Preparare lo sviluppo di tessuto periferico olfattivo per molecolare e l'analisi di Immunohistochemical in Drosophila

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per tappa e sezionare lo sviluppo di tessuto olfattivo da specie di Drosophila . Il tessuto dissecato più tardi può essere utilizzato per le analisi molecolari, quali quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) o RNA sequenziamento (RNAseq), così come in vivo analisi quali immunoistochimica o in situ ibridazione.

Abstract

Il sistema olfattivo di Drosophila è un sistema ampiamente usato in neurobiologia inerente allo sviluppo, neuroscienza sistemiche, come pure neurofisiologia, comportamento ed evoluzione del comportamento. Drosophila olfattivi tessuti casa i neuroni olfattivi (ORNs) che rilevano chimici volatili spunti oltre ai neuroni idro-termo-sensoriale. In questo protocollo, descriviamo la dissezione di sviluppare tessuto periferico olfattivo della specie Drosophila adulto. Descriviamo in primo luogo come tappa e larve di Drosophila , seguite da dissezione del disco antennale dalla prime fasi pupal, seguite da dissezione delle antenne da adulti e metà-pupal fasi di età. Mostriamo anche metodi dove preparazioni possono essere utilizzati in tecniche molecolari, come l'estrazione di RNA per qRT-PCR, RNAseq o immunohistochemistry. Questi metodi possono applicarsi anche ad altre specie di Drosophila dopo tempi di sviluppo pupale specie-specifici sono determinati, e rispettivi stadi sono calcolati per invecchiamento appropriato.

Introduction

Il sistema olfattivo di Drosophila è un sistema ampiamente usato in neurobiologia inerente allo sviluppo, neuroscienza sistemiche, come pure neurofisiologia, studi di comportamento e comportamentali evolution^{1,2,3, 4}. Drosophila olfattivi tessuti casa i neuroni olfattivi (ORNs) che rilevano chimici volatili spunti oltre a idro-termo-sensoriale neuroni^1,5,6. L'obiettivo generale di questo manoscritto è quello di dimostrare come tap....

Protocol

Il seguente protocollo è coerenza con le linee guida etica stabilite dal comitato di etica di Duke University Research.

1. preparazione e messa in scena dello sviluppo di Drosophila melanogaster Pupa

1. In primo luogo, di identificare quante mosche sarà necessarie per la dissezione. Per RT-PCR e RNAseq, raccogliere 100-200 dischi antennali e antenne da individui che sono necessari nelle fasi prepupa, 8h APF, 40h APF e adulto. Per l'immunoistochimica, sezionare individuo 10-20.
2. Pulire tutti i materiali, compreso la dissezione pastiglie e pinze, utilizzando salviette con 70% EtOH. Se il materiale sezionato è per esse....

Results

Il dissecata tessuto olfattivo in via di sviluppo può essere utilizzato per l'estrazione di RNA seguita da RT-PCR per valutare l'espressione genica o può essere preso attraverso protocolli di immunohistochemistry per determinare il modello di espressione e la localizzazione sub-cellulare dei geni di interesse. In questa sezione vi presentiamo i risultati rappresentativi da entrambi i protocolli. Figura 1 è la rappresentante RT-PCR quantitativa mostrando la tr.......

Discussion

Questo protocollo è una risorsa utile per i laboratori interessati a individuare i programmi genetici e trascrizionali operanti nello sviluppo di tessuto olfattivo Drosophila , nonché un'analisi comparativa di questi programmi in Drosophila specie. È particolarmente utile se il livello dei sistemi profili trascrizionali da diversi stadi di sviluppo sono necessari come primer per gli studi futuri. Il protocollo descritto qui di seguito viene illustrato come tappa e isolare lo sviluppo di tessuto olfattiv.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X Soluzione salina tamponata con fosfato	Gibco	70011-044	Diluire a 1X in acqua priva di RNasi
CO2 serbatoio	Aria Gas	CD R200
Due pinze affilate (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Trizol	Invitrogen	15596-026	Soluzioni di isolamento dell'RNA
Microscopio
Secchiello piccolo con ghiaccio
Micropipette e puntali
Provette			Acquista senza nucleasi per ottenere i migliori risultati
Provette per PCR da 0,2 mL Polvere
di paraformaldeide	Polysciences	380
10% Triton X-100	Teknova	T1105	Diluire allo 0,2% v/v in 1X PBS
2" piastre
55mm carta da filtro	Whatman	1001-055	Bagnare con acqua e mettere in una capsula di Petri per mantenere umide le pupe
25 C incubatore
deionizzato H2O			Acquista senza nucleasi o trattare con DEPC
Sylgard 184 Kit elastomero siliconico	Dow Corning		da utilizzare per la realizzazione di tamponi di dissezione da coperchi per piastre Terizaki.
I mini vassoi MicroWell con coperchi Nunc		438733	possono essere utilizzati per realizzare tamponi di dissezione in silicone
Anticorpo anti-GFP di coniglio	MBL international corpor	PM005	anticorpo primario
Mouse anti RAT CD2	AbD seroTec	MCA154RHDL	anticorpo primario
ADL195 (anti lamina, topo)	Dev studia l'anticorpo
primario hydoma ban ADL195-sAlexa Fluor® 488 capra anti-coniglio IgG (H+L)	invitrogen	A11008	Anticorpo secondario
Cy3 capra anti-topo IgG	Jackson ImmunoResearch	115-166-003	Anticorpo secondario
Triton X-100, detergente di grado proteico, soluzione al 10%,	detergente	CALBIOCHEM	648463
Rotatore da laboratorio	Thermo scientific
Rotator Acqua priva di nucleasi	Growcells.com	NUPW-0125
Tergicristalli per tessuti leggeri	VWR	82003-822	Per forniture di dissezione per la pulizia
Superscript II	invitrogen	18064014	Trascrittasi inversa...
QIAtrituratore (50)	Estrazione dell'RNA	QIAGEN	79654
Oligo(dT)12-18 Primer	RT	life technologies	18418012
RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)Estrazione dell'RNA		QIAGEN	74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)	qPCR	Roche	04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER	qPCR	Roche	06402712001
LIGHTCYCLER 480 - PIASTRA MULTIPOZZETTO 96	qPCR	Roche	04729692001
NEBNext 2X PCR Master Mix ad alta fedeltà	qPCR	NEB	M0541S