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Articolo metodologico

Facendo indotta da coniugazione PEGylated Virus-come le particelle fluorescenti di chimica Dibromomaleimide-disolfuro

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DOI:

10.3791/57712

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27 maggio 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Texas at Dallas, 2Undergraduate Biology, University of Texas at Dallas, 3Undergraduate Healthcare Studies, University of Texas at Dallas, 4Departments of Chemistry & Biochemistry and Biomedical Engineering, University of Texas at Dallas

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo una procedura per funzionalizzare fluorescente disolfuri su Qβ VLP con dibromomaleimide. Descriviamo Qβ espressione e purificazione, la sintesi di molecole dibromomaleimide-funzionalizzate e la reazione di coniugazione tra dibromomaleimide e Qβ. La particella coniugata fluorescente gialla risultante utilizzabile come una sonda a fluorescenza all'interno delle cellule.

Abstract

Il recente aumento in particelle simili al virus (VLPs) in biomedica e ricerca dei materiali può essere attribuito alla loro facilità di biosintesi, dimensioni discrete, genetica programmabilità e biodegradabilità. Mentre sono altamente suscettibili di reazioni bioconjugation per l'aggiunta di ligandi sintetici sulla loro superficie, la gamma bioconjugation metodologie su questi capsidi nata acquose è relativamente limitata. Per facilitare la direzione della ricerca di biomateriali funzionali, sono da considerarsi reazioni bioconjugation non tradizionali. La reazione descritta in questo protocollo utilizza dibromomaleimides per introdurre nuove funzionalità nel solvente legami bisolfurico esposte di un VIP basati su Qβ del batteriofago. Inoltre, il prodotto finale è fluorescente, che ha il vantaggio di generare una sonda rintracciabile in vitro utilizzando un set di filtri disponibili in commercio.

Introduzione

Utilizzando nano-dimensioni capsidi virali è emerso come un campo emozionante, che mira ad ampliare la portata delle applicazioni nella ricerca biomedica1,2,3. Recombinantly espresse particelle simili al virus (VLPs) sono strutturalmente derivate dai virus, ma mancano il materiale genetico virale originale che li rende non infettive nanoparticelle proteinica. Come le caratteristiche della superficie sono geneticamente programmate e ogni capside è espresso in modo identico a quelli prima e dopo di esso, è possibile conoscere la posizione e il numero delle catene laterali reattivi degli aminoacidi con precisione atomistica. In molti casi, entrambe le superfici interne ed esterne possiedono molti generi di solvente esposta dell'amminoacido residui che possono essere funzionalizzati concretamente attraverso reazioni di bioconjugation - reazioni che formano legami covalenti tra una biomolecola e un sintetico molecola4,5.

Reazioni di bioconjugation aiutano biomolecole di interesse hanno funzionalità più diversificata in modo relativamente semplice. Molecole di interesse, come farmaci terapeutici6, fluorescente tag7 e polimeri8,9 possono essere pre-sintetizzati e caratterizzati prima sono attaccati sulla superficie di VIP. Un VLP particolarmente comune in biomedica e biomateriali la ricerca è stata la VLP basato su batteriofago Qβ, che, come recombinantly espresso, è un 28 nm icosaedrica del capside virale10. I più comuni siti di reazione su Qβ sono lisine con un ampio margine, anche se recentemente abbiamo comunicato la coniugazione successo11 dibromomaleimide composti per la ridotte disolfuri che costeggiano i pori di Qβ tramite una reazione di Haddleton-Baker. La reazione procede con una buona resa e, altrettanto importante, senza perdere la stabilità termica delle particelle. Allo stesso tempo, questa reazione genera fluorescenza indotta da coniugazione, che può essere utilizzato per monitorare l'assorbimento di queste particelle nelle cellule. In questo lavoro, dimostriamo la coniugazione di polietilenglicole (PEG) sulla superficie del Qβ attraverso la reazione di Haddleton-Baker, che si traduce in un fluoroforo giallo brillante. Queste particelle possono essere monitorate quindi come si sono presi dalle cellule. Il protocollo qui aiuterà i ricercatori a generare nuova pegilato fluorescente proteinica nanoparticelle basate su Qβ, anche se i suoi principi sono applicabili ad uno di molti altri VIP contenente solvente disolfuri esposte.

