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Articolo metodologico

Preparare lo sviluppo di tessuto periferico olfattivo per molecolare e l'analisi di Immunohistochemical in Drosophila

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DOI:

10.3791/57716

⸱

13 giugno 2018

 , 
1Department of Biology, Duke University

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per tappa e sezionare lo sviluppo di tessuto olfattivo da specie di Drosophila . Il tessuto dissecato più tardi può essere utilizzato per le analisi molecolari, quali quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) o RNA sequenziamento (RNAseq), così come in vivo analisi quali immunoistochimica o in situ ibridazione.

Abstract

Il sistema olfattivo di Drosophila è un sistema ampiamente usato in neurobiologia inerente allo sviluppo, neuroscienza sistemiche, come pure neurofisiologia, comportamento ed evoluzione del comportamento. Drosophila olfattivi tessuti casa i neuroni olfattivi (ORNs) che rilevano chimici volatili spunti oltre ai neuroni idro-termo-sensoriale. In questo protocollo, descriviamo la dissezione di sviluppare tessuto periferico olfattivo della specie Drosophila adulto. Descriviamo in primo luogo come tappa e larve di Drosophila , seguite da dissezione del disco antennale dalla prime fasi pupal, seguite da dissezione delle antenne da adulti e metà-pupal fasi di età. Mostriamo anche metodi dove preparazioni possono essere utilizzati in tecniche molecolari, come l'estrazione di RNA per qRT-PCR, RNAseq o immunohistochemistry. Questi metodi possono applicarsi anche ad altre specie di Drosophila dopo tempi di sviluppo pupale specie-specifici sono determinati, e rispettivi stadi sono calcolati per invecchiamento appropriato.

Introduzione

Il sistema olfattivo di Drosophila è un sistema ampiamente usato in neurobiologia inerente allo sviluppo, neuroscienza sistemiche, come pure neurofisiologia, studi di comportamento e comportamentali evolution1,2,3, 4. Drosophila olfattivi tessuti casa i neuroni olfattivi (ORNs) che rilevano chimici volatili spunti oltre a idro-termo-sensoriale neuroni1,5,6. L'obiettivo generale di questo manoscritto è quello di dimostrare come tappa e sezionare sviluppando pupa e adulto tessuto olfattivo nella specie di Drosophila . La spiegazione razionale per questa tecnica è quello di generare campioni da diverse fasi pupal per analisi molecolari e dello sviluppo del sistema olfattivo periferico, come RNAseq e RT-PCR quantitativa, in aggiunta al tessuto in vivo tecniche di etichettatura . Questa tecnica può essere particolarmente utile per identificare la dinamica dei profili trascrizionali in sviluppo del sistema olfattivo adulto da specie non -melanogaster della drosofila , che non hanno tutti i reagenti transgenici per cella tipo specifico etichettatura e analisi. In questo manoscritto, dimostriamo come dissezionare antennali dischi e antenne dalla specie di Drosophila pupa e adulto. In primo luogo, vi mostriamo come identificare Drosophila 0 h di formazione pupario (APF, pupe bianche o membranose) per la stadiazione inerente allo sviluppo e invecchiamento specie-specifico. Successivamente, vi mostriamo come dissezionare antennali dischi e il terzo segmento antennale; in particolare, come li dissociare dal disco di occhio e secondo segmento antennale per la purezza di tessuto necessaria per RNAseq o RT-PCR. Le fasi in d. melanogaster descritti nel presente protocollo all'incirca corrispondono al disco antennale pre-modellato (membranose), la selezione dei precursori dalle antenne a disco (8h APF), l'inizio della differenziazione terminale per ORNs (40h APF), e adulto dell'antenna. Infine, diamo esempi per una RT-PCR quantitativa da adulte Antenne isolate utilizzando il metodo e per l'immunoistochimica in vivo . Questo metodo può essere utilizzato per generare i campioni per l'analisi di RNA/DNA e immunohistochemistry sullo sviluppo di tessuti periferici olfattivi da diverse specie di Drosophila .

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Protocollo

Il seguente protocollo è coerenza con le linee guida etica stabilite dal comitato di etica di Duke University Research.

