Registrazione spazialmente limitate oscillazioni nell'ippocampo dei topi di comportarsi

Sommario

Questo protocollo descrive la registrazione dei potenziali di campo locale con Multi-Tibia punte in silicio lineare. Conversione dei segnali mediante analisi di densità di corrente sorgente consente la ricostruzione dell'attività elettrica locale nell'ippocampo del mouse. Con questa tecnica, le oscillazioni nello spazio limitato del cervello possono essere studiate in topi liberi di muoversi.

Abstract

Il potenziale di campo locale (LFP) emerge dai movimenti di ioni attraverso le membrane neurali. Poiché la tensione registrata dagli elettrodi LFP riflette il campo elettrico sommato di un grande volume di tessuto cerebrale, l'estrazione di informazioni sulle attività locali è impegnativo. Studiare un neurone microcircuiti, tuttavia, richiede una distinzione certa tra eventi veramente locali e volume-condotto segnali provenienti da zone lontane del cervello. Analisi di densità (CSD) di origine corrente offre una soluzione per questo problema fornendo informazioni sulle origini in prossimità degli elettrodi e i sink corrente. Nelle aree del cervello con laminare cytoarchitecture quale l'ippocampo, CSD unidimensionale può essere ottenuto calcolando la derivata seconda spaziale della LFP. Qui, descriviamo un metodo per registrare multilaminare LFPs usando le sonde lineari silicio impiantati nell'ippocampo dorsale. CSD tracce vengono calcolate lungo singoli steli della sonda. Questo protocollo descrive così una procedura per risolvere oscillazioni spazialmente limitata rete neuronale nell'ippocampo dei topi liberi di muoversi.

Introduzione

Oscillazioni in LFP sono criticamente coinvolti nell'elaborazione di circuiti neuronali dell'informazione. Essi coprono un ampio spettro di frequenze, che vanno da onde lente (~ 1 Hz) a ripple veloce oscillazioni (~ 200 Hz)¹. Bande di frequenza distinte sono associati con funzioni cognitive tra cui memoria, elaborazione emotiva e navigazione^2,3,4,5,6,7. Flusso di corrente attraverso le membrane neuronali costituisce la più grande parte del segnale LFP⁸. Cationi di entrare nella cellula (per esempio attraverso l'attivazione di sinapsi eccitatorie glutammatergiche) rappresentano un dissipatore attivo corrente (come carica lascia medium extracellulare). Al contrario, flusso netto di carica positiva al medium extracellulare, ad esempio dall'attivazione delle sinapsi inibitorie di neuroni GABAergici, raffigura una fonte di corrente attiva in quella posizione. In un neurone dipoli, sink corrente sono accoppiati con fonti passive e viceversa a causa di correnti elettriche che interessano la membrana carica ai luoghi distanti di compensazione.

Il campo elettrico prodotto da remoti processi neurali può anche provocare deviazioni notevole tensione su un elettrodo di registrazione e così potrebbe essere erroneamente considerato come un evento locale. Questa conduzione di volume pone una seria sfida per l'interpretazione dei segnali LFP. CSD analisi fornisce informazioni locali corrente Lavelli e fonti sottostante LFP segnali e quindi costituito un mezzo per ridurre l'impatto del volume di conduzione⁸. In laminato strutture come l'ippocampo, unidimensionale CSD segnali possono essere ottenuti dalla seconda derivata spaziale di LFP registrata dalla perpendicolare equidistante elettrodi disposti ai piani laminare⁹. L'avvento di silicio lineare commercialmente disponibili sonde ha permesso ai ricercatori di utilizzare il metodo CSD per lo studio dell'attività di oscillazione locale nell'ippocampo. Ad esempio, è stato dimostrato che le oscillazioni gamma distinte emergono in maniera strato-specifica nella zona CA1¹⁰. Inoltre, l'analisi CSD ha identificato indipendente hot spot di attività gamma nello strato delle cellule principali del giro dentato¹¹. D'importanza, questi risultati erano solo apparenti in CSD locale ma non in segnali LFP. Analisi CSD fornisce così un potente strumento per guadagnare la comprensione nelle operazioni microcircuito dell'ippocampo.