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Protocollo

1. preparazione

  1. Fare agar di brodo (LB) di Lisogenesi e versate piastre12.
  2. Trasformare BL21 (DE3) con un plasmide pET28 contenente la sequenza della proteina di wtQβ cappotto.
    1. Scongelare e. coli BL21 (DE3) cellule competenti in un bagno di ghiaccio. Mettere 50 μL di cellule in un tubo del microcentrifuge.
    2. Aggiungere 2 μL del plasmide in una provetta e flick delicatamente il tubo. Quindi Incubare in ghiaccio per 30 min.
    3. Shock termico delle celle per 45 s in un bagno di acqua che è esattamente a 42 ° c. Collocare la provetta nel bagno di ghiaccio subito dopo calore-scioccante e incubare per 5 min.
    4. Aggiungere 950 μL di LB media che non contiene alcun antibiotico.
    5. Scuotere la cultura a 200 giri/min per 60 min a 37 ° C.
    6. Piatto 100 μL della coltura su piastre di agar LB (con kanamicina) e incubare la piastra durante la notte a 37 ° C. Selezionare colonie bianchi quando necessario.
  3. Fai Super ottimale brodo (SOB) media.
    1. Autoclave due 2 L sconcertato matracci di Erlenmeyer su un ciclo di superdry.
    2. In un ambiente asettico, pesare e aggiungere 20,0 g di tryptone, Estratto di 5,0 g di lievito, 2,469 g di solfato di magnesio anidro, 0,584 g di cloruro di sodio e 0,186 g di cloruro di potassio in ciascuno dei palloni.
    3. Portare il volume a 1 L con acqua ultrapura in ogni boccetta ed autoclave sul ciclo liquido.
    4. Una volta che i media SOB ha raggiunto la temperatura ambiente dopo la sterilizzazione in autoclave, aggiungere 1 mL di kanamicina (100 mg/mL) per ogni litro di media e conservare a 4 ° C.
  4. Fare il tampone di fosfato di potassio 0.1 M (pH 7,00).
    1. Fanno 1 M potassio monobasico soluzione sciogliendo 68,045 g di potassio monobasico in 500 mL di acqua ultrapura.
    2. Fanno 1 M potassio bibasico soluzione sciogliendo 87,09 g di potassio bibasico in 500 mL di acqua ultrapura.
    3. Aggiungere 38,5 mL di soluzione di potassio monobasico e 61,5 mL di potassio bibasico per una bottiglia da 1 litro.
    4. Regolare il pH a 7.00 se necessario e portare a un volume di 1 L.
  5. Fai 5 – 40% pendenze del saccarosio in tampone fosfato di potassio 0.1 M (pH 7,00).
    1. In provette da 50 mL centrifuga, preparare soluzioni con saccarosio 5 – 40% (in aumento in incrementi del 5%) dissolto in tampone fosfato di potassio 0.1 M (pH 7,00).
    2. Deposito 3,3 mL di soluzione di 5% di saccarosio nella parte inferiore di un tubo di policarbonato di turno-fondo 38 mL utilizzando una siringa ago lungo e ripetere questa operazione per cinque altri tubi.
    3. Depositare con attenzione 3,3 mL di soluzione di saccarosio di 10% nella parte inferiore del tubo e rimuovere con cautela l'ago per non disturbare la sfumatura. Ripetere per gli altri cinque tubi.
       
  6. Continuare depositare strati di 3,3 mL delle soluzioni di saccarosio, in aumento dal 15% al 40% in ogni provetta, pur essendo prudente per non disturbare la sfumatura.
  7. Al termine, coprire le cime dei gradienti con lamina e conservare a-80 ° C.