1. preparazione e messa in scena dello sviluppo di Drosophila melanogaster Pupa

  1. In primo luogo, di identificare quante mosche sarà necessarie per la dissezione. Per RT-PCR e RNAseq, raccogliere 100-200 dischi antennali e antenne da individui che sono necessari nelle fasi prepupa, 8h APF, 40h APF e adulto. Per l'immunoistochimica, sezionare individuo 10-20.
  2. Pulire tutti i materiali, compreso la dissezione pastiglie e pinze, utilizzando salviette con 70% EtOH. Se il materiale sezionato è per essere utilizzato per l'estrazione di RNA, pulire il tutto con neutralizzatori di RNAsi e fare tutte le soluzioni utilizzando uno privo di nucleasi o acqua trattata pirocarbonato dietilico (DEPC).
    Nota: Questo protocollo utilizza cuscinetti di dissezione del silicone al posto del vetro per le dissezioni. Cuscinetti in silicone sono amichevoli per forcipe ultra-fine e promuovono le dissezioni veloce e di alta qualità.
  3. Raccogliere la pupa al 0 h fase APF/prepupa.
    1. Per garantire la messa in scena più preciso, monitorare le larve a 30 min a intervalli di 1 h.
      Nota: Errante terzo instar larve in una bottiglia moderatamente affollata saranno probabilmente pupate entro poche ore.
    2. Una volta che le larve diventano immobile e sono circondate da un caso pupal colorato (quasi bianco) molto leggero, trasferirli in una piccola 2 - nella capsula di Petri con un filtro di carta umida.
    3. Continuare per 1-2 h, occasionalmente monitoraggio, identificazione e trasferimento membranose.
      Nota: In alternativa, deselezionare una bottiglia di tutte le pupe e permettere alle larve di sviluppare per 2 h. Tutte le pupe raccolti dopo 2 h sarà all'interno di una gamma APF 0 - 2 h.
  4. Immediatamente passare alla fase 3.1 dissezionare il disco antennale prepupa per la fase APF 0 h. Se la prepupa deve essere invecchiato, raccoglierle in un piatto, coprire il piatto e posizionare una pellicola di paraffina intorno ai bordi per inibire la secchezza e porre la capsula di Petri a 25 ° C.
    Nota: Le pupe possono ora essere invecchiate di sfarfallamento.
  5. Per pupe raccolti in un intervallo di 2 h, invecchi membranose per 2 h a meno che l'età desiderata al fine di garantire che le pupe non eccedenza.
  6. Utilizzare pinze ultrafine (Dumont 55) come il tessuto è molto piccolo e fragile.

2. preparazione e messa in scena dello sviluppo di Pupa da altre specie di Drosophila

  1. Per determinare la lunghezza dello sviluppo pupa in altre specie di Drosophila , posizionare i campioni ad una temperatura ottimale, registrare le date quando si osservano membranose, ordinarli in una fiala di fresca e registrare il numero di giorni da prepupa fino all'età adulta.
  2. Registrare il rapporto tra tempo per sviluppo pupa per specie non -melanogaster e per melanogaster. Moltiplicare il rapporto tra il tempo dello sviluppo per il numero di ore impiegate per la stadiazione melanogaster per ottenere il numero di ore per le specie non -melanogaster di età.

3. dissezione di d. melanogaster Pupal antennali disco

Nota: Tutti i tempi di invecchiamento e protocolli di dissezione sono descritti per Drosophila melanogaster. Per tutte le altre specie, una modifica del protocollo invecchiamento basato su punti specifici della specie tempo inerente allo sviluppo sarà richiesta, come descritto in precedenza.

