Lo scopo di questo lavoro è di descrivere un protocollo per la creazione di un pratico grasso-acqua fantasma che possa essere personalizzato per produrre fantasmi con percentuali variabili di grasso e volumi.
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Articolo metodologico
Fantasmi di grasso-acqua per la convalida di risonanza magnetica: un protocollo flessibile e scalabile
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mentre al tessuto adiposo immagine vengono sviluppate nuove tecniche, metodi per convalidare tali protocolli stanno diventando sempre più importante. Fantasmi, repliche sperimentali di un tessuto o organo di interesse, fornire una soluzione a basso costo, flessibile. Tuttavia, senza accesso ad attrezzature costose e specializzate, costruzione stabili fantasmi con alte frazioni di grasso (ad es., > livelli 50% frazione grassa come quelli visti in tessuto adiposo marrone) può essere difficile dovuto la natura idrofobica dei lipidi. Questo lavoro presenta un protocollo dettagliato, a basso costo per la creazione di fantasmi di 5 x 100 mL con grasse frazioni di 0%, 25%, 50%, 75% e 100% utilizzando componenti facilmente accessibili (acqua distillata, agar, solubile in acqua e forniture di base del laboratorio (piastra, bicchieri, ecc.) tensioattivo, benzoato di sodio, agente di contrasto gadolinio-diethylenetriaminepentacetate (DTPA), olio di arachidi e tensioattivo solubile nell'olio). Il protocollo è stato progettato per essere flessibile; può essere utilizzato per creare fantasmi con diverse frazioni di grasso e una vasta gamma di volumi. Fantasmi creati con questa tecnica sono stati valutati nello studio di fattibilità che rispetto i valori di frazione grassa da imaging a risonanza magnetica di grasso-acqua per i valori di destinazione nei fantasmi costruiti. Questo studio ha prodotto un coefficiente di correlazione concordanza di 0,998 (intervallo di confidenza 95%: 0,972-1.00). In sintesi, questi studi dimostrano l'utilità dei fantasmi di grasso per la convalida di tessuto adiposo, tecniche di imaging in tutta una gamma di organi e tessuti clinicamente rilevanti.
Introduzione
Interesse nella quantificazione del tessuto adiposo e trigliceridi contenuti utilizzando modalità di imaging, come la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI), si estende in molti campi. Aree di ricerca includono l'indagine dei depositi di tessuto adiposo bianco e Bruno e deposito ectopico del lipido in organi e tessuti quali il fegato1, pancreas2e muscolo scheletrico3. Queste nuove tecniche per la quantificazione adiposi sono sviluppati, i metodi sono necessari per confermare che parametri di imaging sono validi per la ricerca e applicazioni cliniche.
Fantasmi, repliche sperimentali di un tessuto o organo, fornire uno strumento di basso costo, flessibile e controllato per sviluppare e validare imaging tecniche4. In particolare, i fantasmi possono essere costruiti per consistono di grasso e acqua in un rapporto o grasso frazione di volume (FF) paragonabile a quella del tessuto di interesse clinico. Clinicamente, i valori di FF in tessuti e organi possono variare ampiamente: FF in tessuto adiposo marrone cade tra il 29,7% e 93,9%5; il fegato medio FF in pazienti di steatosi è 18,1 ± 9,0%6; la FF del pancreas negli adulti a rischio per le gamme di diabete di tipo 2 tra 1,6% e 22,2%7; e in alcuni casi della malattia avanzata, pazienti con distrofia muscolare di Duchenne possono avere valori di FF di quasi il 90% in alcuni muscoli8.