2. espressione di Qβ

  1. Pulire la zona di panca con 1:1. candeggina/etanolo.
  2. Fai due colture starter di 3 mL in ambiente asettico aggiungendo singole colonie di e. coli BL21 (DE3) in 3 mL di media SOB in ambiente asettico.
  3. Crescere su un agitatore a 250 rpm in una stanza 37 ° C e 0% di umidità relativa (rH) durante la notte.
  4. Inoculare coltura starter media SOB:
    1. Togliere entrambe colture starter 3ml shaker e, in un ambiente asettico, versare ogni coltura starter in uno dei due 2 L sconcertato matracci di Erlenmeyer con 1 L di fresco media SOB in ciascuno.
    2. Posizionare il supporto di inoculate su un agitatore a 250 rpm in una camera di 37 ° C e 0% rH.
  5. Crescere i batteri su un agitatore a 250 rpm in una camera di 37 ° C e 0% rH OD600 fino a 0,9-1,0.
  6. Aggiungere 1 mL di 1 M isopropilico β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) usando una pipetta P1000 per indurre l'espressione della proteina.
  7. Lasciare i media sull'agitatore a 250 rpm in una camera di 37 ° C e 0% rH durante la notte.
  8. Rimuovere dal shaker la mattina seguente e centrifuga utilizzando flaconi da 1000 mL a 20.621 × g per 1 h a 4 ° C per raccogliere le cellule.
  9. Scartare il surnatante e raccogliere il pellet cellulare.
    1. Versare il surnatante in una boccetta con circa 5 mL di candeggina per uccidere i batteri. Si tratta di rifiuti.
    2. Utilizzare una spatola per raschiare il pellet cellulare dalla parte inferiore della bottiglia della centrifuga e mettere la pallina in una provetta da centrifuga 50 mL.

3. purificazione di Qβ

  1. Risospendere il pellet cellulare con ~ 20 – 30 mL di tampone fosfato di potassio 0.1 M (pH 7,00).
  2. Assicurarsi che la risospensione non ha nessun blocchi e lisare le cellule utilizzando un processore microfluidizer secondo il protocollo del produttore (Vedi Tabella materiali). Lisare le cellule almeno due volte per aumentare la resa delle particelle.
  3. Centrifugare il lisato in flaconi da 250 mL Centrifuga a 20.621 x g per 1 ora a 4 ° C.
  4. Scartare il pellet e misurare il volume del surnatante in mL. Moltiplicare tale valore per 0,265 e aggiungere che la quantità di g di solfato di ammonio al supernatante.
  5. Mescolare a 4 ° C per almeno 1 h su una zolla di mescolare a 200 giri/min per precipitare le proteine.
  6. Centrifugare in flaconi da 250 mL a 20.621 x g per 1 h a 4 ° C.
  7. Eliminare il surnatante e risospendere il sedimento con circa 10 mL di tampone fosfato di potassio 0.1 M (pH 7,00).
  8. Aggiungere volumi uguali di 1:1 cloroformio/n-butanolo campione grezzo e mescolare nel Vortex per pochi secondi.
  9. Centrifugare a provette mL 38 a 20.621 × g per 30 minuti a 4 ° C.
  10. Recuperare lo strato acquoso superiore utilizzando una pipetta Pasteur. Fare attenzione a non prendere uno qualsiasi del gel come strato che si è formata tra lo strato acquoso e organico.
  11. Scongelare i sei pendenze del saccarosio pre-fatte di 5-40% e caricare circa 2 mL di estratto su ciascuno.
  12. Ultracentrifuga a 99.582 x g per 16 h a 4 ° C con decelerazione gratis.
  13. Brillare di una luce che emettono luce a diodi (LED) sotto ogni tubo e una banda blu dovrebbe diventare visibile. Recuperare queste particelle con una lungo ago siringa.
  14. Ultrapellet le particelle a 370.541 x g per 2,5 ore a 4 ° C.
  15. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet trasparente delle particelle purificate con tampone fosfato di potassio 0.1 M (pH 7,00).