  1. Per le dissezioni pupal disco antennali, raccogliere 50-100 0 - 2 h o pupe vecchio 6-8 h con una spatola e metterli su un pad di dissezione.
  2. Dispensare 150 µ l di soluzione di isolamento di RNA in una RNasi gratuito 1,5 mL microfuge utilizzando una pipetta 200-µ l del tubo e posizionare il tubo sul ghiaccio.
  3. Sezionare le pupe in 150-200 µ l di PBS 1X (tampone fosfato salino, nucleasi-free). Collocare le goccioline più di PBS (150-200 µ l per goccia) sul tappetino di dissezione.
  4. Sul pad di dissezione, collocare il 0 - h 2 o 6-8 h invecchiato pupe (una pupa per goccia) per essere sezionata in una delle goccioline di PBS 1X. Utilizzare pinze in una mano per stabilizzare il corpo.
  5. Per lo 0 - 2 h invecchiato pupe, utilizzando forcipe in altra mano, tenere premuto per la parte più anteriore (i ganci di bocca) della prepupa e tirarlo fuori per esporre i cervelli e i dischi immaginali allegati al caso pupal anteriore.
  6. Per le pupe APF 8h, prima di staccare delicatamente il caso pupal dal quartiere più anteriore della pupa, esponendo la testa all'interno del sacco di membrana che circonda il corpo.
    Nota: Il corpo, in questa fase, si presenta come una larva di degenerazione.
  7. Rimuovere la testina al giunto del collo.
    Nota: Questo assicura che i dischi antennali non andranno persi, che in questa fase sono connessi principalmente ai lobi ottica del cervello.
  8. Trasferire il tessuto con il cervello e i dischi immaginali 1x un'altra goccia di PBS utilizzando forcipe o una pipetta 20-µ l.
  9. Identificare il disco occhio-antennali collegato al cervello presso i lobi ottici. Usando il forcipe, scollegare il disco occhio-antennali dal cervello e il caso pupal. Trasferirlo in un nuovo 1 x gocciolina di PBS utilizzando forcipe o una pipetta 20-µ l.
    Nota: Il disco di occhio-antennali prepupa è un tessuto piatto. Tuttavia, dalle pupe di 8 h, i dischi di occhio sono ruotati foggiare a coppa i dischi antennali, che siede anteriore al cervello centrale.
  10. Utilizzando forcipe, tagliare il tessuto al luogo di connessione tra l'occhio e il disco antennale. Utilizzare una pipetta 20-µ l per trasferire delicatamente il tessuto dissecato nel reagente di soluzione di isolamento del RNA. Ridurre al minimo la quantità di liquido trasferito pipettando una quantità più piccola possibile.
  11. Ripetere fino a quando tutte le pupe sono stati sezionati.

4. dissezione di d. melanogaster Mid-pupa e adulto antenne

Nota: Da 40 h APF, la maggior parte della metamorfosi è completa, e le strutture adulte sono sempre evidenti, ma sono ancora bianche e indefinibile. A questo punto del tempo inerente allo sviluppo, l'antenna adulto ha preso la sua forma definitiva ma è ancora trasparente e la maggior parte dei recettori olfattivi, tranne per pochi, non hanno iniziato l'espressione.

  1. Per le dissezioni antennali pupale, raccogliere 50-100 membranose come descritto nel passaggio 1 e loro età per 40 h a 25 ° C.
  2. Dispensare 150 µ l di soluzione di isolamento di RNA in una RNasi free 1,5 mL microcentrifuga utilizzando una pipetta da 200-µ l del tubo e posizionare il tubo sul ghiaccio.
  3. Sul pad di dissezione, collocare la pupa per essere sezionato in una delle goccioline di PBS 1X. Utilizzare pinze in una mano per stabilizzare il corpo. Utilizzando forcipe in altra mano, togliere delicatamente il caso pupal dal quartiere più anteriore della pupa, esponendo la testa all'interno del sacco di membrana che circonda il corpo.
  4. Usando il forcipe, accuratamente tagliato fuori la testa dal resto del corpo pupal tenendo il corpo con un set di pinze e strappando la testa al collo congiunta con un altro set di pinze. Trasferire delicatamente la testa in un altro 1 x gocciolina di PBS usando il forcipe. Pipettare su e giù per pulire il contenuto della testa (il cervello, ecc.) per ottenere una membrana libera che utilizzate per circondare la testa di Drosophila in via di sviluppo.
    Nota: Al 40-50 h APF, le antenne sono collegate alla sezione anteriore-la maggior parte della membrana. Essi diventeranno apparenti per dissezione quando il contenuto della testa vengono cancellati con il pipettaggio.
  5. Usando il forcipe, scollegare le antenne pupale dalla membrana. Scollegare il segmento 2nd dell'antenna dal 3rd usando il forcipe per fetta al giunto segmentale, come solo il segmento 3rd ospiterà i neuroni recettori olfattivi.
  6. Utilizzare una pipetta 20-µ l per trasferire delicatamente il tessuto dissecato nel reagente di soluzione di isolamento del RNA. Ridurre al minimo la quantità di liquido trasferito pipettando una quantità più piccola possibile. Ripetere fino a quando tutte le pupe sono stati sezionati.
  7. Per adulte dissezioni antennali, raccogliere circa 50 adulti e loro età per un post-eclosion settimana.
    Nota: L'espressione di geni per recettori olfattivi e altri geni picco una settimana dopo eclosion. Gli adulti sono invecchiati per una settimana garantire biologicamente rilevanti geni con le trascrizioni di abbondanza bassa elevarsi di sopra della soglia di rilevamento.
  8. Per estrazione di RNA, sezionare mosche mentre sono ancora vivi su un pad di CO2 . Trattare il CO2 pad con inibitori della RNAsi. Per formazione immagine confocal, sezionare le mosche su un pad di dissezione in 1X PBS o PBS + 0,2% Triton.
  9. In primo luogo, mettere gli adulti a dormire sul pad CO2 stazione nell'ambito di dissezione. Sul pad CO2 stazione, utilizzando forcipe in una mano per stabilizzare il corpo, utilizzare pinze in altra mano per delicatamente tirare/pizzico fuori il terzo segmento antennale dal secondo.
  10. Trasferire le antenne in una soluzione di isolamento del RNA, usando pinze per posizionare le antenne direttamente nel liquido. Ripetere fino a quando tutti gli adulti sono stati sezionati.
    Nota: Assicurarsi che le antenne sono immersa in soluzione di isolamento del RNA. Le antenne possono diventare bloccate sul lato del tubo. Questo causerà un'aumentata degradazione del RNA, riducendo la quantità e la qualità di RNA.
  11. Direttamente procedere all'estrazione di RNA o posizionare il tubo a-80 ° C per la conservazione a lungo termine.