In questo protocollo, forniamo una guida completa per ottenere segnali di CSD unidimensionali con punte in silicio. Questi metodi consentirà agli utenti di studiare gli eventi di oscillazione localizzato nell'ippocampo dei topi si comporta.

Protocollo

Tutti i metodi che coinvolgono animali viventi sono stati approvati dal Friburgo Regierungspräsidium secondo il tedesco Animal Welfare Act.

1. preparati

1. Progettare e costruire lo strumento di inserimento appropriato transitoriamente portando la sonda di silicio e il connettore elettrodo durante il processo dell'impianto. Vedere la Figura 1 per un utensile costruito di esempio personalizzato.
2. Rilasciare con attenzione il connettore sonda e l'elettrodo di silicio dalla confezione usando il forcipe con punta in ceramica.
3. Sollevare la scheda connettore e fissare saldamente con una pinza coccodrillo collegata a uno stand.
4. Utilizzando uno stereoscopio, allineare la sonda con lo strumento di inserimento con una pinza con punta in ceramica. Applicare uno strato di cera di paraffina fusa con un cauterizzatore per incollare la sonda per l'utensile di inserimento ~ 2 mm. Fare attenzione a non per toccare gli stinchi sonda durante questa procedura.
5. Fissare il connettore elettrodo all'albero dello strumento di inserimento utilizzando nastro adesivo standard. Si noti che a seconda del produttore, fili di terra debba essere saldati sulla scheda connettore elettrodo prima dell'impianto. Rimuovere l'isolamento da due brevi pezzi di filo di rame isolato di vernice utilizzando saldare a stagno applicato con un saldatore (400 ° C). Saldare i fili di terra agli slot appropriato nel Consiglio del connettore di elettrodo.
6. Rimuovere l'isolamento di due ulteriori pezzi di filo di rame. Avvolgere ogni filo di rame nudo tre volte intorno una vite in acciaio inox (diametro di 1 mm, 2 mm di lunghezza). Applicare flusso adatto a saldatura acciaio e saldare il filo di rame a fondo il tappo a vite. Assicurarsi che il fondo metà del filetto di vite rimane libero di saldare a stagno.
7. Utilizzare un multimetro standard per controllare un contatto elettrico tra filo e vite.
8. Disinfettare gli stinchi della sonda silicio e le viti di terra mediante immersione in etanolo al 70% (10 s).
9. Preparare un coperchio di protezione per l'impianto di sonda tagliando la testa di una pipetta Pasteur di plastica a metà.