4. quantificazione e conferma del prodotto

  1. Utilizzare analisi di Bradford per quantificare il prodotto13.
  2. Esecuzione di riduzione e non riducenti sodio dodecil solfato elettroforesi del gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) per confermare il prodotto14.
    Nota: Riduzione dello SDS-PAGE viene utilizzato per confermare il peso molecolare della proteina del cappotto; non-riduzione dello SDS-PAGE è quello di confermare la struttura di ordine superiore.

5. coniugazione composti DB su Qβ

  1. Ridurre disolfuri su Qβ.
    1. Sciogliere 0,0020 g di tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) in 1 mL di acqua ultrapura per rendere una soluzione stock di 100 x.
      Nota: Preparare fresco TCEP prima riduzione.
    2. Aggiungere 200 µ l di Qβ (5 mg/mL) in un tubo del microcentrifuge.
    3. Seguire con l'aggiunta di 20 µ l di soluzione madre di 100 x TCEP.
    4. Incubare a temperatura ambiente per 1 h.
  2. Ri-ponte disolfuro ridotta utilizzando dibromomaleimide polietilenglicole (DB-PEG).
    1. Sciogliere 0,0017 g dibromomaleimide-polietilenglicole (DB-PEG) in 100 µ l di DMF.
    2. 680 µ l di soluzione di sodio fosfato 10 mM (pH 5,00).
    3. Aggiungere ridotto Qβ nella soluzione di DB-PEG e osservare il processo di miscelazione sotto una lampada a UV 365 nm. La fluorescenza gialla luminosa possa essere visualizzata immediatamente con una lampada palmare UV 365 con la miscelazione di nm.
    4. Lasciare che la reazione procedere durante la notte a temperatura ambiente (TA) su un girarrosto.
  3. Purificare la miscela di reazione dal filtro centrifugo (COMW = 10 kDa) tre volte utilizzando 1X PBS a 3.283 x g per 20 min a 4 ° C.
  4. Monitorare la coniugazione non riducenti SDS-PAGE e l'elettroforesi del gel dell'agarosi nativo.
    Nota: VLP eseguire come particelle intatte in gel di agarosio nativo, e sono separati base alla loro carica, dimensione e forma.

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Risultati

I derivati di dibromomaleimide possono essere sintetizzati attraverso la reazione di condensazione tra anidride dibromomaleimide e ammine primarie15. In alternativa, un metodo sintetico mite16 utilizzando N-metossicarbonile attivato 3,4-dibromomaleimide è stata sfruttata qui reagendo con metossipolietilen glicole (PEG) a rendimento DB-PEG (Figura 1). NMR è stato utilizzato per identificare la struttura composta ...

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Discussione

Rispetto al più piccolo purificazione della proteina, un unico passo a depurare il batteriofago Qβ è la centrifugazione in gradiente di saccarosio. Dopo la fase di estrazione di cloroformio/n-butanolo, Qβ viene ulteriormente purificato usando 5-40% pendenze del saccarosio. Durante la centrifugazione, le particelle vengono separate in base alle loro dimensioni. Le particelle più grandi in viaggio per la regione di densità superiore, mentre le particelle più piccole soggiorno nella regione più bassa densità. Qβ viaggia al ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