Perché le molecole non polari quali i lipidi non si dissolvono bene in soluzioni composte da molecole polari come l'acqua, creando fantasmi stabili con un target alto FF rimane impegnativo. Per FF fino al 50%, molti metodi esistenti possono essere utilizzati per creare acqua grasso fantasmi9,10,11,12. Altri metodi che ottenere maggiore FFs in genere richiedono attrezzature costose come un omogeneizzatore o una cella ultrasonica disruptor13,14. Anche se queste tecniche forniscono una tabella di marcia per alti fantasmi di FF, vincoli di attrezzature e diverse quantità di dettagli sperimentali limitare gli sforzi per creare fantasmi acqua grasso riproducibile e robusto.
Sulla base di queste tecniche precedenti, abbiamo sviluppato un metodo per costruire fantasmi acqua grassa conveniente e stabile attraverso un valori di gamma personalizzabile di FF. Questo protocollo dettagli i passaggi necessari per fare 5 x 100 mL di grassi fantasmi con valori FF di 0%, 25%, 50%, 75% e 100% utilizzando una singola piastra. Può essere regolato facilmente per creare vari volumi (10-200 mL) e percentuale di grasso (da 0 a 100%). L'efficacia della tecnica fantasma è stata valutata in valori MRI FF di fattibilità Studio confrontando grasso-acqua ai valori obiettivo FF nei fantasmi costruiti.
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Protocollo
1. preparare le Workstation e i materiali
- Rispettare tutte le regole di sicurezza di laboratorio. Indossare guanti e occhiali di protezione. Leggi il foglio di dati materiale di sicurezza per ciascuno dei reagenti utilizzati e prendere le opportune precauzioni. Esaminare i materiali ed elenco delle attrezzature, procedure di manipolazione di prodotti chimici e cristalleria precauzioni.
Attenzione: Questo protocollo richiede l'uso di una piastra riscaldante a temperature elevate. Usare cautela e indossare guanti resistenti al calore quando interagendo con contenitori a caldo e non toccare la superficie della piastra riscaldante. - Cancellare l'area di lavoro e pulire le superfici con un disinfettante. Lavarsi le mani e mettiti i guanti.
- Sterilizzare tutti gli strumenti e la parte interna di tutti i vasi di vetro per ridurre il potenziale rischio di contaminazione e aumentare la longevità del fantasma.
Nota: Se il fantasma verrà utilizzato per più di un paio di giorni, pulire periodicamente la superficie del phantom completato con etanolo per prevenire la crescita batterica.
2. preparare la soluzione di acqua
- Preparare l'area di lavoro per la soluzione di acqua. Posizionare i seguenti materiali e attrezzature in panchina: laureato cilindro, becher da 400 mL, ancoretta, scala, 2 x pesare barche, spatola, 2 x 1,0 mL siringhe con ago, acqua distillata, agente di contrasto gadolinio-diethylenetriaminepentacetate (DTPA), tensioattivo solubile in acqua, agar e benzoato di sodio.
Nota: Siringhe possono essere utilizzati con o senza aghi. Tuttavia, usando gli aghi sarà migliorare la precisione della misurazione e aiutare a prevenire splatter quando i contenuti vengono aggiunti alle soluzioni acqua o olio. - Posto un ancoretta in un becher da 400 mL. Utilizzare un cilindro graduato da mL 100 o 200 per misurare 300 mL di acqua distillata e versare l'acqua nel contenitore. Porre il becher su piastra riscaldante e fissato a 90 ° C con un tasso di mescolare di 100 giri/min.
Nota: Alte temperature vengono utilizzate nel presente protocollo per ottenere risultati rapidi. Perché le soluzioni non sono lasciate sulla piastra riscaldante per lunghi periodi di tempo, la temperatura di set point per la piastra non riflette la temperatura della soluzione. - Utilizzare una scala calibrata per misurare 0,30 g di benzoato di sodio in una barca di pesare. Aggiungere alla soluzione di acqua benzoato di sodio.
- Utilizzare una siringa per misurare 0,6 mL del tensioattivo solubile in acqua. Assicurarsi che non vi siano senza bolle d'aria. Tenere l'ago a pochi millimetri sopra il centro della soluzione e rilasciare lentamente il tensioattivo solubile in acqua per evitare schizzi sulle pareti del bicchiere.