2. l'impianto chirurgia

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici (forbici, pinze a punta fine, clamp chirurgiche) con uno sterilizzatore caldo perlina. Pulire tutte le superfici con etanolo al 70%.
2. Indurre l'anestesia con isoflurano 3% in ossigeno erogato a ~ 1 L/min.
   1. Per la manutenzione, utilizzare 1-1.5% isoflurane. Si noti che la concentrazione di isoflurane per ottenere tolleranza chirurgica necessaria può variare da animale ad animale.
   2. Tolleranza di chirurgica stabile si ottiene quando l'animale non risponde a punta-pizzicamento. Monitorare il tasso di respirazione del mouse e se necessario, regolare la concentrazione di isoflurane.
   3. Applicare unguento per gli occhi dell'animale per evitare l'essiccazione.
3. Montare il mouse in una cornice stereotassica inserendo delicatamente bar orecchio nel condotto uditivo. Una volta che la testa del mouse è stabilizzata tramite le barre di orecchio, è possibile posizionare un pezzo di bocca sopra il muso per il recapito continuo isoflurano. Posizionare il mouse sul tovagliolo o pad sopra un rilievo del heating e iniettare per via sottocutanea buprenorfina (0,05 - 0,1 mg/kg di peso corporeo) per garantire l'analgesia postoperatoria.
4. Radersi la testa con un rasoio standard e disinfettare la pelle con etanolo al 70%. Utilizzando le forbici chirurgiche, fare un'incisione nella pelle lungo la linea mediana del cranio e aprire la pelle utilizzando pinze chirurgiche.
5. Allineare la testa dell'animale con l'ausilio di uno strumento di allineamento stereotassica a livello bregma e lambda. Ci dovrebbe essere meno di 50 µm di offset di altezza tra bregma e lambda. Inoltre, la testa lungo l'asse mediolateral misurando la profondità dal bregma al cranio in superficie al livello definito Distanze destra e sinistra (ad es., 1 mm a sinistra e destra di bregma). Se necessario, regolare l'inclinazione della testa.
6. Pulire la testina con 3% di perossido di idrogeno e asciugare con salviette di cotone sterile.
7. Determinare la posizione del craniotomy rispetto al bregma utilizzando un appropriato Atlante stereotassiche¹².
8. Utilizzando una testa del trivello di 0.9 mm, praticare due fori per le viti nell'osso sopra il cervelletto per posizionare le viti di terra e di riferimento. Inoltre, 1-3 fori per viti di ancoraggio sono desiderabili per stabilizzare l'impianto. La posizione delle viti di ancoraggio dipenderà la posizione del craniotomy. Per l'impianto nell'ippocampo, posizionare le viti di ancoraggio sopra corteccia frontale omolaterale e parietale controlaterale. Inserire le viti nell'osso con un cacciavite adatto. Fare attenzione a non per penetrare nel cervello.
9. Eseguire il craniotomy fluidificando lentamente il cranio con il trapano in un'area rettangolare intorno al lato dell'impianto. Inumidire frequentemente l'osso con tampone fosfato sterile (PB). Il cranio assottigliato rimanente possa essere delicatamente trafitto e rimosso con l'aiuto di un ago sottile di iniezione (27G) e un paio di pinzette.
10. Perforare con attenzione il mater di dura con un sottile ago per iniezione (27G). Formare un piccolo gancio piegando la punta dell'ago con un paio di pinzette e tirare il dura per la rimozione. Applicare PB per evitare che la superficie del cervello dall'asciugarsi.
11. Montare l'utensile di inserimento elettrodo su un supporto stereotassica, zero la sonda il bregma e muovere la sonda alle coordinate stereotassiche sopra il craniotomy. Lentamente penetrare la superficie del cervello. Assicurarsi di che non piegare gli alberi di sonda. Evitare l'impianto attraverso i vasi sanguigni.
12. Abbassare lentamente la sonda fino a ~ 200 µm sopra la profondità desiderata. Coprire il craniotomy e tibia della sonda silicio con vaselina sterile per la protezione. Applicare il cemento dentale per fissare la base della sonda e la vite di ancoraggio nel cranio.
13. Proprio dopo l'applicazione del cemento, muovere lentamente la sonda fino alla profondità di destinazione. Dopo l'applicazione del cemento riduce il movimento laterale della sonda e garantisce danno di tessuto minimo nella zona di destinazione, avanzando l'ultima ~ 200 µm. Si noti che il tempo di polimerizzazione del cemento utilizzato può influenzare questo passaggio del protocollo. Con rapido indurimento cemento, omettere questo passaggio e di impianto direttamente la sonda fino alla profondità di destinazione al fine di evitare danni alla sonda di silicio.
14. Dopo che il cemento ha guarito, rilasciare la sonda dallo strumento di inserimento fondendo la cera con un cauterizzatore.
15. Rilasciare il connettore piastra dal dispositivo di inserimento e posizionarlo in un punto adatto sul cranio utilizzando una pinza coccodrillo connesso all'handle di inserimento. In caso l'impianto sonda nell'ippocampo, posizionare la scheda di connettore sull'osso parietale controlaterale. Fissare il connettore a bordo al cranio mediante cemento dentale.
16. Saldare i fili di terra e di riferimento della scheda connettore per i cavi fissati alle due viti sopra il cervelletto.
17. Tagliare il coperchio di protezione all'altezza corretta e metterlo sopra la sonda di silicio. Fissare il coperchio del connettore piastra e cranio utilizzando cemento dentale, evitando la pelle intorno le esposte del cranio. Solitamente non è necessario suturare la pelle intorno al sito di impianto.

