Proteina fluorescente verde sistema di visualizzare gli effettori consegnati dai batteri durante l'infezione Split

Summary

Approcci basati sulla proteina fluorescenti per monitorare gli effettori secernuti dai batteri nelle cellule ospiti sono impegnativi. Ciò è dovuto all'incompatibilità tra proteine fluorescenti e il sistema di secrezione di tipo III. Qui, un sistema GFP superfolder ottimizzato split viene utilizzato per la visualizzazione degli effettori secernuta dai batteri nella cellula della pianta ospite.

Abstract

Batteri, uno dei più importanti agenti causativi di varie malattie delle piante, secernono una serie di proteine effettrici nella cellula ospite pianta di sovvertire il sistema immunitario di pianta. Durante l'infezione effettori citoplasmatici sono consegnati al cytosol host tramite un tipo sistema di secrezione di III (T3SS). Dopo consegna nella cellula della pianta, il effector(s) gli obiettivi i comparti specifici per modulare i processi di cellula ospitante per la sopravvivenza e la replica dell'agente patogeno. Anche se ci sono state alcune ricerche sulla localizzazione subcellulare delle proteine effettrici nelle cellule ospiti per capire la loro funzione nella patogenicità utilizzando proteine fluorescenti, studio della dinamica degli effettori iniettati direttamente da batteri è stato impegnativo a causa di incompatibilità tra la T3SS e proteine fluorescenti.

Qui, descriviamo il nostro metodo recente di un sistema di proteina fluorescente verde superfolder di Spalato ottimizzato (sfGFP^OPT) per visualizzare la localizzazione di effettori tramito il T3SS batterica nella cellula ospite. Il sfGFP11 (^th 11 β-filo di sfGFP)-taggati effettrici secernuta attraverso la T3SS possono essere assemblato con un organello specifici mirato sfGFP1-10^OPT (1-10^th . β-filo di sfGFP) leader per l'emissione di fluorescenza nel sito. Questo protocollo fornisce una procedura per visualizzare il segnale di fluorescenza sfGFP ricostituito con una proteina da Pseudomonas syringae in un organello particolare nelle piante di Arabidopsis e Nicotiana benthamiana .

Introduction

Le piante sono organismi sessili che incontrano numerosi agenti patogeni d'invasione, inclusi batteri, funghi, virus, insetti e nematodi durante il loro ciclo di vita. Tra i fitopatogeni, i batteri patogeni Gram-negativi come Pseudomonas spp e Ralstonia spp., infettare le loro piante ospiti inserendo attraverso ferite o aperture naturali, come gli stomi e Idatodi¹. Per colonizzare con successo piante ospiti, batteri patogeni si sono evolute per sviluppare una varietà di fattori di virulenza². Quando i batteri invadono una pianta ospite, iniettano una serie di proteine di virulenza — conosciuto come effe....

Protocol

Nota: Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente, se non diversamente specificato.

1. preparazione dei materiali vegetali (4 settimane)

1. Preparazione per le piante di benthamiana N.
   1. Seminare i 2 semi di N. benthamiana sulla superficie del suolo di ogni piatto, coprire il vassoio con una cupola di plastica e consentire semi di germinare in a 25 ° C, 60% camera di crescita di umidità con un ciclo di 16/8-h chiaro/scuro fotoperiodo.
   2. Dopo due settimane, è possibile scegliere e scartare il più piccolo semenzale in ogni pentola e continuare a coltivare le piante sotto le stesse condizion....

Results

La struttura del β-barilotto della GFP è composta da undici filamenti β e può essere diviso in due frammenti, il filo di^th di 1-10 (GFP1-10^OPT) e il filo di^th (GFP11) 11. Anche se nessuno dei due frammenti fluorescenti da soli, sfGFP auto-assemblati è in grado di emettere fluorescenza quando i due frammenti presenti nelle immediate vicinanze (Figura 1A). In questo sistema, sfGFP1-10^OPT-esprimendo di Arabidopsis<.......