- Misurare con una siringa pulita 0,24 mL del mezzo di contrasto gadolinio-DTPA. Aggiungere il becher, usando la stessa tecnica come descritto al punto 2.4.
Nota: Gadolinio-DTPA è utilizzato per regolare le proprietà di rilassamento di MRI di phantom affinché corrispondano a quelle del tessuto di interesse. Il lettore può regolare il volume di gadolinio-DTPA aggiunto per meglio corrispondere alle proprietà di rilassamento del tessuto di interesse. - Misura 9,0 g di agar in una barca di pesare. Versate lentamente l'agar con una spatola nel becher con acqua.
- Una volta che tutto è stato aggiunto alla soluzione di acqua, aumentare la temperatura della piastra riscaldante a 350 ° C e mescolare bar a 1100 rpm per 5-10 minuti sciogliere l'agar.
- Per verificare se l'agar è sciolto, brevemente rimuovere la soluzione di acqua dalla piastra riscaldante, smettere di mescolare e controllare il colore della soluzione. Agar fuso dovrebbe essere chiaro (senza stelle filanti o ciuffi) e giallo o colore ambrato.
- Una volta che l'agar è completamente fuso, utilizzare una siringa o versare circa 3,5 mL della soluzione acquosa in una fialetta. Se la soluzione di test non imposta o separa dopo 5-10 min, l'agar non è sciolto. Aumentare la temperatura della piastra riscaldante a 350 ° C e continuare a riscaldare la soluzione.
- Ripetere il passaggio 2.8 fino alla soluzione dell'acqua nei set di fiala test correttamente.
- Lasciare la soluzione di acqua sulla piastra calda a 50 ° C e 100 giri/min. Pulire lo spazio di lavoro e preparare per la soluzione di olio.
- Rimuovere i seguenti materiali dalla panchina: scala, 2x pesare barche, spatola, 2 x 1,0 mL siringhe con ago (usato), acqua distillata, agente di contrasto gadolinio-DTPA, tensioattivo solubile in acqua, agar e benzoato di sodio.
- Posizionare i seguenti materiali e attrezzature in panchina: becher da 400 mL (pulito), ancoretta (pulito), 2,0 mL siringa con ago, olio di arachidi e tensioattivo solubile nell'olio.
3. olio soluzione
- Inserire una nuova barra per l'agitazione in un becher pulito 400 mL. Utilizzare un cilindro graduato per misurare 300 mL di olio di arachidi e versare nel contenitore. Rimuovere il recipiente contenente la soluzione di acqua e porre il becher di soluzione di olio sulla piastra riscaldante. Impostare a 90 ° C con un tasso di mescolare di 100 giri/min per 1 min.
Nota: l'olio di arachide viene utilizzato perché ha uno spettro di risonanza magnetica nucleare simile rispetto ai trigliceridi nel tessuto adiposo umano15.- Non lasciare l'olio sul fornello incustodito. Se l'olio si surriscalda e inizia a fumare, rimuoverlo dalla piastra riscaldante e ridurre la temperatura prima di tornare l'olio alla piastra.
- Misura 3,0 mL del tensioattivo solubile nell'olio con una siringa pulita. Utilizzando la stessa tecnica descritta al punto 2.4, aggiungere il tensioattivo solubile nell'olio il becher. Impostare la piastra di cottura a 150 ° C e 1100 giri/min per 5 min miscelare completamente la soluzione di olio.
- Prendere la soluzione dell'olio fuori la piastra riscaldante e pulire l'area di lavoro in preparazione per la creazione del fantasma.
- Rimuovere i seguenti materiali dalla panchina: 2,0 mL siringa con ago (usato), olio di arachidi e tensioattivo solubile nell'olio.