5. isolamento RNA da tessuti dissecati

  1. Rimuovere tutti i campioni dall'archiviazione di-80 ° C e li scongelare su ghiaccio.
  2. Brevemente spin (5-6 s, ~ 6.000 x g) ogni campione per raccogliere il materiale nella parte inferiore del tubo.
  3. Macinare ciascun campione utilizzando un motore elettrico e un pestello di plastica sterilizzati nell'autoclave per 10 s sul ghiaccio.
  4. Ripetere i passaggi da 5.2 e 5,3 4.
  5. Eseguire l'estrazione di RNA usando i kit disponibili in commercio e seguendo protocolli del produttore per una resa ottimale.
  6. Eseguire qRT-PCR utilizzando reattivi disponibili in commercio e primers specifici contro geni di interesse e seguendo protocolli del produttore.
    1. Svolgere tutte le reazioni di PCR utilizzando le seguenti condizioni: denaturazione di 95 ° C per 10 min seguiti da 40 cicli di 95 ° C per 15 s, 55 ° C per 30 s e 60 ° C per 30 s.
      Nota: Coppie di Primer per geni DIP e dpr sono elencate nella tabella 1, e gli iniettori per geni per recettori olfattivi sono elencati in Hueston CE et al. 8.

6. fissaggio dei dischi antennali Pupal e antenne per immunoistochimica

Nota: Fissare i tessuti in lotti da 10-20 individui affinché che i tessuti sono stati corretti per la stessa quantità di tempo. Ridurre al minimo la quantità di tempo che i campioni soggiorno in PBT (PBS con detergente) prima di trasferirli ad un fissativo per massimizzare l'integrità dei tessuti.

  1. Raccogliere il dissecata dischi antennali o pupale antenne in un tubo PCR 200-µ l contenente 200 µ l di 0,2% PBT sul ghiaccio per mantenere l'integrità del tessuto e per evitare il campione di attaccarsi alla parete della PCR 200-µ l tubi che porterà ad una fissazione incompleta.
    Nota: Antenne Pupal e antennali dischi possono essere difficile da vedere come sono abbastanza traslucidi. Si consiglia di utilizzare un ambito di dissezione per tutti i passaggi del lavaggio per evitare qualsiasi perdita del tessuto. In alternativa, piastre da 96 pozzetti Terasaki possono essere usato per la fissazione e colorazione per monitorare meglio il tessuto.
  2. Fissare il disco di antennale dissecata antennali campioni da pupe in circa 200 µ l di 4% PFA (paraformaldeide) per 30 min a temperatura ambiente. Per questo e i successivi passaggi, mantenere le provette con i campioni su un nutator per miscelare correttamente i campioni nella soluzione. Progressi al punto 6.7.
  3. Per l'antenna adulto, sezionare l'intera testa prima e risolvere il problema in circa 200 µ l di 4% PFA (paraformaldeide) per 1 h a temperatura ambiente.
  4. Lavare 3 volte con 200 µ l di 0,2% PBT per 10 minuti ciascuno. Mantenere i campioni sul nutator durante l'incubazione.
  5. Torna al microscopio di dissezione per una dissezione più fine del secondo segmento antennale dalle teste fisse. Usando pinze per stabilizzare la testa, delicatamente tirare/pizzico fuori il terzo segmento antennale dal secondo.
  6. Trasferire i segmenti antennali terzi dissecati in circa 200 µ l di 4% PFA (paraformaldeide) e fissarle per 30 min a temperatura ambiente.
  7. Lavare 3 volte con 200 µ l di 0,2% PBT per 10 minuti ciascuno. Mantenere i campioni sul nutator durante l'incubazione.
  8. Conservare i campioni a 4 ° C o continuare direttamente con intero Monte immunohistochemistry.
    Nota: L'efficienza di macchiatura potrebbe cambiare quando viene utilizzato l'anticorpo. Questo metodo dovrebbe essere appropriati per meno Tag proteina abbondante o più deboli di anticorpi. Tuttavia, a volte, potrebbe richiedere un'ottimizzazione del protocollo (identità o quantità di fissativo o il tempo di fissazione).