3. il recupero dopo l'intervento chirurgico

1. Applicare il trattamento analgesico appropriato per almeno 2 giorni (ad es. le iniezioni sottocutanee di buprenorfina ogni 6 h durante il giorno e nell'acqua da bere durante la notte combinato con carprofen (4-5 mg/kg di peso corporeo) per via sottocutanea ogni 24 h). Singolo-alloggiamento è consigliato per evitare danni all'impianto.
2. Consentire almeno una settimana per il recupero. Consultare le linee guida locali benessere degli animali.

4. acquisizione dati

1. LFPs record da topi utilizzando un sistema di acquisizione dati adatto collegato tramite un commutatore di muoversi liberamente. Per acquisire LFPs, utilizzano una frequenza di campionamento di 1-5 kHz. Frequenze di campionamento più elevati (20-30 kHz) sono necessari se gli scarichi unitario devono essere registrati con la LFP.
2. Memorizzare i file di registrazione raw dei singoli canali per l'analisi offline.

5. istologia

1. Dopo il completamento della registrazione, profondamente anestetizzare l'animale (per esempio 2 g/kg corpo peso uretano iniettato intraperitonealmente). Confermare lo stato anestetico dalla mancanza di risposta a pizzicare le dita.
2. Irrorare il mouse via con gelida tampone fosfato salino (~ 1 min) seguita da paraformaldeide al 4% (~ 10 min) utilizzando standard intracardiaca aspersione metodi¹³. Prima di aspersione, lesioning elettrolitico dei siti di registrazione potrebbe da eseguire (ad es. mediante l'applicazione di 10-20 V di tensione costante per fino a 1 s). In alternativa, tinture fluorescenti applicato alle punte gambo prima che l'impianto può essere utilizzato per tenere traccia di identificazione. Prova i vari metodi per l'identificazione delle posizioni di elettrodo per ottenere risultati ottimali con diversi tipi di sonde di silicio è raccomandato.
3. Tagliare sezioni del cervello (~ 100 µm) e macchiare le fette con 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1 µ g/mL) seguita da tre lavaggi in PB (ogni 10 min a temperatura ambiente).
4. Posto le sezioni su un vetrino da microscopio, applicare una goccia di mezzo di inclusione e coprire la sezione con un vetrino coprioggetto. Lasciate che l'incasso media asciugare durante la notte a temperatura ambiente.
5. Utilizzando un epifluorescenza o microscopio confocale a scansione laser, identificare la posizione dei siti di registrazione.
6. Per tentare il recupero della sonda silicio per un ulteriore uso, tenere la sonda con un morsetto a coccodrillo e rilasciare la sonda dal cranio fondendo attentamente il cemento dentale con un saldatore (400 ° C). Fare attenzione a non per toccare gli stinchi sonda durante questa procedura!
7. Lavare la sonda con acqua distillata (~ 80 ° C, 15 min) seguita da una soluzione enzimatica (1% Tergazyme in acqua distillata, 30 min a temperatura ambiente) e passo un altro lavaggio in acqua distillata (15 min). Nota che il tasso di successo di recupero sonda è basso.

6. CSD analisi

1. Utilizzando un ambiente di analisi adeguati (ad es. Python), convertire dati LFP di un gambo di singolo per CSD approssimando la seconda derivata spaziale lungo la tibia come
   
   dove LFP_{n, t} è il segnale LFP sull'elettrodo n^th al tempo t e Δz è la spaziatura inter-elettrodo. Si noti che a causa della n-1 e n+ 1 operazioni, il CSD degli elettrodi primi e l'ultimi del gambo non può essere stimata, che deve essere preso in considerazione durante il posizionamento della sonda. Implementare la formula di approssimazione utilizzando un breve segmento di codice che calcola il segnale CSD per ciascun elettrodo durante lo scorrimento nel tempo (Vedi File di codice supplementare).
2. Utilizzare il segnale CSD ottenuto per ulteriori analisi (ad esempio, studiando specifiche bande di frequenza delle oscillazioni del cervello applicando filtri passa-banda).

