1E).
  4. Per il conteggio del cromosoma, definire il diametro del punto < 0,75 µm per X e Y-asse prima di sviluppare modelli tridimensionali.
  5. Salvare l'immagine e l'esportazione come file TIF.

6. pubblicare analisi di Imaging per la ricostruzione del citoscheletro della linea germinale

  1. Identificare la regione di interesse sulla linea germinale e mascherare tutti i canali tranne falloidina facendo clic sul pulsante maschera canali .
  2. Definire un particolare della superficie di 0.25 µm utilizzando il tasto di funzione della superficie (complementare figura 1).
    Nota: Questo significa che ogni 0,25 µm verranno sottoposti a rendering in modelli tridimensionali. Particolare della superficie può essere costante per qualsiasi regione della linea germinale in cui verrà creato un modello di superficie tridimensionale per ogni 0,25 µm. Tuttavia, per la regione di ovocita, dettagli della superficie possono essere aumentata a 0,35 - 0,5 µm dovuta alla presenza di fibre di actina ben definito in questa regione.
  3. Sottrarre lo sfondo selezionando sfondo sottrarre casella e utilizzando i valori di correzione del fondo calcolati dal software (complementare figura 1).
  4. Regolare la soglia di rendering tridimensionale a seconda della struttura che richiedono analisi (complementare Figura 1E).
  5. Salvare l'immagine tridimensionale sviluppata ed esportare come un file TIF.

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Risultati

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Figura 1 indica il tempo necessario per l'analisi tridimensionale di germline. L4 ermafroditi incubate a 20 ° C sono stati sezionati per isolare germlines e macchiati con DAPI, falloidina e anticorpi contro le proteine di germline. Germlines sono imaging usando la microscopia confocal. Microscopia confocale e colorazione richiede circa 24 h. analisi computazionale per la linea germinale completa richiede 10-15 min a contare il numero e la posizione dei nuclei...

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Discussione

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L'obiettivo del presente protocollo è quello di migliorare la precisione e ridurre il tempo necessario per l'analisi di germline. Dopo preparazione standard del germlines dissecata, un modello tridimensionale dei nuclei di germline è preparato dal rendering computazionale. Pur consentendo l'osservazione della distribuzione di nuclei di germline nello spazio, rendering tridimensionale calcola il numero dei nuclei alle regioni specifiche della linea germinale. L'aspetto critico del nostro metodo è accurata definizione dei ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Monash Microimaging per il loro supporto tecnico. Alcuni ceppi sono stati forniti dal centro Caenorhabditis genetica, che è finanziato dall'ufficio di NIH di programmi di ricerca dell'infrastruttura (P40 OD010440). Quest'opera è stata sostenuta da un Monash University biomedicina Discovery Fellowship, NHMRC progetto Grant (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) e veski fellowship di innovazione: VIF 23 a Roger Pocock.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
C. elegans ceppi: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?( q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III  Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
OP50 Escherichia coli batteriPiastre per
(NGM) Conigliofatto in casa
anti-REC-8 SDIX29470002
Alexa 488 anticorpo coniugato allevato in capraThermofisher ScientificA-21236
Colorante citoscheletrico falloidina Thermofisher ScientificA-12380
DAPI Thermofisher Scientific 62248
Poli-L-lisina Sigma AldrichP5899
Tetramisol Sigma AldrichP5899
MgSO4Sigma AldrichM7506
1M tampone HEPES, pH 7,4 Sigma AldrichG0887
10X PBS pH 7.4 Thermofisher ScientificAM9625
Tween-20 Sigma AldrichP1389
EGTASigma AldrichE3889
Soluzione di paraformaldeide al 37%Merck Millipore1040031000
Siero di capra normaleSigmaAldrich G9023
Reagente di fissaggio Fluoroshield Sigma AldrichF6182
EtanoloMilliporo 
MetanoloSigma Aldrich34860
20 gradi C & 25 gradi; CIncubator Microscopio ottico di qualsiasi marca
di qualsiasi marca
   Computer di qualsiasi marca (Leica, Zeiss)
equipaggiato con Imaris suit 8.4.1 o versione successiva, licenza completa per l'utilizzo del software e del software Matlab.Bitplane
Soluzione salina tamponata con fosfo, pH 7,4Vetrini per microscopio in teflon fatti in casa
 Tekdon   941-322-8288
terreni di crescita per nematodi fatti in casa policlonale 1009832511 Microscopio confocale

Riferimenti

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