Articolo metodologico
Qui, presentiamo una procedura per funzionalizzare fluorescente disolfuri su Qβ VLP con dibromomaleimide. Descriviamo Qβ espressione e purificazione, la sintesi di molecole dibromomaleimide-funzionalizzate e la reazione di coniugazione tra dibromomaleimide e Qβ. La particella coniugata fluorescente gialla risultante utilizzabile come una sonda a fluorescenza all'interno delle cellule.
Il recente aumento in particelle simili al virus (VLPs) in biomedica e ricerca dei materiali può essere attribuito alla loro facilità di biosintesi, dimensioni discrete, genetica programmabilità e biodegradabilità. Mentre sono altamente suscettibili di reazioni bioconjugation per l'aggiunta di ligandi sintetici sulla loro superficie, la gamma bioconjugation metodologie su questi capsidi nata acquose è relativamente limitata. Per facilitare la direzione della ricerca di biomateriali funzionali, sono da considerarsi reazioni bioconjugation non tradizionali. La reazione descritta in questo protocollo utilizza dibromomaleimides per introdurre nuove funzionalità nel solvente legami bisolfurico esposte di un VIP basati su Qβ del batteriofago. Inoltre, il prodotto finale è fluorescente, che ha il vantaggio di generare una sonda rintracciabile in vitro utilizzando un set di filtri disponibili in commercio.
Utilizzando nano-dimensioni capsidi virali è emerso come un campo emozionante, che mira ad ampliare la portata delle applicazioni nella ricerca biomedica1,2,3. Recombinantly espresse particelle simili al virus (VLPs) sono strutturalmente derivate dai virus, ma mancano il materiale genetico virale originale che li rende non infettive nanoparticelle proteinica. Come le caratteristiche della superficie sono geneticamente programmate e ogni capside è espresso in modo identico a quelli prima e dopo di esso, è possibile conoscere la posizione e il numero delle catene laterali reatt....
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1. preparazione
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I derivati di dibromomaleimide possono essere sintetizzati attraverso la reazione di condensazione tra anidride dibromomaleimide e ammine primarie15. In alternativa, un metodo sintetico mite16 utilizzando N-metossicarbonile attivato 3,4-dibromomaleimide è stata sfruttata qui reagendo con metossipolietilen glicole (PEG) a rendimento DB-PEG (Figura 1). NMR è stato utilizzato per identificare la struttura composta .......
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Rispetto al più piccolo purificazione della proteina, un unico passo a depurare il batteriofago Qβ è la centrifugazione in gradiente di saccarosio. Dopo la fase di estrazione di cloroformio/n-butanolo, Qβ viene ulteriormente purificato usando 5-40% pendenze del saccarosio. Durante la centrifugazione, le particelle vengono separate in base alle loro dimensioni. Le particelle più grandi in viaggio per la regione di densità superiore, mentre le particelle più piccole soggiorno nella regione più bassa densità. Qβ viaggia al .......
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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
J.J.G. riconosce la National Science foundation (DMR-1654405) e cancro Prevenzione Research Institute del Texas (CPRIT) (RP170752s) per il loro sostegno.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| LB Brodo (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Triptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Estratto di lievito, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Solfato di magnesio anidro | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Cloruro di sodio (cristallino/certificato ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Cloruro di Potassio | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Sistema di Purificazione Acqua | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Fosfato di Potassio Monobasico | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Fosfato di Potassio Bibasico Anidro | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Saccarosio | Fisher Scientific | ||
| Etanolo | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4x1000 LEX rotore... | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Solfato di ammonio | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Cloroformio | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-butanolo | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotore, benna oscillante, alluminio | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotore / 342217: Set | |
| Tipo 70 Ti Rotore, angolo fisso, Titanio, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Dosaggio delle proteine | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Cloridrato | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetrametiletilendiammina | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimmide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polietilene Glicole | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodio Fosfato | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrilammide/bis-acrilammide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodio dodecil solfato | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Persolfato di ammonio | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 microscopio a scansione laser confocale | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Rotatore Regolabile | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| Flacone Sorvall ad alte prestazioni da 1000 mL, PC, con tappo in alluminio. | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Flaconi per centrifuga con tappi, polipropilene copolimero | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Provette a fondo tondo; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| L Palloni Erlenmeyer a bocca stretta con bordo per impieghi gravosi | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Unità di filtraggio centrifugo | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene Provette per centrifuga a fondo tondo in policarbonato ad alta velocità | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottiglia, con tappo assemblato, | Policarbonato Beckman Coulter | 41121703 | |
| cilindro, graduato - Polipropilene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Sterilizzatori | a vapore Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, piastra per colture cellulari, trattata, PS, 96 pozzetti, con coperchio | LabSource | D36-313-CS | |
| Provetta per centrifuga conica Falcon 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Provetta per microcentifughi: 1,5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Agitatore orbitale | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Sistemi Tetra Handcast | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polipropilene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spettrofluorimetro NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Ago Lungo | Hamilton | 7693 | |
| Exel International Siringhe da 5 a 6 cc Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | ||
| Pesata Intel PM-100 Bilancia da laboratorio classica ad alta precisione | di ponderazione intelligente | IWT_PM100 | |
| Provetta per centrifuga conica Falcon 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4– 15% Gel Mini-PROTEAN TGX, 10 pozzetti, 50 & micro; l | Bio-Rad | 456-1084 |
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