J.J.G. riconosce la National Science foundation (DMR-1654405) e cancro Prevenzione Research Institute del Texas (CPRIT) (RP170752s) per il loro sostegno.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
LB Brodo (Miller) EMD Millipore1.10285.0500
Triptone, PowederResearch Products InternationalT60060-1000.0
Estratto di lievito, PowederResearch Products InternationalY20020-1000.0
Solfato di magnesio anidroP212121CI-06808-1KG
Cloruro di sodio (cristallino/certificato ACS)Fisher ScientificS271-10
Cloruro di PotassioFisher ScientificBP366-500
Elga PURELAB Flex 3 Sistema di Purificazione AcquaFisher Scientific4474524
Fosfato di Potassio MonobasicoFisher ScientificBP362-1
Fosfato di Potassio Bibasico AnidroFisher ScientificP288-500
SaccarosioFisher Scientific
EtanoloFisher ScientificBP2818500
Isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)Sigma AldrichI6758-1G
Fiberlite F10-4x1000 LEX rotore...Fisher Scientific096-041053
Solfato di ammonioP212121KW-0066-5KG
CloroformioAlfa Aesar32614-M6
1-butanoloFisher ScientificA399-4
SW 28 Ti Rotore, benna oscillante, alluminioBeckman Coulter342204: SW 28 Ti Rotore / 342217: Set
Tipo 70 Ti Rotore, angolo fisso, Titanio, 8 x 39 mL,Beckman Coulter337922
Coomassie (Bradford) Dosaggio delle proteineFisher ScientificPI23200
TRIS CloridratoResearch Products InternationalT60050-1000.0
TetrametiletilendiamminaAlfa AesarJ63734-AC
Tris(2-carbossietil)fosfina cloridratoSigma AldrichC4706-2G
2 3-Dibromomaleimmide 97%Sigma Aldrich553603-5G
Polietilene GlicoleAlfa Aesar41561-22
Sodio FosfatoFisher ScientificAC424375000
Acrilammide/bis-acrilammideP212121RP-A11310-500.0
Sodio dodecil solfatoSigma AldrichL3771-100G
Persolfato di ammonioFisher ScientificBP179-100
FV3000 microscopio a scansione laser confocaleOlympus FV3000 
Labnet Revolver Rotatore Regolabile Thomas Scientific 1190P25 
Flacone Sorvall ad alte prestazioni da 1000 mL, PC, con tappo in alluminio.Thermo Scientific010-1459
Nalgene Flaconi per centrifuga con tappi, polipropilene copolimeroThermo Scientific3141-0250
Nunc Provette a fondo tondo; 38 mL; PCThermo Scientific3117-0380
L Palloni Erlenmeyer a bocca stretta con bordo per impieghi gravosiPyrex4980-2L
Amicon Ultra-4 Unità di filtraggio centrifugoMillipore SigmaUFC801024
M-110P Microfluidizer Materials ProcessorMicrofluidicsM-110P
Nalgene Provette per centrifuga a fondo tondo in policarbonato ad alta velocitàThermo Scientific3117-0380PK
Bottiglia, con tappo assemblato,Policarbonato Beckman Coulter41121703
cilindro, graduato - Polipropilene 250 mLPolyLab80005
533LS-E Series Sterilizzatoria vapore Getinge533LS-E
TrueLine, piastra per colture cellulari, trattata, PS, 96 pozzetti, con coperchioLabSourceD36-313-CS
Provetta per centrifuga conica Falcon 15 mLFisher Scientific14-959-53A
Provetta per microcentifughi: 1,5 mLFisher Scientific05-408-129
VWR Os-500 Agitatore orbitaleVWR Scientifc Products14005-830
Sistemi Tetra HandcastBio-Rad1658000FC
Polipropilene, 250 mLBeckman Coulter41121703
Spettrofluorimetro NanoDropThermo Fisher Scientific3300
Ago Lungo Hamilton7693
Exel International Siringhe da 5 a 6 cc Luer LockFisher Scientific14-841-46
P1000 PipetmanGilsonF123602
P200 PipetmanGilsonF123601
P100 PipetmanGilsonF123615
P20 PipetmanGilsonF123600
P10 PipetmanGilson
Pesata Intel PM-100 Bilancia da laboratorio classica ad alta precisionedi ponderazione intelligenteIWT_PM100
Provetta per centrifuga conica Falcon 50 mLFisher Scientific14-432-22
4– 15% Gel Mini-PROTEAN TGX, 10 pozzetti, 50 & micro; lBio-Rad456-1084
S25590Bdi secchi 2 F144802 Tecnologia

Riferimenti

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