Discussion

Il protocollo descritto qui è utilizzato per il monitoraggio la localizzazione esatta delle proteine effettrici iniettato dal T3SS batterica nella cellula ospite pianta al momento dell'infezione. In precedenza, il sistema GFP Spalato è stato utilizzato come strumento per studiare la localizzazione subcellulare delle proteine di mammifero^23,36, Salmonella T3E localizzazione e Agrobacterium VirE2 consegna attraverso il T4SS nella impianto di cellu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidopsis linee transgeniche			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, SP Monitoraggio spaziotemporale degli effettori di Pseudomonas syringae tramite secrezione di tipo III utilizzando frammenti proteici fluorescenti divisi. Cellula vegetale. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	ABRC	CS69831
NU-sfGFP1-10	ABRC	CS69832
PT-sfGFP1-10	ABRC	CS69833
MT-sfGFP1-10	ABRC	CS69834
PX-sfGFP1-10	ABRC	CS69835
ER-sfGFP1-10	ABRC	CS69836
GO-sfGFP1-10	ABRC	CS69837
PM-sfGFP1-10	ABRC	CS69838
Plasmide sfGFP1-10OPT mirato agli organelli			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, SP Monitoraggio spaziotemporale degli effettori di Pseudomonas syringae tramite secrezione di tipo III utilizzando frammenti proteici fluorescenti divisi. Cellula vegetale. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	Addgene	97387
NU-sfGFP1-10	Addgene	97388
PT-sfGFP1-10	Addgene	97389
MT-sfGFP1-10	Addgene	97390
PX-sfGFP1-10	Addgene	97391
ER-sfGFP1-10	Addgene	97392
GO-sfGFP1-10	Addgene	97393
PM-sfGFP1-10	Addgene	97394
ER-sfCherry1-10	Addgene	97403
ER-sfYFP1-10	Addgene	97404
CYTO-sfCFP1-10	Addgene	97405
sfGFP11-taged Vettore compatibile con gateway per il sistema di rilascio dell'effettore basato su T3SS	Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, SP Monitoraggio spaziotemporale degli effettori di Pseudomonas syringae tramite secrezione di tipo III utilizzando frammenti proteici fluorescenti divisi. Cellula vegetale. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2	Addgene	98250	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla kanamicina (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4	Addgene	98251	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla kanamicina (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2	Addgene	98252	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla kanamicina (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4	Addgene	98253	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla kanamicina (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2	Addgene	98254	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla gentamicina (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4	Addgene	98255	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla gentamicina (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2	Addgene	98256	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla gentamicina (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4	Addgene	98257	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla gentamicina (25 ug/ml)
ceppi batterici
Agrobacterium tumefaciens GV3101			Csaba Koncz e Jeff Schell, Il promotore del gene TL-DNA 5 controlla l'espressione tessuto-specifica dei geni chimerici trasportati da un nuovo tipo di vettore binario Agrobacterium. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistente alla gentamicina (50 ug/ml) e alla rifampicina (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500			Kvitko, B. H. et al. Le delezioni nel repertorio dei geni effettori di secrezione di tipo III DC3000 del pomodoro pv. di Pseudomonas syringae rivelano una sovrapposizione funzionale tra gli effettori. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistente alla rifampicina (100 ug/ml)
Componenti del supporto
Terreno di germinazione delle piante			Aggiungere 2.165g/L Murashige & Skoog in polvere, 10 g/L di saccarosio in acqua. Portare a pH 5,8 e aggiungere 2,2 g/L di phytagel. Autocalve.
Murashige & Skoog medium con vitamine	Duchefa Biochemie	M0222	Conservare a 4 °C.
Saccarosio	Duchefa Biochemie	S0809
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169<
strong>LB media			Aggiungere 10 g/L di triptone, 5 g/L di estratto di lievito, 10 g/L di NaCl all'acqua. Per i terreni solidi, aggiungere 15 g/L di micro agar. Autoclave. Lasciare raffreddare la soluzione a 55 gradi C, e aggiungere antibiotico se necessario.
Tryptone	BD Bioscience	211705
Estratto di lievito	BD Bioscience	212750
NaCl	Duchefa Biochemie	S0520
Micro agar	Duchefa Biochemie	M1002
King's B media			10 g/L di proteasi peptone #2, 1,5 g/L di K2HPO4, 15 g/L di agar in acqua. Autoclave. Raffreddare a 55 gradi C e aggiungere al terreno 15 ml/L di glicerolo sterile, 5 ml/L di MgSO4. Aggiungi antibiotici se necessario.
Proteoso peptone	BD Bioscience	212120
Anidro K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128 USP
Glicerolo	Duchefa Biochemie	G1345
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Bacto Agar	BD Bioscience	214010
Mezzi liquidi di mannitolo-glutammato (MG)			Aggiungere 10 g/L di mannitolo, 2 g/L di acido L-glutammico, 0,5 g/L di KH2PO4, 0,2 g/L di NaCl e 0,2 g/L di MgSO4 all'acqua. Regolare a pH 7
Mannitolo	Duchefa Biochemie	M0803
Acido L-glutammico	Duchefa Biochemie	G0707
KH2PO4	Sigma-Aldrich	NIST200B
Tampone			10 mM MES (acido 2-(N-morfolino)-etano solfonico), 10 mM MgCl2, 150 &; M acetosiringone. pH 5,6; Preparare un nuovo tampone prima dell'uso.
MES	Duchefa Biochemie	M1503	Preparare 100 mM (pH 5,6) di brodo in acqua. Filtro sterilizzare.
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Preparare 100 mM di stock in acqua. Autoclave.
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406	Preparare 150 mM di stock in DMSO.
Microscopio confocale attrezzature/materiali
confocale a scansione laser 710	Carl Zeiss
Axio observer Z1 microscopio invertito	Carl Zeiss
propidio	ThermoFisher	P1304MP