- Posizionare i seguenti materiali e attrezzature in panchina: mescolare 250 mL flacone erlenmeyer, bar (pulito), pipette volumetriche, titolare di pipetta volumetrica e barattoli di vetro 5 x 120 mL.
4. creare emulsione fantasma
- Preparare pipette volumetriche per le soluzioni di acqua e olio. Pipette devono essere utilizzati solo con la loro rispettiva soluzione per evitare la contaminazione incrociata.
- Corrisponde alla dimensione della pipetta per il volume utilizzato nel protocollo. Ad esempio, utilizzare pipette volumetriche 2 x 50 mL (50 mL di soluzione di acqua + 50 mL di soluzione di olio) per creare un 100ml fantasma con un obiettivo FF del 50% di grassi.
- Posizionate la soluzione di acqua sulla piastra e impostare la piastra a 300 ° C e 1100 giri/min. Dopo 4-5 min, spegnere l'agitatore.
- Utilizzando una pipetta volumetrica, controllare se la soluzione dell'acqua è pronta per l'estrazione parzialmente riempire la pipetta con una piccola quantità (5-10 mL) della soluzione e rilasciando nuovamente dentro il bicchiere. Se la soluzione di acqua può essere facilmente rimosso e rilasciata senza eccessiva resti nella pipetta, passare al passaggio successivo, in caso contrario, lasciarlo sulla piastra riscaldante e controllare di nuovo in 2-3 min.
Nota: I componenti della soluzione acquosa sono più suscettibili di impostazione e di separazione, quindi è meglio tenere la soluzione di acqua calda più spesso possibile e/o agitazione. Se la soluzione di acqua non è scaldata e mescolata prima del trasferimento, sarà molto difficile da misurare volumi precisi a causa della tendenza di agar per coagulare quando raffreddato. - Aggiungere con cautela un'ancoretta pulito in una beuta da 250 mL. Prendere la soluzione di acqua fuori la piastra, misurare un volume adeguato (tabella 2) e trasferirlo nel matraccio di Erlenmeyer.
- Posizionate la soluzione dell'olio sulla piastra e impostare a 90 ° C e 1100 giri/min per assicurare che la soluzione sia omogenea. Dopo 1-2 min, rimuovere la soluzione di olio dalla piastra e sostituirlo con il matraccio di Erlenmeyer.
- Misurare la giusta quantità di soluzione di olio (tabella 2) e aggiungere lentamente la soluzione di acqua nella beuta.
- Dopo aver aggiunto tutte le soluzione di olio, aumentare la temperatura a 300 ° C e mantenere l'agitazione a 1100 giri/min. Mescolare le soluzioni combinate per 4-5 min (dovrebbe esserci un vortice dall'ancoretta). L'emulsione deve essere bianco, con una consistenza cremosa.
- Utilizzare un documentalista di barra magnetica per rimuovere la barra per l'agitazione.
Nota: Il documentalista di stir bar dovrebbe essere utilizzato per rimuovere le barre di mescolare da tutti i futuri emulsioni. Pulire accuratamente tra ogni uso. - Utilizzare guanti resistenti al calore per attentamente versare il composto nella beuta in un barattolo di vetro pulito 120 mL. Versare lentamente lungo il lato del vaso di vetro per prevenire bolle nella miscela come si raffredda.
- Pulire la beuta e ancoretta, quindi ripetere i passaggi 4.2-4.8, regolando la quantità di soluzioni di acqua e olio, fino a quando tutti i fantasmi vengono creati.
Nota: Assicurarsi che il vetro è raffreddare prima di pulirlo.
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Risultati
Se la soluzione dell'acqua è stata preparata correttamente, una piccola quantità della soluzione dovrebbe congelare rapidamente in una fiala di test (Figura 1, sinistra). Se la soluzione separa (Figura 1, destra), la soluzione deve essere preparata nuovamente (come indicato nel passaggio 3.8 del protocollo). Se l'emulsione separa (esempi in Figura 2, sinistra...