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Risultati

Il dissecata tessuto olfattivo in via di sviluppo può essere utilizzato per l'estrazione di RNA seguita da RT-PCR per valutare l'espressione genica o può essere preso attraverso protocolli di immunohistochemistry per determinare il modello di espressione e la localizzazione sub-cellulare dei geni di interesse. In questa sezione vi presentiamo i risultati rappresentativi da entrambi i protocolli. Figura 1 è la rappresentante RT-PCR quantitativa mostrando la tr...

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Discussione

Questo protocollo è una risorsa utile per i laboratori interessati a individuare i programmi genetici e trascrizionali operanti nello sviluppo di tessuto olfattivo Drosophila , nonché un'analisi comparativa di questi programmi in Drosophila specie. È particolarmente utile se il livello dei sistemi profili trascrizionali da diversi stadi di sviluppo sono necessari come primer per gli studi futuri. Il protocollo descritto qui di seguito viene illustrato come tappa e isolare lo sviluppo di tessuto olfattiv...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione della National Science Foundation di Pelin C. Volkan (DEB-1457690).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10X Soluzione salina tamponata con fosfatoGibco70011-044Diluire a 1X in acqua priva di RNasi
CO2 serbatoioAria GasCD R200
Due pinze affilate (Dumont #55)Fine Science Tools11255-20
TrizolInvitrogen15596-026Soluzioni di isolamento dell'RNA
Microscopio
Secchiello piccolo con ghiaccio
Micropipette e puntali
ProvetteAcquista senza nucleasi per ottenere i migliori risultati
Provette per PCR da 0,2 mL Polvere
di paraformaldeidePolysciences380
10% Triton X-100TeknovaT1105Diluire allo 0,2% v/v in 1X PBS
2" piastre
55mm carta da filtroWhatman1001-055Bagnare con acqua e mettere in una capsula di Petri per mantenere umide le pupe
25 C incubatore
deionizzato H2OAcquista senza nucleasi o trattare con DEPC
Sylgard 184 Kit elastomero siliconicoDow Corningda utilizzare per la realizzazione di tamponi di dissezione da coperchi per piastre Terizaki.
I mini vassoi MicroWell con coperchi Nunc438733possono essere utilizzati per realizzare tamponi di dissezione in silicone
Anticorpo anti-GFP di coniglioMBL international corporPM005anticorpo primario
Mouse anti RAT CD2AbD seroTecMCA154RHDLanticorpo primario
ADL195 (anti lamina, topo)Dev studia l'anticorpo
primario hydoma ban ADL195-sAlexa Fluor® 488 capra anti-coniglio IgG (H+L)invitrogenA11008Anticorpo secondario
Cy3 capra anti-topo IgGJackson ImmunoResearch115-166-003Anticorpo secondario
Triton X-100, detergente di grado proteico, soluzione al 10%,detergenteCALBIOCHEM648463
Rotatore da laboratorioThermo scientific
Rotator Acqua priva di nucleasiGrowcells.comNUPW-0125
Tergicristalli per tessuti leggeriVWR82003-822Per forniture di dissezione per la pulizia
Superscript IIinvitrogen18064014Trascrittasi inversa...
QIAtrituratore (50)Estrazione dell'RNAQIAGEN79654
Oligo(dT)12-18 PrimerRTlife technologies18418012
RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)Estrazione dell'RNAQIAGEN74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)qPCRRoche04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER qPCRRoche06402712001
LIGHTCYCLER 480 - PIASTRA MULTIPOZZETTO 96qPCRRoche04729692001
NEBNext 2X PCR Master Mix ad alta fedeltàqPCRNEBM0541S
da dissezioneP20 e P200 per microfuge da 1,7 mL di Petri filtrato sterile ad acqua ,

Riferimenti

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