Risultati

La figura 1 illustra l'utensile utilizzato per l'impianto di silicio. Registrazioni dal silicio cronicamente impiantato sonde come target l'area CA1 e lo strato delle cellule del granello di circonvoluzione dentata sono mostrati nella Figura 2. Abbiamo registrato LFPs dalla tibia sonda durante la libera circolazione nella homecage. Per minimizzare l'effetto della conduzione di volume, i segnali ottenuti sono stati convertiti alla...

Discussione

Crescenti evidenze indicano che le oscillazioni del cervello in circuiti neuronali ippocampali si presentano in domini spaziali discreti^10,11,16. Analisi CSD riduce drasticamente l'influenza della conduzione di volume, un presupposto fondamentale per lo studio degli eventi di oscillazione locale. Con questo video, forniamo una guida per impiantare punte in silicio nell'ippocampo del mouse per l'analisi dei dati CSD. Vi mostriamo...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Morsetto a coccodrillo con supporto	Reichelt Elektronik	HALTER ZD-10D
Sonda in silicone	Cambridge Neurotech	serie P 32
Stereoscopio	Olympus	SZ51
Filo di rame isolato con vernice	Bü rklin Elektronik	89 F 232
Viti di messa a terra	Viti & GmbH (screwsandmore.de)	DIN 84 A2 M1x2
	Flux Stannol	114018
Pinze con punta in ceramica	Fine Science Tools	11210-60
Cera paraffina	Sigma-Aldrich	327204
Cauterizzatore	Fine Science Tools	18010-00
Saldatore	Kurtz Ersa	OIC1300
Multimetro	Uni-T	UT61C
Etanolo	Carl Roth	9065.1
Pipette Pasteur	Carl Roth	EA65.1
Sterilizzatore a caldo	Fine Science Tools	18000-45
Telaio stereotassico	David Kopf	Modello 1900
Portaelettrodo stereotassico	David Kopf	Modello 1900
Isoflurano	Abbvie	B506
Concentratore di ossigeno	Respironix	1020007
Buprenorfina	Indivior UK Limited
Rasoio elettrico	Tondeo	Eco-XS
Termoforo	Thermolux	463265/-67
Morsetti chirurgici	Fine Science Tools	18050-28
Perossido di idrogeno	Sigma-Aldrich	H1009
Salviette di cotone sterili	Carl Roth	EH12.1
Drill	Proxxon	Micromot 230/E
21G ago per iniezione	B. Braun	4657527
Soluzione salina tampone fosfato/soluzione salina
Atlante stereotassico	Elsevier	9.78012E+12
Forbici chirurgiche	Strumenti per le scienze fini	14094-11
Pinze chirurgiche Strumenti per	le scienze fini	11272-40
Aghi per iniezione 27G	B. Braun	4657705
Vaselina
Cemento dentale	Sun Medical	SuperBond T& M
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50mg/ml
Amplificatore di registrazione	Intan Technologies	C3323
Scheda di acquisizione USB	Intan Technologies	C3004
Cavi di registrazione	Intan Technologies	C3216
Commutatore elettrico	Lenti doriche	HRJ-OE_FC_12_HARW
Software di acquisizione	OpenEphys (www.open-ephys.org)	L'interfaccia grafica	consente l'acquisizione dei dati indipendente dalla piattaforma
Computer per l'acquisizione
Ambiente di analisi	Python (www.python.org)		consente l'analisi dei dati indipendente dalla piattaforma
Uretano	Sigma-Aldrich
Vibratomo	Leica	VT1000
Vetrini per microscopio	Carl Roth	H868.1
Vetrini coprioggetti	Carl Roth	H878.2
Mezzo di inclusione	Sigma-Aldrich	81381-50G
Acqua distillata	Millipore	Milli Q	Macchina da tavolo per la produzione di acqua distillata
Tergazyme	Alconox	Tergazyme