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Discussione
Descriviamo un metodo affidabile per creare fantasmi acqua grasso adatto per convalidare le tecniche di imaging mediche utilizzate per quantificare il contenuto del trigliceride e del tessuto adiposo in vivo. Creando due serbatoi (uno per la soluzione di olio) e uno per la soluzione di acqua, fantasmi stabili con una varietà di valori FF – compresi i valori superiori al 50% – sono stati costruiti senza bisogno di costose attrezzature. Fantasmi di FF alti (> 50%) forniscono l'utilità affinché le tecniche di imagi...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi rapporto commerciale o finanziario che potrebbe essere interpretato come un potenziale conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Sostegno finanziario per questa ricerca è stata fornita il National Institutes of Health (NIH) e Istituto nazionale di diabete e digestivo e malattie renali (NIDDK) / NIH R01-DK-105371. Grazie Dr. Houchun (Harry) Hu per consigli e suggerimenti su creazione fantasma acqua grassa.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acqua distillata | Amazon | B000P9BY38 | Soluzione a base acquosa |
| Agar | Sigma Aldrich Incorporated | A1296-100G | Gelificante |
| Tensioattivo solubile in acqua | Sigma Aldrich Incorporated | P1379-500ML | Tensioattivo/emulsionante |
| Gadolinio-DTPA Agente di contrasto | Bayer Healthcare | 50419-0188-01 | Risonanza magnetica Agente di contrasto. |
| Benzoato di sodio | Sigma Aldrich Incorporated | 71300-250G | Conservante |
| Olio di arachidi | Amazon | 54782-LOU | Soluzione a base di olio |
| Tensioattivo solubile in olio | Sigma Aldrich Incorporated | S6760-250ML | Tensioattivo/emulsionante |
| Piastra riscaldante con agitatore | Fisher Scientific | 07-770-152 | |
| Barre di agitazione (a forma di uovo) | Sigma Aldrich Incorporated | Z127116-1EA | |
| Bicchiere da 400 mL | Sigma Aldrich Incorporated | CLS1003400-48EA | |
| Pallone di Erlenmeyer da 250 mL | Sigma Aldrich Incorporated | CLS4450250-6EA | |
| Pipetta volumetrica in vetro da 25 mL | Fisher Scientific | 13-650-2P | Quantità = 2 |
| Pipetta volumetrica in vetro da 50 mL | Fisher Scientific | 13-650-2S | Quantità = 2 |
| Pipetta volumetrica in vetro da 75 mL | Fisher Scientific | 13-650-2T | Quantità = 2 |
| Siringhe da 3,0 mL | Sigma Aldrich Incorporated | Z248002-1PAK | |
| Siringa da 1,0 mL | Sigma Aldrich Incorporated | Z230723-1PAK | |
| Spatola | Sigma Aldrich Incorporated | S3897-1EA | |
| Bilancia (risoluzione 100 g x 0,01 g) | Amazon | AWS-100-BLK | |
| Pesare Barche | Sigma Aldrich Incorporated | Z740499-500EA | |
| Barattoli di vetro da 120 ml McMaster | Carr Supply Co | 3801T73 | |
| Guanti resistenti al calore (coppia) | Amazon | B075GX43MN | |
| Aghi per siringhe | Sigma Aldrich Incorporated | Z192341-100EA | |
| 18" barra di agitazione retriver | Fisher Scientific | 14-513-70 | |
| Fiala in vetro trasparente 1 Dram | Fisher Scientific | 03-339-25B |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
Tag
Validazione della frazione di grassoemulsione a base di agarsoluzione di olio di arachidicontrasto Gadopentetato dimeglumine (Gd-DTPA)tecnica della pipetta volumetricamiscelazione su piastra riscaldantevalutazione dell'omogeneità del phantomfrazione del segnale del grasso in risonanza magnetica (MRI)
